专利名称：利用重组大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用重组大肠杆菌联 产琥珀酸和聚(3羟基丁酸酯(PHB)的方法。
背景技术：
琥珀酸,学名丁二酸，是一种具有重要应用价值的四碳二羧酸，作为前体被广泛用 于合成药品及生物可降解性聚合物。由于环境问题，许多研究已经转向于微生物发酵来 生产琥珀酸。以可再生资源为原料的琥珀酸发酵法将逐步取代传统的化学合成法，通过 代谢工程提高微生物琥珀酸的产量、降低琥珀酸发酵成本具有巨大的应用潜力。同时也 存在着挑战，即构建以多种可再生碳源为底物的、易培养的、高转化效率、高产量的琥 珀酸发酵菌株。目前，研究较多地菌株主要有产琥珀酸厌氧螺菌04朋m^/cw;7/n7/"m ■racc/mjwoc/wcera), 产琥珀酸方文线杆菌(^4c"'"o6(3c飾s racc细ge"e力禾口大肠杆菌 (Z :/zen'c/n'a co//)等菌禾中。
大肠杆菌作为生产工业产物的宿主由于其遗传背景清楚、易操作、生长速率快、易 培养及可利用多种碳源，而受到越来越多的重视。正是基于这些原因，大肠杆菌被认为 是最有潜力生产琥珀酸的宿主。许多代谢工程策略己经用于提高大肠杆菌琥珀酸的产 量。基因工程与发酵工艺的结合使得大肠杆菌大规模发酵琥珀酸成为可能。与A wcc,'m'dpro^ce似等其它微生物相比，大肠杆菌具有明显的优势。通过代谢工程的方法 在大肠杆菌中生产琥珀酸已经实现。利用大肠杆菌好氧发酵琥珀酸的产量达到60 g/L以 上。但是琥珀酸发酵过程中，大量的菌体离心后扔掉，得不到利用。
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates， PHAs)是细菌体内一种酯类的累积物，主 要被用来作为碳源和能源的储备物。聚P羟基丁酸酯(PHB)是PHA的典型代表，它 是一类新型的天然高分子材料，已经应用于环保、医药领域。PHB有良好的生物降解性, 其分解产物可全部为生物利用，对环境无任何污染，其熔融温度为175 18(TC,是一种 可完全分解的热塑性塑料，由于良好的生物降解性、生物相容性、压电效应、光学活性 等特点，PHB必将在环保、医药、光学材料领域发挥更重要的作用。
自然界中积累PHB的菌株主要有真养产碱杆菌04/^//^""^"0/^1 )、巨大芽孢杆 菌(5ctc/〃jw附ega^ehw附)、自养黄杆菌(XaW/w5a"er awfofrap/z/ct^)。其中真养产碱杆菌 已被用于商业生产PHB。然而PHB自然产生菌存在诸多的不利条件，如PHB颗粒不易 提取，发酵周期长等。
大肠杆菌(￡.CO 作为一种模式生物，同时由于其诸多的优点如易培养、碳源 利用范围广、生长速率快、易破碎、背景清楚等因而受到越来越多的研究。大肠杆菌本 身不存在PHB合成途径，但通过基因工程可以将PHB合成途径构建在大肠杆菌内。为 了降低成本，科学家们在改变细菌遗传结构上下了许多工夫,制造了新型聚合物，提高了 产量，成本也明显降低。1987年,吉利亚James Madison大学的Dennis成功地从真养产 碱杆菌中克隆到合成PHB的基因，并转入五.""中，该菌株可以直接利用各种碳源，
如葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖等廉价底物，进一步降低了成本。目前，PHB在大肠杆菌 中的产量已经占到菌体干重的85%以上。但是，工业化生产PHB的成本仍然很高。
利用基因工程改造大肠杆菌，可突破传统的发酵模式。实现对PHB和琥珀酸的发 酵联产，具有重要的实用意义。
发明内容
针对目前PHB发酵和琥珀酸发酵生产中的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种 利用重组大肠杆菌菌株高效联产琥珀酸和聚P羟基丁酸酯(PHB)的方法。
本发明选择大肠杆菌作为基因工程改造的对象菌株，所用大肠杆菌菌株为MG1655、 JM109、 DH5a、 W3110或Xll-blue中的一株。其中MG1655、 JM109和W3110来源于 ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5a与Xll-blue来源于DSMZ(德国微生物保藏中心)。
真养产碱杆菌(^^^/^股5 ew/ra户/uw)购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。 月巴大产碱杆菌04/^//^"^ /a^y)、 自养黄杆菌(la"^zo6a"er flwto rap/n-c"力、巨大芽孢杆 菌(^a"'〃M wegflfer/ww )和恶臭假单胞菌CPwwfifow朋a;y ; W必)购买于ATCC(美国典型菌 种保藏中心)。
本发明的技术方案是利用基因工程改造大肠杆菌，在同一菌株内构建琥珀酸合成
代谢途径和PHB合成代谢途径。
琥珀酸是三羧酸循环中间产物之一。以代谢流分析，本发明采用大肠杆菌碳源代谢
途径中的琥珀酸脱氢酶(^//L4"基因及异拧檬酸裂合酶阻遏物(/c/i )缺陷型菌株发酵生 产琥珀酸。^Z/l4S亚基的敲除，使得琥珀酸不被氧化利用，从而在大肠杆菌细胞内积累 下来；Zc/i 的敲除使得乙醛酸循环得以发挥作用，增加了琥珀酸的生成途径，同时保证 了大肠杆菌菌株的正常生长。
