专利名称：一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，尤其涉及一种利用重组大肠杆 菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。属于基因工程和微生物发酵领域。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酉旨(Polyhydroxyalkanoat,简称PHA)，是由微生物合成的功能性生物聚 酯。PHA具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及 由官能团引起的其它特殊性能。PHA的性质决定了它具有可作为生物可降解塑料、组织 工程的支架材料等许多潜在的应用，因此，国内外都对其进行了大量的基础和应用开发 研究。聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate, PHB)是PHA家族中最简单，也是研究得 最多、最透彻的成员。PHB在细胞内呈颗粒状，分子量一般为106 (随培养条件，抽提 方法不同而变化)，熔点为18'C,具有高结晶性、光学活性和压电性质，是立体规整的聚 合物。
PHB的合成途径已经比较清楚。以葡萄糖为原料，可以通过乙酰辅酶A縮合形成 聚合物的前体物酰基辅酶A，然后在聚合酶的作用下合成PHB。但是由于原料成本较高， PHB的工业生产仍然受到限制。目前，市场上PHB的价格大约为20美元/千克，为普 通石化塑料的10倍，因此，PHB还无法与石化塑料相竞争。随着石油价格的上涨及环 境污染的问题的凸显，生物发酵生产PHB代替化学合成塑料的趋势越来越明显。
大肠杆菌作为一模式原核微生物，由于其遗传背景清楚、易培养、生长快及易操作 性，已广泛应用于基因工程及化工原料合成代谢途径的构建中。大宗生化原料如氨基酸、 有机酸等已经通过大肠杆菌中得以生产。在工业化大规模发酵生产PHB的过程中，除 了降低发酵底物价格、能源消耗及提取消耗外，发酵过程中昂贵诱导剂的添加也是一个 难于解决的问题。
目前，用于基因的表达系统，常见的有阿拉伯糖诱导型表达系统Pbad; IPTG (异 丙基-P-D-硫代半乳糖苷)诱导型表达系统，如PLAC、 Ptrc、 Ptac、 Pl、 Pr和PT7。然 而，这些常见的表达系统存在着很大的缺陷，即只能用于实验研究水平，在大工业生产 中很难得到利用。阿拉伯糖诱导型表达系统在添加阿拉伯糖的条件下诱导表达，但该表 达系统依赖于阿拉伯糖的浓度。由于大肠杆菌存在利用阿拉伯糖的酶系，所以应用过程 中，必须持续的添加阿拉伯糖来维持目的基因的充分表达。IPTG诱导型表达系统的应 用远远广于阿拉伯糖诱导型表达系统，但该系统也存在着缺陷。IPTG本身对菌体有毒 害作用，实验己证明IPTG抑制菌体的生长，所以在培养菌体过程中，何时添加IPTG 诱导表达目的基因难以确定。同时，IPTG本身有比较昂贵，同样限制了该诱导表达系 统在大工业生产中的利用。基于上面表达系统的缺陷，科研工作者开发出了温度诱导型 表达系统和pH诱导型表达系统，即分别通过调节温度和pH来调控基因的表达。虽然 这些表达系统具有应用前景，但是由于调节过程较为复杂，所以也限制了在实际生产中 的应用。因此，利用合适的诱导系统来发酵生产PHB对于解决目前PHB生产成本过高 的问题具有非常重要的意义。
发明内容
针对目前PHA发酵过程中代谢过程关键酶的诱导产生问题，本发明提供一种利用 重组大肠杆菌通过环境诱导发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。具体以发酵生产 PHB为例来阐述利用重组大肠杆菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。
本发明选择大肠杆菌作为基因工程改造的对象菌株，所用大肠杆菌菌株为大肠杆菌 MG1655、 JM109、 DH5a、 W3110或Xll-blue中的一株。其中MG1655、 JM109和W3110 购买于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5a与Xll-blue购买于DSMZ(德国微生物保 藏中心)。真养产碱杆菌04/ca/ig^ey w/ra; /n^)购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管 理中心)。月巴大产减杆菌(^4/(^//§^"^/a/"附)、自养黄杆菌(^"aw/7 o6a"er tn^o^"op/n.ci^)、 巨 大芽孢杆菌(5""7/w weg"/er/"w)和恶臭假单胞菌CPww^;w "ay /w"fo)购买于ATCC(美 国典型菌种保藏中心)。
本发明所述利用重组大肠杆菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，由下述步骤 实现(具体以发酵生产PHA家族成员中的PHB为例来阐述)
