专利名称：快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法
技术领域：
本发明属于贝类DNA分子遗传标记技术，具体涉及一种快速分离、筛选贝类微卫星标记的技术方法。
背景技术：
近年来飞速发展的分子标记技术，尤其是以PCR为基础的分子标记的广泛应用，为个体的遗传特征和种群遗传结构等分子遗传学研究提供了有力的工具，其中具有代表性的标记系统——微卫星标记越来越受到青睐。微卫星(Microsatellite)，亦称简单串联重复序列(Simple Sequence Repeats，SSRs)，是指以少数几个核苷酸(多数为1～6个)为单位多次串联重复的DNA序列。由于微卫星DNA广泛存在于基因组中，并且极具多态性、稳定性高、特异性高、共显性遗传、检测快捷，引物序列公开发表，易于在各个实验室之间共用等优点，因此广泛地用于遗传疾病的诊断、遗传连锁图的构建、基因的定位与克隆、亲权分析、群体遗传多样性研究、种质鉴定、进化生物学研究等领域。
微卫星标记的应用一般需要经过以下四步1)获得微卫星序列，2)微卫星引物的设计与优化，3)PCR扩增目的DNA，4)用适当的手段检测扩增产物。其中第一步是限速步骤，同时也是最为复杂、最为耗时费力的步骤。自20世纪80年代中期微卫星标记开始受到广泛关注以来，人们大多采用传统的构建小型DNA文库、利用SSR探针筛选阳性克隆的方法。但这种方法效率较为低下，尤其是在微卫星含量不是很丰富的物种，这种现象表现的尤为明显。统计表明，在贝类中利用上述筛选方式得到的阳性克隆率仅为0.1～6.4％，平均1.96％。因此，传统的筛选方式造成了人力和物力的极大浪费。近年来，随着计算机和信息网络的发展，从公用数据库发表的序列中筛选微卫星DNA成为简单廉价的方式，但是大多数物种，尤其是研究起步较晚的海洋和水产生物，在公用数据库中的序列信息不足以满足筛选的需要或者根本没有任何序列信息。
不同的筛选方式以及其效率成为学者们关注和研究的热点，不同的学者亦试用不同的筛选力法和策略以提高筛选效率，国内外不同的学者和实验室也相继报道了包括杂交筛选法(Hybridization Selection)、FIASCO(Fast Isolation by AFLP of SequencesContaining Repeats)法和RAPD—微卫星探针Southern杂交法等方法，但在贝类应用中都存在着共同的缺点阳性克隆率较低，效率较为低下。本发明富集文库—菌落原位杂交快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法多种贝类应用时发现，稳定性和重复性极好，并且阳性克隆率可以达到100％，一次筛选可以获得上百甚至几百个位点。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，以弥补已有技术的不足。
本发明是按照以下步骤完成的1)提取贝类的基因组DNA，4℃冰箱保存备用；2)利用上述提取的DNA，用已有的AFLP方法或者限制性内切酶方法获得贝类基因组DNA片断，并构建富集文库；3)将富集文库中的含有插入片断的大肠杆菌菌落原位杂交，然后放射自显影确定阳性克隆；4)阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因组DNA。
本方法可靠性和重复性极好，并且阳性克隆率可以达到100％，一次筛选可以获得上百甚至几百个位点，可以在一周之内获得大量微卫星标记的有效的技术方法。
图1富集文库—菌落原位杂交快速分离、筛选贝类微卫星标记的技术方法的流程及原理示意图。
图2菌落原位杂交结果示图。其中黑色斑点为阳性克隆放射自显影留下的印记。
具体实施例方式1、提取贝类的基因组DNA，方法如下贝样活体解剖后取闭壳肌约0.1克，加入500μl STE裂解缓冲液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)、氯方/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10min。将核酸沉淀于管底。70％7醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100μl的无菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存。
2、富集文库的构建，方法如下
1)贝类基因组DNA片断获得。在构建富集文库时，贝类基因组DNA片断的获得可分别采用以下两种方法①AFLP片断的获得AFLP分析参考Vos等(1995)的方法。引物和接头由上海Sangon合成。EcoR I和Mse I各一个单位完全双酶切300ng基因组DNA，T4连接酶将酶切片段连上接头。PCR反应总体积为50μl，内含5μl连接产物，0.2mmol/L的引物(EOO，序列为5’-GACTGCGTACCAATTC-3’；MOO序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，2.5U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为25个循环，每个循环包括95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min。PCR结束后，10个PCR反应产物混合乙醇沉淀，加入20uL三蒸水，95℃变性5分钟待用。
亦可用以下方式获得贝类基因组DNA片断，即②限制性酶切片断的获得(以HaeIII为例，可根据基因组特点选择其它四碱基平端限制性内切酶)，具体方法为取约300ng栉孔扇贝总DNA，在20μl体系中用2个单位的限制性内切酶HaeIII酶切3个小时。酶切后T4连接酶连上接头，连接反应为30μl，其中含有酶切产物20μ1，接头(接头组成为21-mer5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3’和25-mer5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA-3’)50ng，1×T4连接缓冲液，T4连接酶2U，反应在16℃下反应12小时。连有接头的DNA经PCR扩增获得多个拷贝，PCR反应总体积为25μl，其中含有DNA片断的连接产物6μl，1μM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为25个循环，每个循环包括95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循环前预变性3min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min。PCR结束后，10个反应体系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95度变性5分钟待用。