PHB合成代谢中有三个关键性的酶酮基硫酯酶(乙酰CoA乙酰转移酶)催化两个 乙酰CoA形成乙酰乙酰CoA ;依赖NADPH的乙酰乙酰还原酶(羟基丁酰CoA脱氢酶) 催化立体选择性反应，从乙酰乙酰CoA产生D-(-) 3-羟基丁酰CoA ; PHB聚合酶催化 D-(-)3-羟基丁酰CoA，通过酯键形成聚酯PHB。将这三个关键性的酶克隆到大肠杆菌 中过量表达，大肠杆菌即实现以葡萄糖等单糖为底物合成PHB。其途径为葡糖—磷酸 葡萄糖—丙酮酸—乙酰CoA一乙酰乙酰CoA—羟基丁酰CoA—聚p羟基丁酸。
本发明在同一大肠杆菌内同时构建了 PHB和琥珀酸合成代谢途径，以葡萄糖等单 糖为底物发酵同时生产PHB和琥珀酸。
本发明所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和PHB的方法步骤如下 (1)琥珀酸代谢途径的构建
通过Red重组系统在大肠杆菌MG1655、 JM109、 DH5a、 Xll-blue或W3110中敲 除基因(琥珀酸脱氢酶)和/d/ (异柠檬酸裂合酶阻遏物)，构建琥珀酸好氧发酵 途径。
利用Red重组系统，根据Genbank公布的大肠杆菌基因组序列，设计引物对W/L4B 和^/i 基因进行敲除。以pKD3或pKD4为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)扩增带有 氯霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因的同源重组片断。培养带有pKD46质粒的大肠杆
菌并制备电转化感受态细胞，将50 100[il的感受态细胞与8 12 ng的同源重组片断混 合加入电击杯中(购买于Bio-Rad公司)，通过电穿孔仪(购买于Bio-Rad公司)电击，电压 设置为1800 2500v。将电击液用900pL的SOC培养基稀释，然后通过氯霉素抗性或 卡那霉素抗性平板筛选重组子，然后设计引物PCR验证敲除的正确性。然后培养重组 大肠杆菌并制备感受态细胞，转化pCP20质粒，通过温度诱导表达FLP内切酶将抗性 基因从基因组上切除掉。
上述的大肠杆菌优选大肠杆菌MG1655或大肠杆菌DH5a。 上述敲除基因和/c/i 所用的引物分别为
pKD-W/^45 primer 1
AGCTGCTTC -3'
primer2
ATGGTCC -3'
pKD陽涵J5 testl
5 '-GCTGC AACTGGTGATTGTCG-3' KD-W磁test2
5 '-GAGCATC ATC AAC ATCCGGG-3' pKD-Zc// primer 1
GCTGCTTC -3'
pKD-/c/A primer2
CATGGTCC -3' pKD-威testl
5'- TAAAAGCGACCACCACG-3' pKD-威test2
5'-GCGATTAACAGACACCCT陽3'。
上述质粒pKD46(oriR101 repA101ts ParaB- gam-bet-exo Amp)是温度敏感型，能在阿 拉伯糖的诱导下表达同源重组需要的三个X噬菌体重组酶Gam， Bet和Exo。
上述质粒pKD3含有两边为FRT位点的氯霉素抗性基因；质粒pKD4含有两边为 FRT位点的卡那霉素抗性基因。
上述质粒pCP20为温度敏感型，热诱导后表达FLP重组酶，能识别FRT位点并促 进重组的发生。所述质粒pKD46、 pKD4、 pKD3及pCP20的构建及应用见(l.Datsenko
KA， Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in E^c/zm'c/n'a co// K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:6640 6645; 2. Red重组技术研究进展， 中国生物工程杂志，2006， 26 (1): 81 86; 3. Red重组系统及在微生物基因敲除中的 应用,遗传，2003， 25 (5): 628 632; 4.利用Red重组系统对大肠杆菌ClpP基因的敲 除，中国生物化学与分子生物学报，2005,21 (1): 35 38)。
(2) PHB合成代谢途径的构建
基本方法是将来源于真养产碱杆菌04/c""ge"^ ew ro;7/7^)、肥大产碱杆菌 ^4/ca//gewey. /aftAs)、 自养黄杆菌(^Taw^zo6a"er aw/o^"op/z/cz^)、 巨大芽孢lf菌(5ac7'〃Ry wega^7'ww)或恶臭假单胞菌(i^ewcfowo"a;y /w"/a)的PHB合成酶基因p/z6C4fi克隆至质 粒pBluescript SIC、 pUC18、 pUC19、 pCL1920或pTrc99-A中，获得PHB表达重组质 粒并转化大肠杆菌MG1655、 JM109、 DH5a、 Xll-blue或W3110，得PHB发酵途径的 大肠杆菌；
上述获得PHB合成酶基因p/^C43所用的引物分别为