l.环境诱导型表达质粒的构建
基本方法是以大肠杆菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue基因组为模 板，通过设计引物PCR体外扩增环境诱导片段并将其命名为EPI;将EPI作为启动子插 入到质粒pBluescript S、pUC19、 pUC18、 pCL1920或pTrc99A中，取代原来的启动 子序列，获得重组环境诱导型表达质粒。 (I )环境胁迫诱导(简称为EPI)片断克隆
根据GenBank上公布大肠杆菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue的基 因组序列，设计引物
pEPI primer 1: 5'- AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3' pEPI primer 2: 5 '-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3'
以大肠杆菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue的基因组为模板，利用 PCR (聚合酶链式反应M本外扩增环境胁迫诱导型启动子序列片断，命名为EPI，该环境 诱导片段含有Prp。s及Prp。s下游的受DsrA调控的序列。
通过电泳检测目的条带的大小。引物中下划线部分为相应的酶切位点，前引物中为 Ac/酶切位点，后者为Swa/酶切位点。
(n )环境诱导型表达质粒的构建
将环境胁迫诱导片断EPI与克隆载体pBluescript SIC、 pUC19、 pUC18、 pCL1920 或pTrc99A，利用Ac/和Sma/核酸内切酶进行双酶切消化。Ac/酶切反应温度为37°C， Swa/酶切反应温度为30°C。然后利用PCR产物回收试剂盒(购自OMEGA)回收纯化 酶切的片段。将酶切片断利用T4连接酶(购买于MBI)连接。连接反应在16 25'C下进 行，反应体系为5-15pl。经连接后得到重组的环境诱导型表达质粒。
进一步的优选方式，EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK—中的Ac/酶切位点 与5Vwa/酶切位点之间，获得重组环境诱导型表达质粒，命名为pEPI。 (III)环境诱导型表达质粒的扩增
挑取LB平板中的大肠杆菌，培养过夜；将培养过夜的大肠杆菌DH5a按照1%的 接种量转入装有50 ml LB的300ml的三角瓶中培养，于30 37°C、 180 250转/分钟 下培养至OD6oo为0.3 0.5。停止培养，置冰上20 30分钟，4°C， 4000 5000转/分 钟，离心10-20分钟，弃上清，加入冰冷的O.05 0.3mol/L CaCl2溶液悬浮，冰上静置 30 60分钟。离心浓縮，获得感受态细胞。放于-7(TC保存。
将含有重组环境诱导型表达质粒pEPI的连接液加入50 lOOpl的DH5oc感受态细胞 中，混匀；置冰上30 40分钟；42。C热激，冰上静置2分钟，加入90(^1的LB培养 基，30 37'C， 100转/分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量百分比为1.5 2.0% 的琼脂并加有终浓度为50 150微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，30 37'C条件下，静置培养12 16小时，调取单菌落筛选转化子。即将单菌落挑取转入LB 液体培养基中，30 37°C， 180 250转/分钟下培养过夜(培养基中添加氨苄青霉素至 终浓度为50 150微克/毫升)。离心菌体，利用质粒提取试剂盒(购买于TIAN GEN公 司)提取重组质粒pEPI，并验证质粒的正确性。
所述质粒pBluescript SK-、 pUC19、 pUC18购自Fermentas公司，pCL1920购自德 国微生物保藏中心，pTrc99A购自美国典型菌种保藏中心。
2. PHB表达重组质粒的构建
基本方法是将来源于真养产碱杆菌04/^//^"^ wfro; /H^ )、肥大产碱杆菌 (v4/cfl//ge"ey /"to)、 自养黄杆菌(Jf朋^zo6o!"er做to的/ /n'ciw)、 巨大芽孢杆菌(5鎖7/z^ megafen'i^)或恶臭假单胞菌(尸"wcfowo"o pw"A)的PHB合成酶基因pMC4S克隆至环 境诱导型表达质粒中，获得PHB表达重组质粒。
上述PHB合成酶基因；^6CAS的来源菌株优选真养产碱杆菌Ol e^ra/7/m力。
根据Genbank公布的真养产碱杆菌的基因组序列，设计引物如下
PHB primer<formula>formula see original document page 6</formula>PHB primer <formula>formula see original document page 6</formula>-3'