2)基因组片断的富集。①杂交膜的准备取浓度为100μM的探针[以(GA)20和(CA)20为例]各0.5μl点在直径约为5mm的Hybond N+杂交膜上，空气中晾干后80℃烘烤2个小时固定探针。将固定好探针的Hybond N+膜放在杂交液[50％(V/V)的甲酰胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸钠(pH＝7.0)]中37℃预杂交72小时。然后将膜在1％的SDS中沸浴10min，去除没有结合好的探针。②杂交将变性好的基因组DNA片断加入到600μl的杂交液中，加入预杂交好的Hybond N+膜，37℃杂交1-2天。③洗脱洗膜采用如下严谨度用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在60℃下水浴下洗脱2次，每次15分钟；用600uL的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在62℃下水浴30分钟；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在65℃下水浴30分钟洗脱杂交片断。将500μl的洗脱液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的异丙醇，-20℃冷冻2个小时以上(或者过夜)，4℃12,000转离心20分钟，将沉淀用-20℃预冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水。
3)富集产物的克隆取洗脱片断溶液2μl作为恢复PCR(Recovery PCR)的模板，反应为20个循环，最后72℃延伸30分钟，其它PCR反应成分和条件同3.1)①和3.1)②。反应结束后乙醇沉淀，三蒸水溶解。富集DNA片断的克降采用Takara公司的pMD18-T载体试剂盒，连接反应参照Takara公司pMD18-T载体试剂盒说明。将连接好的产物转化至大肠杆菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固体LB平板上。
3、菌落原位杂交筛选阳性克隆的方法为1)菌落重排与转膜将转化后的白斑重新挑起，有序的重排接种至新的固体LB培养基上，37℃培养至合适大小。培养好菌落转至NC膜上(Immobilon-NC TransferMembranes，Millipore)，然后膜在空气中干燥10分钟。然后NC膜放入变性缓冲液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中变性7分钟，空气干燥10分钟。中和缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分钟。将中和好的NC膜空气干燥后放入80℃烘烤2小时固定质粒。
2)探针的标记探针的标记采用Amersham公司的Gene Images 3’-OligolabellingModule试剂盒。标记反应在37℃下标记70分钟，80uL反应体系中含有100μM的探针1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×缓冲液(Cacodylate Buffer)，32U的末端转移酶(Terminal Transferase)。标记好的探针放入-20℃冰箱中备用。
3)杂交杂交系统采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Kit试剂盒。将烘烤好的NC膜放入杂交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀释20倍的液体封阻(Liquid Block，试剂盒提供)，0.5％(W/V)分子量为500000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500000)]中预杂交1小时。然后将杂交液去除，加入足量的杂交液和标记好的探针，使杂交液的量为0.125-0.25mL/cm2，探针的浓度为5-10ng/mL，37度振荡杂交过夜。
4)洗脱将杂交过夜的NC膜放在5×SSC，0.5％ SDS的洗脱液中室温振荡洗脱2次，每次5分钟。然后在含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脱液中37℃振荡洗脱15分钟，含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脱液中42℃振荡洗脱15分钟。
5)抗体—抗原反应于放射自显影将膜放入到含有稀释20倍的液体封阻中封阻至少30分钟，然后将膜放入到抗体液中反应30分钟，抗体液含有1000倍稀释的抗体(试剂盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH＝7.5)。处理完NC膜后，在暗室中压上X-胶片，感光1h，进行显影及定影。
6)阳性克隆的确定以及阳性克隆的测序按照原先确定的方位，将X—胶片、硝酸纤维素膜、平板三者进行对照，在相同的位置上挑出阳性克隆，摇菌送商业公司用M13引物测序。
4、在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。引物设计采用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物设计采用以下严谨度(1)引物长度为19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度45-65度；(4)预期PCR产物长度为100-250bp。