phbCAB primer 1: 5 '-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3'
phbCAB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3'。
其中所述PHB合成酶基因； /zZ)C4S的来源菌株优选真养产碱杆菌04/c"/^^7" ew&op/z—。
将来源于真养产碱杆菌的酮基硫酯酶(p/^S)，羟基丁酰CoA脱氢酶(p站J)， PHB聚 合酶(pMC)三个PHB合成酶基因/7^C4B克隆到质粒表达载体上，得到PHB合成酶重 组表达质粒，将PHB合成酶重组表达质粒通过转化转入大肠杆菌(MG1655、 JM109、 DH5a或W3110中的一株)中，通过添加诱导剂诱导PHB合成酶基因； M)CA8的表达。 从而三个PHB合成中的关键酶酮基硫酯酶，羟基丁酰CoA脱氢酶，PHB聚合酶催化 乙酰CoA生成PHB，即得PHB发酵途径的大肠杆菌。
所述PHB合成酶/7/^C4S表达载体为pBluescript SIC、 pUC18、 pUC19、 pCL1920 或pTrc99A中的一种。
所述质粒pBluescript S、pUC19、 pUC18购自Fermentas公司，pCL1920购自 DSMZ(德国微生物保藏中心)，pTrc99A购自ATCC(美国典型菌种保藏中心)。
(3) 构建琥珀酸和PHB联产的重组大肠杆菌
将来源于真养产碱杆菌的PHB合成酶基因； ^C4S克隆至质粒pBluescript SK\ pUC18、 pUC19、 pCL1920或pTrc99-A中，获得重组质粒并转化到已构建有琥珀酸好 氧发酵途径的大肠杆菌中，获得联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌。或者
在已构建有PHB发酵途径的大肠杆菌中，利用Red重组系统敲除基因(琥 珀酸脱氢酶)和(异柠檬酸裂合酶阻遏物)，构建琥珀酸好氧发酵途径，获得联产 琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌。
(4) 发酵琥珀酸和PHB联产的重组大肠杆菌并检测琥珀酸和PHB
将所获得的联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌从固体平板上挑取1 2环接入装有 LB培养基的试管中，30 4(TC下，培养12 20h;然后按照1 10%的接种量转入300ml
的三角瓶或5L的发酵罐中发酵；发酵条件是摇瓶温度设为30 4(TC,摇床转速设
为150 300转/分，发酵时间48h 72h;发酵罐温度设为30 4(TC，溶氧控制在50% 以上，pH6.5 7.5，发酵时间72h 150h。
每间隔2 4h取样，将取的发酵液以4， 000 12， 000的转速离心2 20min，上 清用于分析检测琥珀酸，用0.2pm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。
检测条件为检测柱Waters C18，流动相1%。的甲酸，检测器示差检测器。菌体于
55 8(TC下烘干，称重，然后加入100 200微升的98%硫酸，沸水浴中加热60 70min， 然后利用15。/。的氨水调节pH至2.5，经0.22pm微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)
检测PHB含量。检测条件为分析柱C18; 1%。的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外
波长为210nm。
上述利用大肠杆菌联产琥珀酸和PHB的方法中
(2) 或(3)所述质粒优选质粒pBluescript SK—。
(3) 所述联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌或者联产PHB和琥珀酸的重组大肠杆 菌是重组大肠杆菌MG1655Z1^//^^ Zlz'c/i ::kan/pBluescript SK'-; /^C^。
步骤(4)所述发酵条件优选是摇瓶温度设为37'C，摇床转速设为250转/分，发 酵时间48h 60h;发酵罐温度设为37'C，溶氧控制在50%以上，pH 7.0，发酵时间 100h 120h。
本发明使用了近几年来发展迅速的依赖于X噬菌体的Red重组系统，对大肠杆菌染 色体DNA进行基因敲除、敲入和替换。Red是一种X噬菌体主管同源重组的重组酶， 由exo、 beta和gam基因组成。Gam抑制宿主菌的RecBCD核酸外切酶，使外源线形 DNA不被立即降解，Exo和Bet引导线形片断与同源区发生重组置换，该方法与传统同 源重组方法相比，简单、精确并且效率高出几十倍。操作过程中不需要限制向内切酶和 DNA连接酶。
本发明巧妙地将PHB生物合成基因导入琥珀酸工程菌株中，成功获得了联产琥珀 酸和PHB的大肠杆菌，发酵检测结果表明，该工程菌株可高效率地转化葡萄糖生成琥 珀酸和PHB。消耗75g/L的葡萄糖，生成37.5g/L的琥珀酸，同时菌体积累PHB达到干 重的28%。联产琥珀酸和PHB不仅解决了目前琥珀酸和PHB发酵过程中所存在的缺陷 和不足，而且还节省了发酵环节上的大量能源成本及分离提取成本。将本发明方法应用 到大规模发酵工业中，可以实现琥珀酸和PHB的低成本、高效率的联产，具有重要的 工业应用价值。