以真养产碱杆菌的基因组序列为模板，PCR体外扩增pM;C45基因簇。
将上述PCR所得到的； ^C4B片段和重组质粒利用Sw"/和进行双酶切处 理，反应条件为五coi /于37。C下，Sma/于3(TC下进行。酶切时间为12h-16h。将酶 切反应液利用PCR产物回收试剂盒回收纯化。然后利用T4连接酶连接，反应温度为 16°C-22°C， 16h。从而获得表达户/76C4B的重组质粒。
所述PHB合成酶基因/7M)C4B为来源于真养产碱杆菌的PHB合成过程中的三个关 键酶基因酮基硫酯酶(p^S)，羟基丁酰CoA脱氢酶(pM^)及PHB聚合酶(p/76C)。
进一步的优选方式，pW)C4S片段和重组质粒pEPI利用Swa/和五coi /进行双酶切 处理，然后利用T4连接酶连接，获得表达/;M)C4万的重组质粒pEPI-/7Z)C45。
3. 产PHB重组大肠杆菌的构建及p秘C4S表达重组质粒的扩增
基本方法是将含有表达C45重组质粒的连接液转化大肠杆菌MG1655、 JM109、 W3110、 DH5a或XLl-blue，通过氨苄青霉素抗性平板筛选产PHB重组大肠杆菌。
进一步的优选方式，将含有表达户/^C4B重组质粒pEPI-户MC45的连接液转化大肠杆菌DH5a，获得产PHB的重组大肠杆菌DH5a/pEPI-p/^C45。 (4).发酵重组大肠杆菌生产PHB并检测
发酵重组大肠杆菌的发酵条件为温度设为30 4(TC，摇床转速设为150 300转/ 分，发酵时间36h 72h;
发酵培养基组成为Na2HP04 6g/L 、KH2P04 3g/L、NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、 酵母浸出物 2g/L 4g/L、 MgS04 2mmol/L、 CaCl2 0.1mmol/L、葡萄糖 10g/L 30g/L。
挑取LB平板中筛选后的产PHB重组大肠杆菌，在无菌条件下用接种环接1 2环 于20 100 ml并加有终浓度为50 150微克/毫升的氨苄青霉素的发酵培养基中，30 4(TC条件下，150 300转/分钟摇床振荡培养8 16小时，制得种子液；以1% 5%的 接种量转接入装有100 400ml培养基的1000ml三角瓶中。发酵条件为30 40。C，150 300转/分钟。发酵36 72小时，每间隔4小时取样。
进一步的优选方式，发酵重组大肠杆菌的发酵条件为温度设为37'C，摇床转速设 为250转/分，发酵时间44h 48h。发酵培养基组成为Na2HP04 6g/L 、 KH2P04 3g/L、 NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、酵母浸出物 2g/L、MgS04 2mmol/L、CaCl2 O,lmmol/L、 葡萄糖20g/L。
PHB发酵检测
收集细胞:将所取的发酵液样品在4,000 5,000转/分钟的转速下离心10 30分钟， 收集沉淀细胞，使用蒸熘水洗涤细胞2 3次后，4，000 5,000转/分钟离心10 30分钟 收集细胞，烘干后称其干重。
将所得的干菌体，加入150微升的98%硫酸，沸水浴中加热60-90分钟，然后利用 15M的氨水调节pH至2.2 2.6，经微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)检测PHB含
量。检测条件为分析柱C18; 1%。的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外波长为210nm。
本发明通过分析分析五.co//中环境压力应答基因的转录调控机制，首次利用基因工 程技术成功构建了环境诱导型表达系统用于PHB的发酵生产。实现了在环境胁迫条件 下大肠杆菌自发调控j^KMB基因的表达，积累PHB的过程。发酵结果表明，在不添 加任何人工诱导剂的条件下，重组大肠杆菌DH5a/pEPI-j^6C4S PHB含量高达到细胞干 重的85.7%。本发明不仅解决了以往诱导剂添加问题，同时获得了 PHB的高效率发酵菌 株，从而大大降低了 PHB发酵生产的成本，为PHB的大工业发酵生产找到了新的方法， 该方法具有极为重要的广泛的应用前景。
图1为本发明构建的环境胁迫诱导型质粒pEPI的酶切图谱。
图2为本发明构建的； /^C4jB表达质粒pEPI-;^6c45的酶切图谱。
图3为本发明所构建的重组大肠杆菌DH5a/pEPI-pMC4B的荧光显微照片。
图4为重组大肠杆菌DH5a/pEPI-/^Z>C^发酵结果(A)与对照组DH5a/pBluescript
SK-phbCAB发酵结果(B)的比较，其中对照组添加需要添加IPTG诱导;^6c4b基因
的表达，而DH5a/pEPI-; /^C45不添加任何诱导剂。
具体实施例方式
实施例1、环境诱导型表达质粒的构建
1. 大肠杆菌MG1655基因组的提取
