专利名称：：一种水产动物snp标记筛选方法
技术领域：
：本发明属于水产生物
技术领域：
中的水产动物分子标记筛选技术，具体涉及一种水产动物SNP标记筛选的新方法，适合于在水产动物中发现和筛选SNP分子标记。
背景技术：
：SNP(单核苷酸多态性)作为第三代分子标记，具有以下特点SNP为双等位型标记；SNP在DNA分子上分布不均匀；SNP有很高的密度；SNP具有遗传稳定性；SNP的检测和分析易实现自动化。SNP在高密度遗传连锁图谱构建、性状相关分子标记筛选等方面发挥着越来越重要的作用。大量基因组序列信息的获得对于SNP的发现至关重要，所以目前SNP研究主要集中在人类及各种模式生物上，其在非模式生物上的研究受到了极大限制。在水产领域内，SNP研究更为罕见，并且所用的方法存在诸多不足，严重制约了SNP标记在水产领域内的应用。目前，水产动物上SNP的开发方式主要有两种一种是基于大量序歹'H言息的歸选方式(Heetal.,2003;Smithetal.，2005;Bradleyetal.，2007),这种方式主要集中在才莫式鱼类-斑马鱼及重要经济鱼类-鲑鱼等种类上。因为这种基于大规模测序的方法，成本较高，并不适合于所有经济鱼类的SNP开发，所以并没有得到普及。第二种是针对候选基因的SNP开发(TaoandBoulding，2003;RyynS腦andPrimmer,2006)，这类方法在经济鱼类上有一定的应用前景，成本丰交低，但由于需要首先进行基因克隆，其效率较低，而且由于SNP的连锁性，邻近的SNP位点往往以单倍型的形式存在，难以得到大量有效的SNP位点。因而，在水产动物上，亟需一种能够有效开发大量SNP位点，并且成本较低的方法。我们发明的这种方法，可以在整个基因组内批量寻找SNP位点，具有高效率、低成本的特点，有利于SNP标记在水产动物上的推广应用。为此，本发明提出了一种全新的SNP标记筛选方法。
发明内容本发明提供了一种水产动物SNP标记筛选方法，可以解决现有技术存在的效率低、成本高的问题。本发明的目的是建立一种全新的SNP标记开发方法，能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的SNP标记，为基因组序列未知的非模式生物及水产经济动物提供筛选大量SNP标记的新方法。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现一种水产动物SNP标记筛选方法，其特征在于包4舌如下步骤1)基因组DNA提取按照常规酚氯仿方法分别提取8-12个半滑舌鳎个体的高纯度DNA,取少量样本》欠入研4本中，加少许液氮研磨，直至组织^皮碾成粉末，将粉末转入离心管中并加入DNA提取液TENS,然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液,混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽才是两次，向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，^f吏DNA沉淀10-30分钟，70%乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA,测定DNA浓度后，将8-12个个体的DNA等量混合形成DNA池；2)#sel限制性内切酶酶切，接头连"f姿及预扩增取1-2Pg混合后的基因组总DNA,加入50-100单位内切酶进4亍酶切反应，65。C温浴1.5-2.5小时，酶切产物经纯化后，用TE溶解，取部分纯化的酶切产物与序歹'J为5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的Msel接头用T4连接酶16°C连接过夜，然后对连接产物进行PCR预扩增，用以富集DNA产物，PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5juL酶切-连接产物、终浓度为0.4jLiM、序列为5'一GATGAGTCCTGAGTAAN—3'的Msel—N引物、lxPCR纟爰沖液、0.2pM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶，反应条件为94。C预变性5min,94。C变性30s,53。C退火lmin,72。C延伸1min进4亍20个循环，最后72。C延伸10min，反应产物用1%琼脂糖电泳一佥测，判断产物分布范围及产物量，PCR产物应该为一分步均匀的弥散带；3)杂合双链的形成，I酶切及"WDNA聚合酶延伸将预扩增产物进行变性及复性，使其形成杂交双链，变性及复性条件为95。C变性2min，以2。C/秒的速度从95。C降至85°C,然后以0.rC/秒的速度从85。C降到25°C,最后4。C保存。复性产物用CELI对SNP位点进4亍酶切，酶切条件为10nL复性产物与20jaL反应緩冲液，10mMHEPES7.5,10mMMgS04，0.002%(w/v)TritonX-100,20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1单位CELI酶，45°C温浴25-35分钟，加入5juL0.15MEDTA，pH8，终止反应；酶切产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于Bst延伸，延伸条件为20mMTris-HCl,pH8.8，10mMKC1,10mM(匪4)2S04,2mMMgS04,0.1%吐温X-100,20nMdATP,20nMdGTP,20nMdCTP，13nMdTTP,7nMbiotin-dUTP，4单位BstDNA聚合酶，然后置于65。