图1为本发明构建的产琥珀酸和PHB的途径。
图2为本发明联产重组大肠杆菌摇瓶培养结果。
图3为本发明联产重组大肠杆菌发酵罐培养结果。
具体实施例方式
实施例l、琥珀酸发酵途径的构建(敲除sdhAB) 菌种大肠杆菌MG1655
所述LB培养基为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L，氨苄青霉素，100mg/L， 卡那霉素50mg/L。
所述氨苄霉素抗性平板为含有100mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。 所述卡那霉素抗性平板为含有50mg/L的氨苄青霉素，1.5%的琼脂粉的LB固体培养基。 所述SOC培养基为蛋白胨2 g/L，酵母粉0.5 g/L，NaCl 0.0585 g/L， KC1 0.0186g/L， MgCl2 0.203 g， MgS04 0.246 g/L，葡萄糖20 mmol/L。
(1)同源重组片断的克隆
利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的W/L45基因序列设 计引物
primer 1
TGCTTC-3' PKD-sc/Zl45 primer2
GTCC -3'
以pKD4通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片断。 PCR反应体系如下(引物浓度为20pmol/L)
10x缓冲液 5pl;
25mmol認gC12 ，；
10mmol/L四种dNTP混合液1^1;
上下游引物各1^1;
TaqDNA聚合酶0.5^1;
模板DNAlpl，加水补至50(al; PCR反应条件97。C预变性10min， 94。C变性60s， 58。C退火30s， 72。C延伸90s， 30个循环后72。C延伸10min， 4'C保存。通过D;w/内切酶消化后，回收纯化浓縮同源 重组片断。
(2) 电转化感受态细胞的制备
(I) 挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655，转入LB培养基中，同时加入0.2% 的阿拉伯糖，培养OD纖至0.5;
(II) 冰浴15min，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤三次；
(III) 加入10%的甘油，浓縮至50倍，分装感受态。
(3) 电转化，筛选重组子
(I) 吸取7 10叫/1的同源重组片断，加入10(^1的感受态细胞中，混匀。调节电穿 孔仪，2.5Kv，电击；
(II) 加入900^1的SOC培养基，37°C， 150转/min，培养lh;
(III) 涂布卡那霉素抗性平板，调取重组子利用 pKD-W禱testl 5'國GCTGCAACTGGTGATTGTCG-3' pKD-W雄test2 5'-GAGCATCATCAACATCCGGG-3'
进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实sdhAB已被卡那霉素抗性基因换。
(IV) PLP位点专一重组
将pCP20转入氯霉素抗性克隆，30'C培养8h，后提高至42'C过夜，热诱导FLP重 组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单 克隆同时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉 素抗性平板上不生长的已被F1P重组酶删除。利用检测引物pKD-W/^45 testl和 pKD-W雄test2进一步鉴定。
(V)获得工程菌株MG1655AW/L4仏
实施例2、 PHB合成代谢途径的构建 菌种大肠杆菌DH5a
所述培养基LB:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L，氨苄青霉素，100mg/L。 所述PHB合成酶基因来源于真养产碱杆菌G4. ew/w/ te》。 所述氨苄霉素抗性平板含有1.5%的琼脂和100mg/L的氨苄霉青霉素。 (1) PHB合成酶表达载体的构建
(I) 将真养产碱杆菌接种于LB培养基中，利用通用细菌基因组提取试剂盒提取基因 组。
(II) 根据Genbank公布的真养产碱杆菌的基因组序列，设计引物
phbCAB primer 1: 5 '-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3' phbCAB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC陽3' (II)克隆PHB合成酶基因
以真养产碱杆菌基因组为模板，PCR扩增户/^C4B基因。PCR反应体系如下(引 物浓度为20(imol/L)
10x缓冲液 5叫
25mmol/LMgC12 4|il;
10mmol/L四种dNTP混合液
上下游引物各lpl;
