Wnt5-α肽衍生物用于治疗黑色素瘤和胃癌的用途的制作方法

专利名称：Wnt5-α肽衍生物用于治疗黑色素瘤和胃癌的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些Wnt5-a衍生物的某些无支链的氨基甲酸酯衍生物以及通过使 用这些Wnt5-a衍生物治疗黑色素瘤。
背景技术：
黑色素瘤是黑色素细胞的一种恶性肿瘤，它主要发现于皮肤中并且也发现于肠和 眼睛中。它是较罕见类型的皮肤癌之一，但引起大多数的皮肤癌相关的死亡。恶性黑色素 瘤是一种潜在严重类型的皮肤癌。这是由于色素细胞(称为黑色素细胞)的不受控制的生 长造成的。尽管进行了多年的深入的实验室以及临床研究，唯一有效的治疗是在该原发性 肿瘤达到超过Imm厚度之前将它手术切除。每年全世界诊断约160，000个新的黑色素瘤病例，并且在男性以及高加索人种中 频率更高。生活在阳光充足的气候下的高加索人群比其他的人群更常见这种疾病。根据 WHO报告，全世界每年发生约48，000例黑色素瘤相关死亡。恶性黑色素瘤占所有与皮肤癌 相关的死亡的75%。该治疗包括手术去除肿瘤；辅助剂治疗；化疗以及免疫治疗、或放疗。发展成黑色素瘤的风险取决于两类因素内部的和环境的。总体上“内部的”因素 是个体的家族史以及遗传的基因型，而最相关的环境因素是日照。流行病学研究表明暴露 于紫外线辐射(UVA以及UVB)是黑色素瘤发展的主要促成因素之一。紫外辐射造成对细胞 的DNA的损伤，典型地胸腺嘧啶二聚作用(thymine demonization)，当不进行修复时它可 能生产突变。当细胞分裂时，这些突变被增殖成新世代的细胞。如果这些突变发生在癌基 因或肿瘤抑制基因中，在这些携带突变的细胞中有丝分裂的速率可能变得不受控制，导致 肿瘤的形成。偶尔的极端日照(导致“晒伤”)是与黑色素瘤相关的原因。在确定风险中可能的重要的要素包括日照的强度和持续时间，日照发生时所处的 年纪，以及皮肤色素沉着的程度。与在成人时期的暴露相比，在孩童时期的暴露是更重要的 风险因素。这在澳大利亚的迁移研究中可以看到，其中如果人们作为一个成人迁移到澳大 利亚，他们倾向于保留他们出生国家的风险预测。具有起疱或脱皮晒伤的个体(特别是在 寿命的第一个二十年中)具有显著地更大的患黑色素瘤风险。这并不意味着晒伤是黑色素 瘤的原因。相反它仅仅是统计上相关的。该原因是过量的紫外线暴露。已经显示防晒剂一 虽然预防晒伤一不能保护避免黑色素瘤。许多研究人员宣称防晒剂甚至可能增加黑色素瘤 的风险。浅肤色以及红头发的人、具有多个非典型痣或结构不良痣的人以及生来具有先天 性巨大黑素细胞痣的人处于增加的风险下。近些年来黑色素瘤的发病率增加，但是并不清楚行为方面、环境方面、或在早期检 测方面涉及什么程度的改变。为了理解防晒剂如何可以减少晒伤并且同时引起黑色素瘤，有必要将直接DNA损 伤与间接DNA损伤进行区别。遗传分析已经显示92%的所有黑色素瘤是由间接DNA损伤引 起的。家族性黑色素瘤是遗传异质性的，并且在染色体臂lp、9p以及12q上已经鉴定出家 族性黑色素瘤的基因座。
黑色素瘤的体征和症状是■不均勻的皮肤损伤。■损伤边缘是不规则的。■黑色素瘤通常具有多种颜色。■与较小的痣相比大于5mm的痣更可能是黑色素瘤。痣或损伤的发展(即改变)可以是一个暗示，即该损伤正在变成恶性的。皮肤中最常见类型的黑色素瘤是■浅表扩散性黑色素瘤(SSM)■结节性黑色素瘤■肢端雀斑痣样黑色素瘤■恶性雀斑样痣(黑色素瘤)以上类型中任何一种可以生成黑色素(并且在颜色上是暗的)或不生成黑色素 (并且是无黑色素的一不是暗的)。类似地，任何亚型可以显示硬性纤维组织增生(具有趋 向神经性的致密的纤维反应)，它是损伤性行为的标志物并且具有局部复发的倾向。在别处透明细胞肉瘤(软组织的黑色素瘤)粘膜黑色素瘤葡萄膜黑色素瘤影响预后的特征是以毫米计的肿瘤厚度(Breslow深度)、相对于皮肤结构的深度 (Clark水平)、黑色素瘤的类型、溃疡的存在、淋巴/外周神经侵袭的存在、肿瘤浸润淋巴细 胞的存在(如果存在，预后是更好的)、损伤的位置、卫星损伤的存在、以及局部或远处转移 的存在。