下面以栉孔扇贝为例通过实施例详细叙述本发明1、DNA的提取取栉孔扇贝闭壳肌约0.1克，加入500μlSTE裂解缓冲液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl 10％的SDS(10％)，以及5μl 20mg/ml的蛋白酶K，56度处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10分钟。将核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100μl的无菌水和少量RNase A，4度直到DNA全部溶解，紫外分光光度计定量备用。
2.富集文库的构建对于富集文库的构建，本发明叙述2种不同的方法AFLP片断富集文库和Hae III限制性酶切片断富集文库。
(1)AFLP片断的获得AFLP分析参考Vos等(1995)的方法。引物和接头由上海Sangon合成。EcoR I和Mse I各一个单位完全双酶切300ng基因组DNA，T4连接酶将酶切片段连上接头。PCR反应总体积为50μl，内含5μl连接产物，0.2mmol/L的引物(EOO和MOO)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，2.5U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为25个循环，每个循环包括95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后次循环结束后72℃再延伸5min。PCR结束后10个反应体系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃变性5分钟待用。
(2)限制性酶切片断的获得取约300ng栉孔扇贝总DNA，在20μl体系中用2个单位的限制性内切酶HaeIII酶切3个小时。酶切后T4连接酶连上接头，连接反应为30μl，其中含有酶切产物20μl，接头(接头组成为21-mer5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA-3’和5’磷酸化的25-mer5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA-3’)50ng，1×T4连接缓冲液，T4连接酶2U，反应在16℃下反应12小时。连有接头的DNA经PCR扩增获得多个拷贝，PCR反应总体积为25μl，其中含有DNA片断的连接产物6μl，1μM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为25个循环，每个循环包括95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循环前预变性3min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min。PCR结束后，10个反应体系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃变性5分钟待用。
(3)Hybond N+膜的制备取浓度为100μM的探针(GA)20和(CA)20各0.5μl点在直径约为5mm的Hybond N+杂交膜上，空气中晾干后80℃烘烤2个小时固定探针。
(4)预杂交将固定好探针的Hybond N+膜放在杂交液[50％(V/V)的甲酰胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸钠(pH＝7.0)]中37℃预杂交3天。然后将膜在1％的SDS中沸浴10min，去除没有结合好的探针。
(5)杂交和洗膜将变性好的PCR产物加到600μl的杂交液中，加入预杂交好的Hybond N+膜，37℃杂交1-2天。洗膜采用如下严谨度1)用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在60℃下洗脱2次，每次15分钟；2)用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在62℃下水浴30分钟；3)用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在65℃下水浴30分钟洗脱杂交片断。将500μl的洗脱液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的异丙醇，-20℃冷冻2个小时以上(或者过夜)，4℃12,000转离心20分钟，将沉淀用—20℃预冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水。
(6)克隆富集片度取洗脱片断溶液2μl作为恢复PCR(Recovery PGR)的模板，反应为20个循环，最后72℃延伸30分钟。反应结束后乙醇沉淀，三蒸水溶解。富集DNA片断的克隆采用Takara公司的pMD18-T载体试剂盒，连接反应参照Takara公司pMD18-T载体试剂盒说明。将连接好的产物转化至大肠杆菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固体LB平板上。
3菌落原位杂交(1)菌落转膜将转化后的白斑重新挑起，有序的重排接种至新的固体LB培养基上，37℃培养至合适大小。培养好菌落转至NC膜上(Immobilon-NC Transfer Membranes，Millipore)，然后膜在空气中干燥10分钟。然后NC膜放入变性缓冲液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中变性7分钟，空气干燥10分钟。中和缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分钟。将中和好的NC膜空气干燥后放入80℃烘烤2小时固定质粒。