TaqDNA聚合酶0.5pl;
模板DNAlpl，加水补至50pl;
PCR反应条件97。C预变性10min， 94。C变性60s， 58。C退火30s， 72。C延伸5.5min， 30个循环后72"延伸10min， 4'C保存。
(in)PHB合成酶表达载体的构建
将pBluescript SK—和PCR产物通过Sma/和双酶切反应，利用PCR产物回
收试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接，反应为16"， 16h。从而获得PHB合成酶表 达载体pBluescript SK、/ /^C45。
(2) 大肠杆菌感受态的制备；
(I )调取LB平板中的大肠杆菌co// DH5a,培养过夜；
(II) 将培养过夜的大肠杆菌五.co// DH5a按照1%的接种量转入装有50 ml LB的 300ml的三角瓶中培养，OD,至0.4左右。停止培养，置冰上20min， 4°C， 4000 g， 离心10min。弃上清，加入冰冷的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30min。离心浓縮。获得 感受态细胞。放于-7(TC保存。
(3) PHB表达载体的转化
(I)将8昭/1的PHB表达载体pBluescript SK)秘C4S转入100^1的感受态细胞中， 混匀；
(n)置冰上30min;
(III) 42 °C热激，冰上静置2min，加入900^1的LB培养基，37°C， 100转/min，培 养lh。
(IV) 涂布氨苄霉素抗性平板，培养过夜，调取验证，筛选转化子。
所述PHB表达载体pBluescript SK—f/^C^即； /^C4S位于Lac启动子的下游。 所述真养产碱杆菌购买于CICC(中国工业微生物菌种保藏管理中心)。 实施例3、联产发酵琥珀酸与PHB的重组大肠杆菌的构建 1.琥珀酸合成代谢途径的构建(/c/i 基因的敲除)
菌种大肠杆菌MG1655AW/l4B (I)同源重组片断的克隆
根据GenBank公布的大肠杆菌基因组序列设计引物 pKD-/c/i primer 1:
GCTTC陽3' pKD-/c/i primer2:
GGTCC -3'，以pKD4质粒为模板通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素 抗性的重组片断。PCR反应体系如下(引物浓度为2(Hunol/L)
10x缓冲液 5pl;
25mmol/LMgC12 ，；
10mmol/L四种dNTP混合液l|til;
上下游引物各lpl;
TaqDNA聚合酶0.5
模板DNAlial，加水补至50ial;
PCR反应条件9 7 。C预变性10min， 9 4 。C变性60s， 58 。C退火30s, 72 。C延伸70s， 30个循环后72 'C延伸10min,回收纯化浓縮同源重组片断。
(II) 电转化感受态细胞的制备
(A) 挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌MG1655A //l4S转入LB培养基中，同时 加入0.2%的阿拉伯糖，培养OD6GQ至0.5;
(B) 冰浴15min，离心菌体，然后利用10%的甘油洗涤三次；
(C) 加入10%的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。
(III) 电转化，筛选重组子
(A) 吸取7 10pg/1的同源重组片断，加入lOOpl的感受态细胞中，混匀。调节电 穿孔仪，2.5Kv，电击；
(B) 加入900^1的LB培养基，37°C， 150转/min，培养lh;
(C) 涂布卡那霉素抗性平板，调取重组子利用pKD-zW/ testl: 5'-TAAAAGCGACCACCACG-3'与pKD"c/J test2: 5'-GCGATTAACAGACACCCT-3'进行
PCR检测；
(D )获得带有卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌MG1655Aw/ZL4SAZc仪kan。
2. 琥珀酸与PHB联产发酵工程菌株的构建 菌种MG1655 A //l4S A/c/i : :kan
(1) 感受态细胞的制备
(I) 将大肠杆菌MG1655 A ^45 A/c/i : :kan在LB培养基中培养过夜；
(II) 将培养过夜的大肠杆菌MG1655 AW/^S A/c/i : :kan按照1%的接种量转入装 有50 ml LB的300ml的三角瓶中培养，OD6()Q至0.4左右。停止培养，置冰上20min， 4°C， 4000 g，离心10min。弃上清，加入冰冷的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30min。离 心浓缩。获得感受态细胞。放于-7(TC保存。
(2) PHB表达载体的转化
(I )将8吗/1的PHB表达载体pBluescript SIC-; /^C45转入100^1的感受态细胞中， 混匀；
(II)置冰上30min;