C温浴1小时；4)含有SNP位点DNA分子的》兹珠分离l-2mg的包被有链亲和素的磁珠用300juLTEN100(10mmo1/LTris-HC1，lmmol/LEDTA，100mmo1/LNaC1，pH7.5)溶液在室温下洗涤3次，然后将其与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35分钟，磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，首先进行3次非严谨性洗脱使用400|uL緩冲液TEN1000(10niMTris-HC1,1mMEDTA,1000mMNaCl，pH7.5)于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟；随后进行3次严谨性洗脱使用400jaL0.2xSSC(30mMNaCl，3mM种檬酸钠，pH7.0)+0.1%SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清；最后再用lxSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)洗脱两次，除去SDS，加入50jaLTE,吹打均匀，于95°C下水浴10分钟，期间不时搅动或者轻轻吹打均勾，用；兹力架固定石兹珠后，迅速吸出上清液，经纯化后备用；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序将纯化后的5jaLDNA液用于PCR扩增，条件与预扩增相同，PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后，按照常规方法进行序列分析；6)SNP标记鉴定根据测序结果进行引物设计；将8-12个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增，克隆测序，每条序列需测序10个克隆，验证SNP位点，将单碱基差异出现频率在20%及以上的位点定义为SNP标记。本发明的学术思路是采用CELI内切酶特异性切割SNP位点，BstDNA聚合酶链置换活性及生物素-磁珠分离方法。通过变性和复性后，舍有SNP的DNA链会形成单碱基不匹配的杂交双链，CELI内切酶可以特异识别这种位置，并在SNP位点处切割DNA双链中的一条，形成3，-OH末端。BstDNA聚合酶具有链置换活性，可以以CELI酶切后的一条链为模板，而以带有3，-OH末端的一条链为引物进行DNA延伸反应。在DNA延伸过程中，可以将Biotin标记的dUTP渗入到DNA链中。生物素与链亲和素可以特异結合，因此，含有SNP位点的DNA可以与链亲和素包被的磁珠特异结合，从而起到SNP的分离作用。本发明的方法是将8-12个个体DNA混合形成DNA池；经/化el限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增获得大量DNA;通过变性和复性形成杂合双链，CELI酶切SNP位点及BstDNA聚合酶渗入生物素；通过生物素-磁珠分离方法特异分离含有SNP位点的DNA;将分离得到的DNA进4亍克隆测序；最后通过多个个体序列的比对一睑证SNP位点。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是本发明建立了一种分离SNP位点的新方法。目前已有的SNP分离方法主要有两种，一种是随机测序或全基因组测序，成本较高且分离效率较低；第二种是候选基因或候选基因组区域的SNP分离，这种方法必须事先知道基因的序列，而且仅仅局限在同源区域，操作比较繁瑣，不利于大规模SNP发现及其应用。本发明的SNP标记分离新方法，可以在基因组信息未知的情况下，高效、大批量地随机分离SNP，有利于大量SNP的开发及其后续利用。图1是水产动物SNP标记筛选方法的技术路线示意图2是序列1的SNP筛选结果；图3是序列2的SNP筛选结果；图4是序列3的SNP筛选结果；图5是序列4的SNP筛选结果；图6是序列5的SNP筛选结果；图7是序列6的SNP筛选结果；图8是序列7的SNP筛选结果；图9是序列8的SNP筛选结果；1图10是序列9的SNP筛选结果；其中上述序列1-9是含有SNP位点的9条序列，是从分离的DNA序列中随机选取了10条序列用于SNP位点鉴定，每个片段测IO个克隆，其中单碱基差异出现频率为20%及以上的位点定义为SNP位点，最终有9条序列含有SNP位点，大写字母代表相同的碱基，小写字母代表SNP位点及碱基；点(…)表示空位；横线(一-)表示碱基相同。具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例1下面以半滑舌鳎为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细阐述如图1所示，包括六个步骤l)基因组DNA提取；2)Msel限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增；3)杂合双链的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸；4)含有SNP位点DNA分子的^兹^朱分离；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序；6)SNP标记鉴定。其中，l)基因组DNA提取利用酚氯仿方法分别提取10个半滑舌鳎个体的DNA。取10-20mg肝组织放入研钵，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末。加入lmlDNA提取液TENS(10mMTris-HClpH8.0,lOOmMNaCl,25mMEDTA,0.5°/。SDS)匀浆。在裂解液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:l)溶液，封严离心管盖，反复轻柔的转动离心管，形成乳状液，室温下离心12000rpm，20min,重复抽提两次。将上清液分装在1.5ml的离心管中，每个离心管加入1/10体积的NaAc(3M)和2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀，置冰上10—30min,使DNA沉淀。70°/。乙醇漂洗;咒;定，TE(10mMTris—HC1pH8.0，lmMEDTA)溶解DNA。定量观寸定DNA浓度后，将10个个体的DNA等量混合后形成DNA池。2)Msel限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增取1000ng混合后的基因组总DNA，加入50U的内切酶Msel进行酶切反应。酶切总体积为250nL,65。C温浴2小时。酶切产物经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后，用50julTE溶解。取15jiL的酶切产物与Msel接头(5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3)用T4连接酶连接，16。C过夜。PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5jjL酶切-连^妄产物、终浓度为0.4uM的Msel-N引物(5，-GATGAGTCCTGAGTAAN-3')、1xPCR缓冲液(含Mg2+)、0.2jaM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶。反应条件为首先94°C预变性5min，然后94。C变性30s,53。C退火1min，72。C延伸1min进行20个循环，最后72。C延伸10min。反应产物用1%琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。3)杂合双链的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸将预扩增产物进行变性及复性，条件为95°C2min，95°C到85°C(-2°C/s),85。C到25°C(-0.1°C/s)，4。C保存。复性产物用CELI酶切，酶切条件为10yL复性产物与20|uL反应緩沖液(10mMHEPES7.5,10mMMgS04，0.002%(w/v)TritonX-100,20ng/mL小牛血清蛋白)混合，加入1单位CELI酶，45°C温浴25-35分钟。加入5juL0.15MEDTA(pH8)终止反应。CELI酶可以采用商品化产品，也可自行制备，制备方法参考相关文献进行，操作步骤为取约500g芽菜茎，4"C下匀浆，将溶液调节至0.1MTris-HCl，pH7.7，100|uMPMSF，2600g离心10分钟，去除杂质；将上清调节至25%饱和石克酸4妄，4'C下混匀30分钟，16000g，4'C离心40分钟；将上清调节至80y。饱和^e充酸铵，4。C下混匀30分钟，16000g、4°C离心90分钟；沉淀用十分之一起始体积的0.1MTris-HC10.5MKCLpH7.7，100mMPMSF溶液重悬，将其装入透析袋中并在相同的溶液中透析4小时，每小时更换一次透析液；最后将其分装并-2(TC保存。CELI酶活力单位定义为45。C温浴30分钟可以有效切割含有已知SNP位点(突变型与野生型比例为1:1)DNA链的最少剂量。酶切产物经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后用于Bst延伸，延伸条件为20mMTris-HCl(pH8.8),10mMKCl，10mM(NH4)2S04,2mMMgS04,0.1%吐温X-100，20nMdATP，20nMdGTP，20nMdCTP,13nMdTTP,7nMbiotin-dUTP,4单位BstDNA聚合酶。然后置于65。C温浴1小时。BstDNA聚合酶具有链替换活性，可以以酶切后的一条链为引物而另一条链为模板进行DNA链的延伸，在延伸过程中可以使biotin-dUTP渗入到含有SNP位点的DNA链中。4)含有SNP位点DNA分子的f兹珠分离1-2mg的包3皮有链亲和霉素的i兹珠用300TEN100(lOmmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,1OOmmo1/LNaC1，pH7.5)在室温下洗涤3次，然后与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35min,其间需要不时的轻轻搅动和吹打，以避免；兹珠沉淀。f兹珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。首先进行3次非严谨性洗脱使用400|uL緩冲液TEN1000(10mMTris-HCi,1mMEDTA，1000mMNaCl,pH7.5)于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟，不时的搅动或轻轻吹打。然后紧接着进行3次严谨性洗脱使用400)aL0.2xSSC(30mMNaCl，3mM斗1M蒙酸钠，pH7.0)+0.1%303于室温下洗涤3次，每次5分钟，不时的搅动或轻轻吹打。每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清。最后再用1xSSC(150mMNaCl,15mM杵檬酸钠，pH7.0)洗脱两次，除去SDS。加入50pLTE(pH=8.0)，吹打均匀，然后于95'C下水浴10分钟。期间不时搅动或者轻轻吹打均匀。用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后，用于PCR扩增或冻存于-2(TC冰箱备用5)目标DNA的扩增富集及克隆测序将纯化后的5|liLDNA洗脱液用于PCR扩增，具体条件与预扩增相同。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后测序(具体克隆步骤参考《分子克隆》第三版进行)。6)snp标记鉴定根据测序结果，利用常规引物设计软件和人工校正相结合的方法进行引物设计，设计的基本原则有GC含量在40%-60%之间；引物长度在22bp-25bp之间；一对引物的退火温度相差不超过2度；避免引物3'端发卡结构及引物间的二聚体结构。按照以上原则及方法，共设计引物23对(表1)，其中15对引物有特异性扩增产物(表1)，将其中的IO对用于SNP位点鉴定；将IO个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增(PCR扩增反应混合物中含有模板DNA5Ong、序歹'J特异引物lOpmol、1xpcr《爰冲液(含Mg2+)、0.2mM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶。反应条件为首先94°C预变性5min，然后94。C变性3Gs，56°C-65°C退火30s,72。C延伸lmin进行35个循环，最后72。C延伸10min),克隆测序(具体克隆步骤参考《分子克隆》第三版进行)。每条序列需测序10个克隆，验证SNP标记5为了防止PCR和测序中的误差，将单碱基差异出现频率在20%及以上的位点定义为SNP标记。我们从分离得到的10条序列中，发现有9条序列含有共35个SNP标记，如图2-图10所示，仅有一条序列不含有SNP标记。表1:用于SNP标记鉴定的23对引物序列<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。