根据细菌基因组提取试剂盒说明提取大肠杆菌MG1655的基因组，并通过琼脂糖 电泳检测。琼脂糖浓度为质量百分比0.8%。
2. 环境诱导型片断(EPI)的克隆
根据GenBank上公布大肠杆菌的基因组序列(2865574-2866200),设计引物 pEPI primer 1: 5'- AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA-3'与 pEPI primer 2: 5 '-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3'
以所提取的大肠杆菌MG1655的基因组为模板，利用PCR (聚合酶链式反应)体外 扩增环境诱导型片断序列。 PCR反应体系如下(引物浓度为20pmol/L) 10x缓冲液 5u1; 25mmol/L MgCl2 4pl;
10mmol/L 四种dNTP混合液1^1;
上下游引物各 1(u1; TaqDNA聚合酶 0.5|al; 模板DNAlpl，加水补至50pl;
PCR反应条件9 7°C预变性10分钟，9fC变性60秒，58。C退火30秒，72'C延伸60 秒,30个循环后72i:延伸10分钟，4'C保存。电泳检测片段的大小。琼脂糖浓度为0.8%。
引物中下划线部分为相应的酶切位点，前引物中为Ac/酶切位点，后者为Swa/酶
切位点。
3. 环境胁迫诱导型表达质粒的构建
(1) 酶切反应
将环境诱导型片断与pBluescript SK—利用pscl和Swa/核酸内切酶进行双酶切消 化。Ac/酶切反应温度为3 7°C， Swa/酶切反应温度为30°C。然后利用PCR产物回收 试剂盒(购自OMEGA公司)回收纯化酶切的片段。
(2) 连接反应
利用T4连接酶(购买于MBI公司)连接，反应组成体系为 环境诱导型片断6u1 pBluescript SIC片断2|il
连接液缓冲液(10X): 1u1 T4连接酶1u1
连接反应在22。C下进行，反应时间为4小时，反应体系为10|al。经连接后得到重 组环境诱导型表达质粒pEPI。
(3) 感受态细胞的制备
挑取LB平板中的大肠杆菌DH5a,培养过夜；将培养过夜的大肠杆菌DH5a按照1% 的接种量转入装有50mlLB的300ml的三角瓶中培养，于37。C、 225转/分钟下培养至 OD6。o为0.4。停止培养，置冰上20分钟，(C， 4000转/分钟，离心10分钟，弃上清， 加入冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30分钟。离心浓縮。获得感受态细 胞。放于-70'C保存。
(4)重组环境诱导型表达质粒pEPI的验证扩增
将含有重组质粒pEPI的10pl的连接液加入100^1的DH5a感受态细胞中，混匀； 置冰上30分钟；42。C热激，冰上静置2分钟，加入900pl的LB培养基，3 7°C, 100转 /分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量体积比为1.5%的琼脂并加有终浓度为 100微克/毫升的氨苄青霉素的固体LB培养基平板上，37'C条件下，静置培养16小时， 挑取单菌落筛选转化子。
将单菌落挑取转入含有100微克/毫升的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C， 225 转/分钟下培养过夜。利用质粒试剂盒提取重组质粒pEPI，验证质粒的大小。
重组质粒图谱见图1。 实施例2、 PHB重组表达质粒的构建
PHB重组大肠杆菌的构建
将PHB合成酶基因/7/^C4S插入到重组质粒pEPI的多克隆位点处，构建PHB合成
酶表达重组质粒，命名为pEPI卞/^C4B。将所构建的PHB合成酶表达重组质粒转入大
肠杆菌，培养检测PHB在该环境诱导表达系统调控下积累。
(1) PHB重组质粒pEPI卞/z6C45的构建
根据Genbank公布的真养产碱杆菌的基因组序列，设计引物如下 PHB primer 1: 5'-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3' PHB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3' 以以真养产碱杆菌的基因组序列为模板为模板，PCR体外扩增;^6C4S基因簇。 将上述PCR所得到的pM)C4S片段和质粒pEPI利用5V^/(30。C)和五coi /(37。C)进
行双酶切消化，反应时间为16h,然后利用PCR产物回收试剂盒(购买于OMEGA公司)
回收纯化。利用T4连接酶连接，反应组成体系为 phbCAB基因片段6^1 pEPI片断2nl
连接液缓冲液(10X): l)Lll T4连接酶1^1
连接反应在22。C下进行，反应时间为4小时，反应体系为10^1。经连接后得到批 HB重组表达质粒pEPI-/ /^C45，该重组质粒pEPI-;^6C4S存于连接液中。