(IH)42。C热激，冰上静置2min,加入900^1的LB培养基，37°C， 100转/min，培养 lh。
(IV) 涂布氨苄霉素和卡那霉素双抗性平板，培养过夜，调取验证，筛选转化子。
(V) 获得琥珀酸和PHB的联产重组菌株MG1655A //l45 Az'c/i ::kan/pBluescript
所述氨卡霉素抗性平板含有质量百分比为1.5%的琼脂，100mg/L的氨苄霉青霉素 及50mg/L的卡那霉素。
3. 琥珀酸和PHB联产重组大肠杆菌摇瓶发酵
菌种MG1655A //l45 Az'c/i : :kan/pBluescript SIC-; /^ClB。
所述发酵培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L,NaHCO3lg/L,氨苄霉 素100mg/I,卡那霉素50mg/L。
所述LB培养基为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaC110g/L。
(1) 培养方法
(I )种子液得制备用接种环调取平板上的菌种接入装有50ml LB培养基的300ml 的三角瓶中，卡那霉素和氨苄青霉素至终浓度分别为50mg/l, 100mg/l。于37'C， 250转 /min，培养12h。
(II)摇瓶发酵将种子液按照1%的接种量将种子液接入装有50ml发酵培养基的 300ml的三角瓶中。接种时加入卡那霉素和氨苄青霉素至终浓度分别为50mg/l, 100mg/l， 培养温度设为37°C，摇床转速设为250转/min。培养至12h，加入IPTG(异丙基-(3-D-硫 代半乳糖苷)至终浓度为0.4mM。发酵48h，每间隔4h取样。
(2) 琥珀酸和PHB的检测
(I) 琥珀酸的检测取发酵完毕的菌液12， 000 g，离心2min。取上清，用0.2pm的 滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为检测柱waters C18，流
动相1%。的甲酸，检测器示差检测器。
(II) PHB的检测
收集细胞将发酵完毕的发酵液样品在5,000转/min的转速下离心20min，收集沉 淀细胞，使用蒸馏水洗涤细胞3次后，5,000转/min离心20min收集细胞，烘干后称其 干重。
样品检测将上述制得的干菌体，加入150微升的98%硫酸，沸水浴中加热60min， 然后利用15%的氨水调节pH至2.5，经微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)检测PHB 含量。检测条件为分析柱C18;l%。的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外波长为210nm。 检测结果如图2所示，重组大肠杆菌MG1655A^f/^5 Az'c/i ::kan/pBluescript SK.-p/^C4B在以葡萄糖为碳源的培养基发酵，可以高效地转化为琥珀酸和PHB。
实施例4、联产重组工程菌株的发酵罐培养 菌种重组大肠杆菌MG1655AW/l4B A/c/i ::kan/pBluescript SIC-p/^C^ 所述发酵培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L， NaCl 10g/L, NaHC03 lg/L,氨苄霉素 100mg/l，卡那霉素50mg/L。
(1) 发酵培养
用接种环调取平板上的菌种接入装有50ml的培养基的300ml的三角瓶中，于250 转/min的摇床上培养12h，培养温度设为37'C，然后按照1%的接种量接入装有200ml 的培养基的1000ml的三角瓶中，培养过夜。然后按照5%的接种量转入装有3L发酵培养 基的5L发酵罐中培养。培养温度设为37°C ，溶氧控制在50%以上，利用2mol/L的NaOH 和lmol/L的HN03控制pH在6.5-7.5。接种时加入卡那霉素和氨苄青霉素至终浓度分 别为50mg/l, 100mg/l。培养至12h，加入IPTG至终浓度为0.4mM。发酵120h,每间隔 4h取样。
(2) 琥珀酸和PHB的检测
(I) 琥珀酸的检测将所取发酵液样品在12， 000转/min，离心2min。取上清，用 0.2pm的滤膜过滤，然后利用HPLC(高压液相色谱)检测。检测条件为检测柱waters
C18，流动相1%。的甲酸，检测器示差检测器。
(II) PHB的检测
收集细胞将所取的发酵液样品在12， 000转/min的转速下离心2min，收集沉淀细 胞，使用蒸馏水洗涤细胞3次后，5,000转/min离心20min收集细胞，烘干后称其干重。
样品检测将上述制得的干菌体，加入150微升的98%硫酸，沸水浴中加热60min， 然后利用15%的氨水调节pH至2.5，经微孔滤膜过滤后，HPLC(高压液相色谱)检测PHB
含量。检测条件为分析柱C18;l%。的甲酸作流动相；紫外检测器；紫外波长为210nm。
