一种利用重组钝齿棒杆菌生产黑色素的方法
【专利摘要】一株产酪氨酸酶重组钝齿棒杆菌的构建及其在黑色素生产中的应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明通过本实验室前期筛选得到的被命名为Streptomyces kathirae SC-1的菌株，利用分子技术克隆了以来自Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶基因(melC1C2)，构建重组表达载体pXMJ19-melC1C2，并将其电击转化到C.crenatum SYPA5-5，成功构建了基因工程菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-melC1C2。对构建的基因工程菌进行酶活测定，发现重组菌的酶活为61.5U/ml，而原始菌株C.crenatum SYPA5-5没有酶活。以L-酪氨酸为底物进行全细胞转化，黑色素产量为3.49g/L。本发明为首次将酪氨酸酶克隆到重组钝齿棒杆菌并用于黑色素的生产。CCTCC NO: M 201243220121103
【专利说明】一种利用重组钝齿棒杆菌生产黑色素的方法
【技术领域】
[0001] -株产酪氨酸酶的重组钝齿棒杆菌的构建及其在黑色素生成中的应用，本发明属 于基因工程和酶工程领域。具体涉及一种酪氨酸酶基因工程菌的构建及其应用于黑色素的 生物转化。 技术背景
[0002] 黑色素广泛存在于动物、植物和微生物中。它在工业和农业上广泛应用，可以作为 防晒霜，天然染发剂成分，阳离子的螯合剂，非晶态半导体和生物农药的光保护剂。此外，在 医学领域的应用于清除自由基，抗辐射，防止磷脂脂质体的氧化，也用于治疗黑色素缺乏的 一些相关疾病。然而许多合成色素对人体有一定的危害，有的甚至会致癌，因此天然黑色素 的安全性越来越受到人们的关注。
[0003] 目前，黑色素有从黑玉米，黑木耳，乌骨鸡等动植物中提取，从动物或植物中提取 的黑色素，虽然没有对人体的危害，但由于繁琐的生产成本较高，不能大规模生产。微生物 资源非常丰富，利用微生物发酵产黑色素有巨大的优势，生产工艺简单，操作方便，此外，由 微生物产生的黑色素无毒，无害，稳定性更好。酪氨酸酶是（E. C. 1. 14. 18. 1)是黑色素合成 过程中的关键酶。酪氨酸酶是一种含铜酶，具有单酚和双酚活性的酶，催化L-酪氨酸经过 左旋多巴（L-二羟基苯丙氨酸）合成多巴醌，然后经过一系列的自然氧化，最后生成黑色 素。目前国内外研宄表明某些细菌具有生产黑色素的能力，主要包括弧菌属，根瘤菌，链霉 菌和大肠杆菌工程菌株等。
[0004] 本发明首次报道了来自于本实验室筛选到的一株被命名Streptomyces kathirae SC-I的菌株的酪氨酸酶基因，通过质粒pXMJ19,实现了在钝齿棒状杆菌SYPA 5-5中的表 达，并且在本实验室已经研宄了酶学性质的基础上，以酪氨酸为底物进行生物转化生成黑 色素，产量达到3. 49g/l。钝齿棒状杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，发酵周期短，在医药 等领域具有潜在的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供：一株产酪氨酸酶重组钝齿棒杆菌的构建及其黑色素的生 物转化。
[0006] 本发明的主要研宄内容：本发明利用分子技术克隆了来自Streptomyces kathirae SC-I的酪氨酸酶基因（melClC2)，构建重组表达载体pXMJ19-melClC2,并 将其电击转化到C. crenatum SYPA5-5，成功构建了基因工程菌C. crenatum SYPA5-5/ PXMJ19-melClC2。对构建的基因工程菌进行酶活测定，发现重组菌的酪氨酸酶活为61. 5U/ ml，而原始菌株C. crenatum SYPA5-5没有酶活。本发明首次将重组钝齿棒杆菌应用于黑色 素的生产。
【具体实施方式】
[0007] 实施例1 :目的基因的扩增及重组钝齿棒杆菌的构建
[0008] 质粒pXMJ19-melClC2构建具体过程如下：
[0009] 首先，以菌株Streptomyces kathirae SC-1的染色体DNA为模板，利用引物Pl和 P2,通过PCR技术扩增得到一段1230bp大小的核苷酸序列如SEQ所示的melClC2基因，先 与PMD18-T vector连接，获得该基因的大量克隆，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌， 重组质粒经BamHI/Kpnl酶切释放出大小为2. 7kb和I. 2kb的基因条带，表明重组质粒构 建成功。