某些类型的黑色素瘤具有更差的预后，但这由它们的厚度来解释。有趣的是，在分 级时与无局部转移的深的黑色素瘤相比，甚至具有淋巴结转移的更少侵袭性黑色素瘤具有 更好的预后。局部复发倾向于表现类似于原发物的行为除非它们处于局部扩大切除的位置 处(与分期切除或环钻/剃削切除相对)，因为这些复发倾向于表明淋巴的侵袭。当黑色素瘤已经扩散到淋巴结时，最重要的因素之一是恶性淋巴结的数量。淋巴 结中恶性的程度也是重要的；与大的转移相比小转移(其中恶性仅仅是微观的)具有更好 的预后。在一些病例中，仅能够通过特异性染色检测到小的转移，并且如果仅通过较少使用 的测试(称为聚合酶链式反应(PCR))才可检出恶性，预后是更好的。大的转移(其中恶性 是临床地清楚的)(在一些病例中癌完全替换了淋巴结)具有非常差的预后，并且如果淋巴 结是缠绕的或如果存在结外侵犯，预后仍然是较差的。当存在远端转移时，总体上癌症被认为是不可治愈的。五年存活率是小于10%。 中值存活率是6到12个月。治疗是减轻的，集中在延长生命和生活质量。在一些病例中， 具有转移性黑色素瘤的患者可以活数月或甚至数年(取决于治疗的进攻性)。转移到皮肤 以及肺具有较好的预后。转移到脑、骨以及肝与较差的预后相关联。黑色素瘤出现在不同阶段，这些阶段表示为阶段0(它是原位具有100%存活率的 黑色素瘤)，阶段I/II (它是具有85% -95%存活率的侵袭性黑色素瘤)，阶段II (它是具 有40% -85%存活率的高风险的黑色素瘤)，阶段III (它是具有25% -60%存活率的区域性转移)，阶段IV(它是具有9% -15%存活率的远端转移)(存活率是基于AJCC使用适当 的治疗的5年存活)。外科手术是用于治疗局部性皮肤黑色素瘤的第一选择。根据该阶段，还进行前哨 淋巴结活检，虽然围绕这个步骤的试验性证据存在争议。从多学科途径进行晚期恶性黑色 素瘤的治疗。高风险的黑色素瘤可能要求辅助剂治疗。在美国，在其他方面处于良好健康状态 的大多数患者将开始长达一年的高剂量干扰素治疗，该高剂量干扰素治疗具有严重的副作 用但可以改善患者的预后。目前这个说法不被所有的研究所支持，并且在欧洲干扰素通常 不在临床试验的范围之外使用。使用不同的化疗试剂，包括达卡巴嗪(也称为DTIC)，通过不同的中心使用免疫疗 法(用白细胞介素_2(IL-2)或干扰素(IFN))以及局部灌注。它们可能偶尔显示引人注目 的成功，但是在转移性黑色素瘤方面全面的成功是相当有限的。ILKProleukin. )是在 20年中被批准用于治疗转移性黑色素瘤的第一个新的疗法。研究证实IL-2提供了在这个 疾病中完全的并且长期的缓和的可能性，虽然仅在少百分比的患者中。许多新的试剂以及 新的途径正在评估并且显示大有前途。对于具有局部或区域性的晚期黑色素瘤的患者或对于具有不可切除的远端转移 的患者，在手术切除后经常使用放疗。它可以减少局部复发的速率但不能延长存活时间。已经广泛地研究了黑色素瘤进展的分子背景，并且基因表达分析已经鉴定了与较 少侵袭性黑色素瘤或良性痣相对以黑色素瘤的侵袭性形式差别地表达的几个基因，一个这 样的基因是Wnt-^i(Bittner et al.，2000)。Wnt-^i是一种分泌的、富含半胱氨酸的蛋白， 它经历了后翻译的糖基化以及脂修饰(Kurayoshi et al.，2007)。在它分泌之后，Wnt-fe 通过结合到其受体上以自分泌或旁分泌的方式起作用，在恶性黑色素瘤中Wnt-fe显示结 合该G蛋白偶联的受体Frizzled-5(Weeraratna，2002)。它被认为是一个非经典的Wnt 蛋白，表明它不是主要地经由联蛋白信号传导途径发挥作用的。在过去的几年期间 已经在不同类型的癌症上研究了 Wnt-fe在癌进展中的重要性。Wnt-fe已经显示在乳癌、 甲状腺癌、淋巴瘤、成神经细胞瘤、结肠癌以及肝癌中具有肿瘤抑制活性(J8nsson 2002 ； Kremenevskaja 2005 ；Liang 2003 ；Blanc 2005 ；Dejmek 2005 ；Liu 2008)。 M胃， ^ 类型的癌症中(像恶性黑色素瘤以及胃癌)已经显示Wnt-fe的表达增加促进了肿瘤进展 (Bittner et al.,2000,Weeraratna, 2002 ；Lewis et al. ,2005 ；Kurayoshi et al.