通过检测结果图3可以看出，本发明方法构建的重组大肠杆菌MG1655A //^S △/c/i : :kan/ pBluescript SK--/ M>C45在以葡萄糖为碳源的培养基发酵，可以高效率地转 化葡萄糖生成琥珀酸和PHB。在消耗75g/L的葡萄糖时生成37.5g/L的琥珀酸，菌体积 累PHB达到28。/。。可以高效地转化为琥珀酸和PHB。同时乙酸盐及丙酮酸等副产物大 大减少。结果表明，PHB和琥珀酸的联产具有很大的优势。本发明所构建的该工程菌株 在实际大工业发酵生产中具有巨大的应用前景。
序列表
〈110〉山东大学
〈120〉利用重组大肠杆菌联产琥珀酸和聚^羟基丁酸酯的方法
〈141〉2008-7-26
<160〉10
〈210〉1
<211〉59
〈212〉廳
〈213>pKD-sdhAB (上游引物) 〈400〉1
gggccacacg cgaaactgaa actcgatcac ctgggtaaag tgtaggctgg agctgcttc 59
〈210〉2
〈211〉59
<212〉DNA
〈213〉pKD-sdhAB(下游引物) 〈400>2
gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag gcctacggta tgggaattag ccatggtcc 59
<210〉3
<211〉20
<212〉薩
<213>pKD-sdhAB testl(上游引物) <400〉3
gctgcaactg gtgattgtcg 20
〈210〉4
<211〉20
<212>DNA
〈213〉pKD-sdhAB test2(下游引物) 〈400〉4
gagcatcatc aacatccggg 20 〈210〉5
〈211〉59
<212〉DNA
〈213〉pKD-iclR(上游引物) 〈400>5
atgaaaatga tttccacgat ac卿aaaaa gagactgtcg tgtaggctgg agctgcttc 59
〈210〉6
〈211>59
〈212〉DNA
〈213〉pKD-iclR(下游引物) <400〉6
tatgatgggc agaatattgc ctctgcccgc c卿aaa卿tgggaattag ccatggtcc 59
〈210〉7
<211〉17
〈212環A
<213〉pKD-iclR test(上游引物) 〈400〉7
taaaagcgac caccacg 17
〈210〉8
<211〉18
<212>DNA
<213〉pKD-iclR test(下游引物) 〈400>8
gcgattaaca gacaccct 18
<210>9
<211〉37
<212>DNA
〈213〉phbCAB primer (上游引物) <400〉9
atccccgggg cgaccggcaa aggcgcggca gcttcca 37
〈210>10 〈211〉36 <212〉脆
〈213〉phbCAB primer(下游引物) <400〉10
atggaattcc agcccatatg caggccgccg ttgagc 3权利要求
1.一种利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚β羟基丁酸酯的方法，步骤包括 (1)在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径； (2)在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建PHB发酵途径；获得联产琥珀酸 和PHB的重组大肠杆菌；或者 (1)在大肠杆菌中构建PHB发酵途径； (2)在所构建PHB发酵途径的大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径；获得联产琥珀酸 和PHB的重组大肠杆菌； (3)发酵联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌并检测琥珀酸和PHB；其特征是步骤(1)所述在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径是通过Red重组系统在大肠杆菌MGl655、JMl09、DH5a、X11-blue或W3110中敲除基因sdhAB和iclR，构建琥珀酸好氧发酵途径；步骤(2)所述在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建PHB发酵途径是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes.latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至质粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，并转化到已构建有琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中，获得联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌；或者步骤(1)所述在大肠杆菌中构建PHB发酵途径是将来源于真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)、肥大产碱杆菌(Alcaligenes