(2)探针的标记探针的标记采用Amersham公司的Gene Images 3’-Oligolabelling Module试剂盒。标记反应在37℃下标记70分钟，80μl反应体系中含有100μM的探针1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×缓冲液(Cacodylate Buffer)，32U的末端转移酶(Terminal Transferase)。标记好的探针放入-20℃冰箱中备用。
(3)杂交杂交系统采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection Kit试剂盒。将烘烤好的NC膜放入杂交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀释20倍的液体封阻(Liquid Block，试剂盒提供)，0.5％(W/V)分子量为500,000的多聚硫酸葡聚糖(Dextran Sulphate，MW 500,000)]中预杂交1小时。然后将杂交液去除，加入足量的杂交液和标记好的探针，使杂交液的量为0.125-0.25mL/cm2，探针的浓度为5-10ng/mL，37度振荡杂交过夜。
(4)洗膜将杂交过夜的NC膜放在5×SSC，0.5％ SDS的洗脱液中室温振荡洗脱2次，每次5分钟。然后在含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脱液中37℃振荡洗脱15分钟，含有1×SSC，0.5％ SDS的洗脱液中42℃振荡洗脱15分钟。
(5)抗体抗原反应及X—射线自显影将膜放入到含有稀释20倍的液体封阻中封阻至少30分钟，然后将膜放入到抗体液中反应30分钟，抗体液含有1000倍稀释的抗体(试剂盒提供)，0.5％(W/V)小牛血清，0.4M NaCl，0.1M Tirs-HCl(pH＝7.5)。处理完NC膜后，在暗室中压上X-胶片，感光1h，进行显影及定影。
(6)阳性克隆的挑选按照原先确定的方位，将X—胶片、硝酸纤维素膜、平板三者进行对照，在相同的位置上挑出阳性克隆，摇菌提取质粒测序。
4、阳性克隆测序将阳性克隆用液体LB培养基摇起后送商业公司用M13引物测定序列5、引物设计在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。引物设计采用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物设计采用以下严谨度(1)引物长度为19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度45-65度；(4)预期PCR产物长度为100-250bp。
通过上述方法，一次共获得栉孔扇贝的阳性克隆324个，测序结果显示全部324个阳性克隆全部含有微卫星重复，其中286个克隆可以设计引物。因此，充分验证了本方法能快速分离、筛选贝类微卫星标记，即可以实现在短时间内获得大量微卫星标记的快速有效的方法。
权利要求
1.快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，其特征在于操作步骤1)提取贝类的基因组DNA 4℃冰箱保存备用；2)富集文库的构建；3)菌落原位杂交；4)阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的富集文库-菌落原位杂交快速分离、筛选贝类微卫星标记的技术方法，其特征在于提取贝类的基因组DNA，步骤为贝样活体解剖后取闭壳肌约0.1克，加入500μl STE裂解缓冲液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-HCl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50μl SDS(10％)，以及5μl的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250μl)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250μl)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500μl)抽提1次。取上清液，加入50μl NaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10min。将核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000μl)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100μl的无菌水和少量RNase A，4℃冰箱保存。
3.根据权利要求1所述的快速分离、筛选贝类微卫星标记的技术方法，其特征在于富集文库的构建。1)贝类基因组DNA片断获得在构建富集文库时，AFLP片断获得的方法为EcoRI和Mse I各一个单位完全双酶切300ng基因组DNA，T4连接酶将酶切片段连上接头。PCR反应总体积为50μl，内含5μl连接产物，0.2mmol/L的引物(E00，序列为GACTGCGTACCAATTC；M00序列为GATGAGTCCTGAGTAA)，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，2.5U的Taq DNA聚合酶；PCR反应为25个循环，每个循环包括95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min；PCR反应结束后，10个PCR反应产物混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95℃变性5分钟待用。2)如权利要求3所述的贝类基因组DNA片断获得，限制性酶切片断的获得的方法为取约300ng栉孔扇贝总DNA，在20μl体系中用2个单位的限制性内切酶HaeIII酶切3个小时。酶切后T4连接酶连上接头，连接反应为30μl，其中含有酶切产物20μl，接头(接头组成为21-mer5’-CTCTTGCTTGAATTCGGACTA和5’磷酸化的25-mer5’-pTAGTCCGAATTCAAGCAAGAGCACA)50ng，1×T4连接缓冲液，T4连接酶6Weiss U，反应在16℃下反应12小时。