，2006)o 基于这些结果人们可以得出结论，即在某些癌中模拟Wnt-fe的作用的一种物质可以用于 抑制肿瘤进展(Safholm, 2006)，而在其他癌中，像恶性黑色素瘤，可能需要一种Wnt-fe介 导的肿瘤进展的抑制剂。关于Wnt-fe蛋白在恶性黑色素瘤中的功能性下游影响，仅有有限的知识可供使 用(ffeeraratna et al. ,2002 ；Dissanayake et al. ,2007) 在从黑色素瘤组织样品得到 的细胞中，Wnt-fe蛋白的增加的表达显示诱导细胞粘附、迁移以及侵袭的增加。在相同的 研究中，诸位作者还显示了 tot-fe的影响是经由Frizzled-5受体和一个下游蛋白激酶 C(PKC)信号介导的(Weeraratna et al.，2002)。在一份更近的文章中，诸位作者进一步显 示Wnt-fe经由一个PKC诱导的Snail的表达诱导了上皮-间质转化(EMT)，Snail的表达 导致E-钙黏附蛋白的水平降低但是波形蛋白的水平增加(Dissanayake et al.，2007)。然而，关于Wnt-fe在恶性黑色素瘤中表达增加的实际原因的问题仍然保留。在由Hoek及同事们基于DNA微阵列分析的最近的研究中，表明转化生长因 子-β (TGF-β)在Wnt-^i基因表达的调节方面起决定性的作用(Hoek et al.，2006)。足 够有趣的是，TGF-β超家族的成员(Van Belle et al. , 1996)以及骨形态发生蛋白(BMP; Rothhammer et al. ,2005)展示了在恶性黑色素瘤中增加的表达。此外，TGF-β的至少一 些功能性影响也与Wnt-^i重叠。更确切地说，如以前提到的Wnt-^i —样，TGF-β 1诱导了 EMT以及在黑色素瘤细胞迁移及转移潜能方面的增加(Janji et al. , 1999 ；Gouon et al., 1996)。最后，Wnt-5a-和TGF-β 1两者都介导了 E-钙黏附蛋白、某些整联蛋白以及基质金 属蛋白酶的细胞蛋白水平的改变(Dissanayake et al.，2007 Janji et al.，1999)。有来 自非癌系统的多个出版物，这些非癌系统证实了 TGF-β信号与Wnt-fe表达之间的直接联 系。例如，在鸡胚翅芽间质细胞中，TGF-β 3已经显示增加了 Wnt-^i表达，导致PKCa的活 化以及软骨形成的分化(Jin et al.，2006)。在一份更近的出版物中，在小鼠中，TGF-β 1 显示在乳房上皮细胞中增加了 Wnt-fe表达，导致在发育的乳腺中抑制导管延伸以及侧向 分支(Roarty and Serra,2007)o结果，TGF-β信号的抑制可以潜在地成为一个吸引人的 机理，由此可以破坏Wnt-fe介导的肿瘤细胞迁移以及转移。发明概述本发明涉及一种用于治疗黑色素瘤以及胃癌的Wnt5-a衍生物以及一种用于治 疗黑色素瘤以及胃癌的方法。发明详细描述具体地本发明涉及无支链的氨基甲酸酯衍生物、具体地某些Wnt5-a肽的N-丁氧 基羰基衍生物，并且更具体地涉及一种无支链的氨基甲酸酯衍生物、具体地一种或多种这 些肽的N- 丁氧基羰基衍生物。MDGCELSEQ.ID.NO:1
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TQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO:13
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LGTQGRLCNKTSEGMDGCELSEQ.ID.NO:15 本发明的另一个方面涉及一种无支链的氨基甲酸酯衍生物、具体地以上肽的 N- 丁氧基羰基衍生物，用于治疗黑色素瘤以及胃癌。