权利要求1、一种水产动物SNP标记筛选方法，其特征在于包括如下步骤1)基因组DNA提取按照常规酚氯仿方法分别提取8-12个半滑舌鳎个体组织DNA，取少量组织放入研钵中，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末，将粉末转入离心管中并加入DNA提取液TENS，然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽提两次，向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-30分钟，70％乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA，测定DNA浓度后，将8-12个个体的DNA等量混合形成DNA池；2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增取1-2μg混合后的基因组总DNA，加入50-100单位内切酶MseI进行酶切反应，65℃温浴1.5-2.5小时，酶切产物经纯化后，用TE溶解，取部分纯化的酶切产物与序列为5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的MseI接头用T4连接酶16℃连接过夜，然后对连接产物进行PCR预扩增，用以富集DNA产物，PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5μL酶切-连接产物、终浓度为0.4μM、序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’的MseI-N引物、1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTP以及1U的TaqDNA聚合酶，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min进行20个循环，最后72℃延伸10min，反应产物用1％琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，PCR产物应该为一分步均匀的弥散带；3)杂合双链的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸将预扩增产物进行变性及复性，使其形成杂交双链，变性及复性条件为95℃2min，在5秒内将其从温度95℃降到85℃，速度为-2℃/秒，然后从85℃降到25℃，速率为-0.1℃/秒，4℃保存，复性产物用CELI对SNP位点进行酶切，酶切条件为10μL复性产物与20μL反应缓冲液，10mMHEPES7.5，10mMMgSO4，0.002％(w/v)TritonX-100，20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1单位CELI酶，45℃温浴25-35分钟，加入5μL0.15MEDTA，pH8，终止反应；酶切产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于Bst延伸，延伸条件为20mMTris-HCl，pH8.8，10mMKCl，10mM(NH4)2SO4，2mMMgSO4，0.1％吐温X-100，20nMdATP，20nMdGTP，20nMdCTP，13nMdTTP，7nMbiotin-dUTP，4单位BstDNA聚合酶，然后置于65℃温浴1小时；4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离1-2mg的包被有链亲和素的磁珠用300μLTEN100溶液在室温下洗涤3次，然后将其与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35分钟，磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，首先进行3次非严谨性洗脱使用400μL缓冲液TEN1000于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟；随后进行3次严谨性洗脱使用400μL0.2×SSC+0.1％SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清；最后再用1×SSC洗脱两次，除去SDS，加入50μLTE，吹打均匀，于95℃下水浴10分钟，期间不时搅动或者轻轻吹打均匀，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，经纯化后备用；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序将纯化后的5μLDNA液用于PCR扩增，条件与预扩增相同，PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后，按照常规方法让测序公司进行序列分析；6)SNP标记鉴定根据测序结果进行引物设计；将8-12个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增，克隆测序，每条序列需测序10个克隆，验证SNP位点，将单碱基差异出现频率在20％及以上的位点定义为SNP标记。全文摘要本发明建立了一种水产动物SNP标记筛选方法，可以解决现有SNP标记筛选技术中存在的效率低、成本高的问题。所采用的技术方案包括如下步骤1)基因组DNA提取；2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增；3)杂合双链的形成，CELI酶切及BstDNA聚合酶延伸；4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序；6)SNP位点鉴定。本发明的SNP标记分离新方法，可以在基因组信息未知的情况下，高效、大批量地随机分离SNP，有利于大量SNP的开发及其后续利用，在水产动物SNP标记筛选、种质鉴定、遗传多样性评价和分子育种等方面具有重大应用价值和推广前景。文档编号C12Q1/68GK101343667SQ20081013828公开日2009年1月14日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者徐建勇,陈松林申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所