连有接头的DNA经PCR扩增获得多个拷贝，PCR反应总体积为25μl，其中含有DNA片断的连接产物6μl，1mM的21-mer引物，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为25个循环，每个循环包括95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min；首次循环前预变性3min；最后一次循环结束后72℃再延伸5min。PCR结束后，10个反应体系混合乙醇沉淀，加入20μl三蒸水，95度变性5分钟待用。3)基因组片断的富集。①杂交膜的准备取浓度为100mM的探针(GA)20和(CA)20各0.5μl点在直径约为5mm的Hybond N+杂交膜上，空气中晾干后80℃烘烤2个小时固定探针。将固定好探针的Hybond N+膜放在杂交液[50％(V/V)的甲酰胺、7％(W/V)的SDS、5×SSC、50mM的磷酸钠(pH＝7.0)]中37℃预杂交72小时。然后将膜在1％的SDS中沸浴10分钟，去除没有结合好的探针。②杂交将变性好的基因组DNA片断加入到600μl的杂交液中，加入预杂交好的Hybond N+膜，37℃杂交1-2天。③洗脱洗膜采用如下严谨度用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在60℃下水浴下洗脱2次，每次15分钟；用600μl的2×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在62℃下水浴30分钟；用500μl的0.5×SSC，1％SDS(W/V)洗脱液在65℃下水浴30分钟洗脱杂交片断。再将500μ1的洗脱液中加入100μl的7.5M NH4Ac和600μl的异丙醇，-20℃冷冻2个小时以上，4℃12,000转离心20分钟，将沉淀用-20℃预冷的75％乙醇洗2次，溶于20μl的三蒸水；4)富集产物的克隆取洗脱片断溶液2μl作为恢复PCR(Recovery PCR)的模板，反应为20个循环，最后72℃延伸30分钟；PCR反应结束后乙醇沉淀，三蒸水溶解。富集DNA片断的克隆T载体。将连接好的产物转化至大肠杆菌DH5a菌株中，涂于含有X-gal的固体LA平板上。
4.根据权利要求1所述的快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，其特征在于菌落原位杂交筛选阳性克隆的步骤如下1)菌落重排与转膜将转化后的白斑重新挑起，有序的重排接种至新的固体LB培养基上，37℃培养；培养好菌落转至硝酸纤维素膜上，然后膜在空气中干燥10分钟。然后硝酸纤维素膜放入变性缓冲液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)中变性7分钟，空气干燥10分钟。中和缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH 7.2；1.5M NaCl；1mM EDTA，，pH 8.0)中和2次，每次5分钟。将中和好的硝酸纤维素膜空气干燥后放入80℃烘烤2小时固定。2)探针的标记探针的标记采用Amersham公司的Gene Images 3’-Oligolabelling试剂盒。标记反应在37℃下标记70分钟，80μl反应体系中含有100mM的探针1μl，Fluorescein-11-dUTP 5μl，1×缓冲液(Cacodylate Buffer)，32U的末端转移酶(Terminal Transferase)。标记好的探针放入-20℃冰箱中备用。3)杂交杂交系统采用Amersham公司的Gene Images ECL Detection试剂盒。将烘烤好的硝酸纤维素膜放入杂交液[5×SSC，0.1％(W/V)SDS，稀释20倍的封阻液，0.5％(W/V)的多聚硫酸葡聚糖]中预杂交1小时。然后将杂交液去除，加入足量的杂交液和标记好的探针，使杂交液的量为0.125-0.25mL/cm2，探针的浓度为5-10ng/mL，37度振荡杂交过夜。4)洗脱将杂交过夜的硝酸纤维素膜放在5×SSC，0.5％SDS的洗脱液中室温振荡洗脱2次，每次5分钟。然后在含有1×SSC，0.5％SDS的洗脱液中37℃振荡洗脱15分钟，含有1×SSC，0.5％SDS的洗脱液中42℃振荡洗脱15分钟。5)抗体-抗原反应于放射自显影将膜放入到抗体液中反应30分钟后，在暗室中压上X光胶片，感光1小时后显影及定影。6)阳性克隆的确定以及阳性克隆的测序按照原先确定的方位，将X-胶片、硝酸纤维素膜、平板三者进行对照，在相同的位置上挑出阳性克隆，用M13引物测序。
5.根据权利要求1所述的快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，其特征在于在测序的基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。引物设计采用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物设计采用以下严谨度(1)引物长度为19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度45-65度；(4)预期PCR产物长度为100-250bp。
全文摘要
本发明涉及一种快速分离、筛选贝类微卫星标记的方法，首先提取贝类的基因组DNA，4℃冰箱保存备用；然后利用上述提取的DNA，用已有的AFLP方法或者限制性内切酶方法获得贝类基因组DNA片断，并构建富集文库；接着将富集文库中的含有插入片断的大肠杆菌菌落原位杂交，然后放射自显影确定阳性克隆；最后阳性克隆测序并根据微卫星侧翼序列设计引物扩增基因组DNA。本方法可靠性和重复性极好，并且阳性克隆率可以达到100％，一次筛选可以获得上百甚至几百个位点，可以在一周之内获得大量微卫星标记的有效的技术方法。
文档编号C12N15/12GK1793357SQ20051004479
公开日2006年6月28日 申请日期2005年9月23日 优先权日2005年9月23日
发明者胡景杰, 包振民, 汪小龙, 战爱斌, 惠敏, 陆维 申请人:中国海洋大学