latus)、自养黄杆菌(Xanthobacter autotrophicus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的PHB合成酶基因phbCAB克隆至质粒pBluescript SK-、pUC18、pUC19、pCL1920或pTrc99-A中，获得PHB表达重组质粒并转化大肠杆菌MG1655、JM109、DH5a、X11-blue或W3110，得PHB发酵途径的大肠杆菌；步骤(2)所述在所构建PHB发酵途径的大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径是将sdhAB和iclR基因敲除，获得联产PHB和琥珀酸的重组大肠杆菌；步骤(3)所述联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌的发酵条件是摇瓶温度设为30～40℃，摇床转速设为150～300转/分，发酵时间48h～72h；发酵罐温度设为30～40℃，溶氧控制在50％以上，pH6.5～7.5，发酵时间72h～150h。
2. 根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚P羟基丁酸酯的方法，其特征 是步骤(l)所述的大肠杆菌是大肠杆菌MG1655或大肠杆菌DH5a。
3. 根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚卩羟基丁酸酯的方法，其特征 是步骤(l)所述在大肠杆菌中构建琥珀酸好氧发酵途径中敲除基因W/L45和/c/i 所用 的引物分别为PKD-W/l45 primer 1<formula>formula see original document page 2</formula>pKD-W/^S primer2 ATGGTCC陽3'pKD-涵J5 testl5 '-GCTGC A ACTGGTG ATTGTCG陽3' pKD-涵力5 test25 '-GAGC ATC ATC A AC ATCCGGG-3' pKD-/c/i primer 1GCTGCTTC -3'pKD-/c/i primer2CATGGTCC -3' pKD-譜testl5'- TAAAAGCGACCACCACG-3' pKD-威test25'-GCGATTAACAGACACCCT-3'。
4. 根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚卩羟基丁酸酯的方法，其特征 是步骤(l)所述在大肠杆菌中构建PHB发酵途径中获得PHB合成酶基因；7MC45所 用的引物分别为phbCAB primer 1: 5'-ATCCCCGGGGCGACCGGCAAAGGCGCGGCAGCTTCCA-3'phbCAB primer 2: 5'-ATGGAATTCCAGCCCATATGCAGGCCGCCGTTGAGC-3'。
5. 根据权利要求4所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚P羟基丁酸酯的方法，其特征 是所述PHB合成酶基因； /^CAB的来源菌株是真养产碱杆菌G4/ca"gw" e^rap/n^)。
6. 根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚卩羟基丁酸酯的方法，其特征 是步骤(2)所述在所构建琥珀酸好氧发酵途径的大肠杆菌中构建PHB发酵途径，用于 表达PHB合成酶基因p/26C4S的质粒选pBluescript SK、
7. 根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚卩羟基丁酸酯的方法，其特征 是步骤(2)所述联产琥珀酸和PHB的重组大肠杆菌或者联产PHB和琥珀酸的重组大 肠杆菌是重组大肠杆菌MG1655Z1W/l4B Zl/c/i :: kan/pBluescript SK-卞/z6C45。
8. 根据权利要求1所述利用大肠杆菌联产琥珀酸和聚卩羟基丁酸酯的方法，其特征是步骤(3)所述发酵条件是摇瓶温度设为37'C，摇床转速设为250转/分，发酵时间48h 60h;发酵罐温度设为37。C，溶氧控制在50%以上，pH7.0，发酵时间100h 120h。
全文摘要
本发明首次公开了一种利用大肠杆菌联产琥珀酸和PHB的方法，是敲除了大肠肝菌中的sdhAB和iclR基因，构建了琥珀酸好氧发酵途径，获得了琥珀酸发酵工程菌株MG1655ΔsdhAB ΔiclR::kan；在此基础上，将PHB合成途径导入大肠杆菌MG1655ΔsdhAB ΔiclR::kan中，从而在同一大肠杆菌中成功构建了琥珀酸和PHB发酵途径。发酵检测结果表明，该工程菌株可高效率地转化葡萄糖生成琥珀酸和PHB。消耗75g/L的葡萄糖，生成37.5g/L的琥珀酸，同时菌体积累PHB达到菌体干重的28％。该工程菌株具有重要的应用前景。
文档编号C12N15/63GK101363032SQ20081013888
公开日2009年2月11日 申请日期2008年8月8日 优先权日2008年8月8日
发明者振 康, 祁庆生 申请人:山东大学