质粒pMD18-T-melClC2和pXMJ19经BamHI/Kpnl双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接 酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E. coli JM109感受态细胞，使用氯霉素抗性 平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamHI/Kpnl双酶切后后释放出大小 为6. 6kb和I. 2kb的基因片段，表明该重组质粒pXMJ19-melClC2构建成功。将经验证构建 成功的重组质粒pXMJ19-melClC2用电击转化法转化至钝齿棒杆菌。挑取在具有氯霉素抗 生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证，结果表明重组钝齿棒杆菌 C. crenatum SYPA5-5/pXMJ19_melClC2构建成功。对原始菌以及重组菌胞内蛋白表达分析 可以看出，基因 melClC2在重组菌中成功实现表达。
[0010] 以Streptomyces kathirae SC-I的染色体DNA为模板，设计两条引物，PCR扩增 引物设计如下：
[0011] Pl :5' -ATTCGCGGATCCAAAGGAGG-3' (BamHI)
[0012] P2 :5' -ACGTCTGAGGTACCCCGAATC-3' (KpnI)
[0013] 实施例2:
[0014] 重组菌株酶活测定
[0015] (1)酶活测定缓冲体系
[0016] 50mM 磷酸钠缓冲液 pH6. 2, IOmM 左旋多巴，15yMCuS04。
[0017] ⑵酶活测定
[0018] 实施例2 :构建的重组菌a crenatum SYPA5-5/pXMJ19-melClC2与原始菌株 C. crenatum SYPA5-5分别接种于IOmL含氯霉素的LBG (LB培养基添加5%的葡萄糖）培养 基中，30°C振荡培养过夜，次日按2%的接种量转接于50ml/250ml LBG培养基中，30°C培养 约3?4h，当OD6c?达到0. 5左右，加入IPTG (终浓度为0. 8mM) 30°C诱导12h，取发酵液于 4°C，lOOOOr/min离心lOmin，pH7. 0的磷酸钠缓冲液清洗2次，最后悬浮在5mlpH7. 0的磷 酸钠缓冲液中，超声波破碎处理制备粗酶液。酶活测定缓冲体系4. 9ml，加入100 μ 1的粗酶 液，在45°C水浴摇床反应10分钟，测量波长为475nm下的OD值，以酶活缓冲体系作为空白 对照。结果表明，重组菌酪氨酸酶酶活约为61. 5U/ml，而原始菌株C. crenatum SYPA5-5没 有酶活。
[0019] 实施例3 :重组菌株a crenatum SYPA5-5/pXMJ19-melClC2全细胞转化酪氨酸生 产黑色素
[0020] 反应体系：2mg/ml酪氨酸，50mM磷酸钠缓冲液（ρΗ6· 2)，15 μ MCuS04。
[0021] 将收集的菌体加入含100ml反应体系的500ml摇瓶中，最适反应条件下转化60h， 每12h取样一次，用紫外分光光度计测量0D_，测定黑色素的产量。
【权利要求】
1. 一种重组表达载体pXMJ19-melClC2的构建，其特征是： 利用PCR扩增技术中得到来源于Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶基因 (melClC2)的完整表达基因片段，与克隆载体pMD-18T相连，获得该基因的大量克隆，经双 酶切，片段纯化后与表达PXMJ19连接，再转化到大肠杆菌JM109中得到稳定的重组质粒 pXMJ19-melClC2〇
2. -种重组钝齿棒杆菌，其特征是： 将权利要求1中构建的重组载体pXMJ19-melClC2,利用电击转化法转化到钝齿 棒杆菌SYPA5-5，酷氛酸酶基因（melClC2)在重组纯齿棒杆菌C. crenatum SYPA5-5/ pXMJ19-melClC2中成功表达。
3. 将权利要求2所述的重组钝齿棒杆菌产酪氨酸酶的方法，其特征是： 将该菌株以2%接种量接种于5〇11^1^6培养基中，培养3?411后，加入1?了6诱导1211 后离心收集菌体，用PBS(pH7.0)缓冲液洗涤两次，最后用5ml的PBS(pH7.0)缓冲液悬浮， 超声波破碎细胞，酪氨酸酶酶活约为61. 5U/mL，而原始菌株C. crenatum SYPA5-5没有酶 活。
4. 将权利要求3所述重组钝齿棒杆菌发酵产的酪氨酸酶，进行全细胞转化成黑色素， 其特征是：将权利要求3发酵产酪氨酸酶，PBS(pH7.0)缓冲液收集，洗涤，悬浮菌体后，分别 以lmg/mL，2mg/mL，3mg/mL，4mg/mL的L-酪氨酸为底物，并加入15uM CuS04催化反应，最后 用pH6. 2PBS缓冲液把转化反应混合液的总体积补齐到100mL。
【文档编号】C12R1/465GK104480137SQ201410748908
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月9日 优先权日:2014年12月9日
【发明者】饶志明, 胡桂元, 郭静, 杨套伟, 徐美娟, 张显 申请人:江南大学