所述PHB合成酶基因p/zKMS为来源于真养产碱杆菌的PHB合成过程中的三个关键 酶基因酮基硫酯酶(pM万)，羟基丁酰CoA脱氢酶(p/z^4)及PHB聚合酶(pMQ。
实施例3、 PHB重组大肠杆菌的构建
将含有重组环境诱导型表达质粒pEPI的连接液加入lOOpl的DH5a感受态细胞中， 混匀；置冰上30分钟；42X:热激，冰上静置2分钟，加入卯O[il的LB培养基，37°C， 100转/分钟，培养1小时。将转化液涂布于含有质量体积比为质量体积比为2.0%的琼 脂并加有终浓度为100微克/毫升的氨节青霉素的固体LB培养基平板上，37t:条件下， 静置培养16小时，调取单菌落筛选转化子。即将单菌落挑取转入LB液体培养基中，37°C ， 225转/分钟下培养过夜(培养基中添加氨苄青霉素至终浓度为100微克/毫升)。离心菌 体，利用质粒提取试剂盒(购买于TIAN GEN公司)提取重组质粒pEPI，并验证质粒的 正确性。含有pEPI-p/^C^重组质粒的大肠杆菌DH5a命名为DH5a/pEPI-/ /^C45。
重组质粒pEPI-;;/^C4S酶切图谱见图2。
实施例4、 PHB重组大肠杆菌DH5a/pEPI-/;/^C45的发酵及检测
培养基发酵培养基
Na2HP04 6g/L KH2P04 3g/L NaCl 0.5g/L NH4C1 lg/L 酵母浸出物 2g/L MgS042mmol/L CaCl2 O.lmmol/L 葡萄糖 20g/L 。
挑取LB平板中的PHB重组大肠杆菌DH5a/pEPI-/7/^ClS,在无菌条件下用接种环 接1环于50 ml并加有终浓度为100微克/毫升的氨苄青霉素的M9加富培养基中(添加 2%的葡萄糖)，37'C条件下，250转/分钟摇床振荡培养12小时，制得种子液；以2%的 接种量转接入装有200ml培养基的1000ml三角瓶中。发酵条件为37。C， 250转/分钟。 其中对照组为重组大肠杆菌DH5a/pBluescript SK—-—6C4&对照组培养至12h，向发酵液 中加入IPTG至IPTG终浓度达为0.4毫摩尔/升。发酵时间为48小时，每间隔4小时取 样。
所述质粒pBluescript SK-卞/^C4S为带有pMC4B基因的pBluescript SIC质粒，通过 IPTG的诱导而表达。构建所用引物为PHB primer 1与PHB primer 2。
PHB发酵检测
收集细胞将所取的发酵液样品在4,000转/分钟的转速下离心20分钟，收集沉淀 细胞，使用蒸馏水洗涤细胞2次后，4,000转/分钟离心20分钟收集细胞，烘干后称其干 重。
PHB检测将所得的干菌体，加入150微升的浓硫酸沸水浴中加热60分钟，然后 利用15y。的氨水调节pH至2.5，经微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)检测PHB含 量。检测条件为分析柱C18; 1%。的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外波长为210nm。 检测结果见图4。
通过荧光显微照片图3可以看出,重组大肠杆菌DH5a/pEPI-;^6C4i5细胞内的明显 的PHB颗粒。
通过图4可以看出，重组大肠杆菌DH5a/pEPI-; ^C^在不添加任何诱导剂的条件 下可以以廉价的葡萄糖为底物发酵生产PHB， PHB含量达到85.7%。而对照组 DH5a/pBluescript SK.-;7^C45在添加IPTG为诱导剂的条件下，PHB含量为45%。结果 表明该表达系统可以高效的用于PHB的非人工诱导型发酵生产。
因此，利用该表达系统发酵生产PHB的方法在实际大工业发酵生产中具有巨大的 应用前景。
权利要求
1.一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其步骤包括 (1)一种环境诱导型表达质粒的构建； (2)聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建； (3)获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌； (4)发酵重组大肠杆菌生产聚羟基脂肪酸酯并检测；其特征是步骤(1)所述环境诱导型表达质粒的构建方法是以大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue基因组为模板，通过设计引物PCR体外扩增环境诱导片段并将其命名为EPI；将EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK-、pUC19、pUC18、pCL1920或pTrc99A中，取代原来的启动子序列，获得重组环境诱导型表达质粒；步骤(2)所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒的构建的方法是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes．latus)、自养黄杆菌(Xanthobacterautotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus.megaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas.putida)的聚羟基脂肪酸酯合成酶基因phbCAB克隆至环境诱导型表达质粒中，获得聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒；步骤(3)所述获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌的方法是将聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌MG1655、JM109、W3110、DH5α或XL1-blue，获得产聚羟基脂肪酸酯的重组大肠杆菌；步骤(4)所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间36h～72h；发酵培养基组成为Na2HPO4 6g/L、KH2PO4 3g/L、NaCl 0.5g/L、 NH4Cl 1g/L、酵母浸出物2g/L～4g/L、MgSO4 2mmol/L、CaCl2 0.1mmol/L、葡萄糖10g/L～30g/L。
2. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤 (1)所述环境诱导片段含有Prp。s及Prp。s下游的受DsrA调控的序列。
3. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤(1)所述模板是大肠杆菌MG1655或W3110的基因组;体外扩增环境诱导片断的引物是 pEPI primer 1: 5'-AATACATGTCCATACGCGCTGAACGTTGGTCA陽3' pEPI primer 2: 5'-ATACCCGGGAAGGTGGCTCCTACCCGTGATCCCT-3'。
4. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤(1) 所述EPI作为启动子插入到质粒pBluescript SK—中的Ac/酶切位点与Swa/酶切位 点之间，获得重组环境诱导型表达质粒，命名为pEPI。
5. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤(2) 所述聚羟基脂肪酸酯合成酶基因pMC45的来源菌株是真养产碱杆菌(A ew加/ /2—。
6. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤(2) 所述获得的聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒是pEPI-如6C4仏
7. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤(3) 所述聚羟基脂肪酸酯表达重组质粒转化大肠杆菌DH5a，获得产聚羟基脂肪酸酯的 重组大肠杆菌DH5a/pEPI-p/^C45。
8. 根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤(4) 所述发酵重组大肠杆菌的发酵条件为温度设为37'C，摇床转速设为250转/分，发 酵时间44h 48h。
9.根据权利要求1所述利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯的方法，其特征是步骤 (4)所述发酵培养基组成为Na2HP04 6g/L 、 KH2PQ4 3g/L、 NaCl 0.5g/L、 NH4C1 lg/L、酵母浸出物 2g/L、 MgS04 2mmol/L、 CaCl2 O.lmmol/L、葡萄糖 20g/L。
全文摘要
本发明公开了一种利用工程菌株生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，是通过构建环境诱导型表达质粒表达PHB合成酶基因phbCAB，在不添加任何诱导剂的条件下，phbCAB基因通过环境胁迫等外界条件的诱导而表达，从而催化聚羟基脂肪酸酯(PHA)的合成。发酵结果表明，在不添加任何人工诱导剂的条件下，重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB PHB含量高达到细胞干重的85.7％。本发明中重组大肠杆菌DH5α/pEPI-phbCAB具有重要的应用前景和价值。
文档编号C12N1/21GK101363034SQ20081013888
公开日2009年2月11日 申请日期2008年8月8日 优先权日2008年8月8日
发明者振 康, 祁庆生 申请人:山东大学