本发明的另一个方面涉及一种药用组合物，该药用组合物包括至少一种无支链的 氨基甲酸酯衍生物、具体地以上肽的N- 丁氧基羰基衍生物，用于治疗黑色素瘤以及胃癌。在其一个优选的实施方案中，该药用组合物是一种局部性组合物。本发明的另一个方面涉及一种通过向遭受黑色素瘤和胃癌的受试者给予一个治 疗有效量的无支链的氨基甲酸酯衍生物、具体地以上肽的N- 丁氧基羰基衍生物，用于治疗 黑色素瘤的方法。本发明的另一个方面涉及一种通过向处于获得黑色素瘤和胃癌的风险区中的受 试者给予一个治疗有效量的无支链的氨基甲酸酯衍生物、具体地以上肽的N-丁氧基羰基 衍生物，用于预防性治疗黑色素瘤的方法。术语无支链的氨基甲酸酯衍生的在此是指N-甲氧基羰基、N-乙氧基羰基、N-正丙 氧基羰基或N- 丁氧羰基衍生物的组中的衍生物之一，由此后者可以是优选的。通过参考所实施的一些实验，以下将描述本发明。附图简要说明

图1展示了 A2058和HTB63黑色素瘤细胞系的特征。A)在A2058和HTB63黑色素瘤细胞中缺少或存在Wnt_5a、Frizzled-2以及 Frizzled-5 mRNA的分析。对于所有这些转录本以及作为上样对照的β-肌动蛋白，人乳 癌细胞系MCF-7(M)用作阳性对照。加(+RT)和减(-RT)表明使用或不使用逆转录酶完成 的反应。对于内(12和Fzd5，以3. 5倍的用于β -肌动蛋白对照的cDNA的量完成该PCR反应。B)为了进一步表征在HTB63细胞中Wnt-fe转录本的存在，本发明人还通过蛋白质 印迹测定了在A2058和HTB63细胞中Wnt-^i蛋白的细胞水平，使用重组体Wnt-^i (rW5a) 作为阳性对照并且用肌动蛋白作为上样对照。本发明人还进行了 48小时后从Α2058 和ΗΤΒ63细胞所收集的无血清培养基的蛋白质印迹分析从而揭示了从这些细胞分泌的 Wnt-5a蛋白的缺少或存在。重组体Wnt-fe蛋白用作阳性对照。将每个所描绘的结果以独 立试验的方式重复至少三次。图2展示了 R)xy5，在黑色素瘤细胞中Foxy5是一个Wnt-^i促效剂。A显示了 Foxy5的结构(标记了甲酰基基团)B显示在一个时间过程中Foxy5 (50 μ Μ)促进Α2058细 胞迁移(创伤-愈合测定)，该时间过程的组成为0、16、24、40以及48小时。误差棒表示 s. e. m. Paird-t-tests ；*ρ < 0. 05。图3显示了 Βοχ5的结构，它是R)xy5的一种修饰的类似物。图4展示了 Wnt-fe和新的N- 丁氧羰基六肽(Box5)对黑色素瘤细胞粘附以及迁 移的影响。A)用所示浓度的Wnt-fe刺激A2058黑色素瘤细胞，用维尔烯(Versene)分离并 且以单个细胞再悬浮于无血清的培养基中(在存在或不存在重组体Wnt-fe下，在指定浓度 下)。然后允许细胞粘附在96孔板中。在60分钟的一个时期后，将未粘附的细胞洗去，同 时将粘附的细胞染色并且确定它们的数目。该数目表示为对照(无Wnt-5a)刺激的百分比。B)在一个12孔板中将A2058黑色素瘤细胞培养至汇合，之后在各孔施以划痕，将 培养基换成缺少(实心圆圈)或包含0.2 μ g/ml Wnt-fe(空心方块)的新鲜的无血清的培 养基。
C)在一个12孔板中将A2058黑色素瘤细胞培养至汇合，之后对各孔施以划痕， 将培养基换成新鲜的无血清培养基(缺少任何添加剂(实心圆圈)、仅存在0.2yg/ml ffnt-5a (空心方块)或存在0. 2 μ g/ml Wnt_5a和100 μ ΜΒοχδ (空心三角))。D)在一个12孔板中将HTB63黑色素瘤细胞培养至汇合，之后对各孔施以划痕，将 培养基换成新鲜的无血清的培养基(实心圆圈)、条件培养基(空心方块)或添加有ΙΟΟμΜ Βοχ5的条件培养基(空心三角)。为了在图8-0中记录迁移的改变，0、16、24、40或48小时 后从相同区域的细胞从各刮痕/孔得到一幅图像，并且将创伤-愈合表达为所封闭的创伤 面积的百分比。Ε)在开始各试验之前，用维尔烯将Α2058细胞(左侧六条棒)与ΗΤΒ63细胞(右 侧两条棒)分离并且作为单个的细胞再悬浮于无血清的培养基中。在缺少(空心棒)或存 在(实心棒)100 μ M Βοχ5下在连续搅拌下将这些细胞预孵化40分钟。然后将包含25，000 个细胞的一个等分部分的细胞悬浮液加入上面的iTransweIl室中，并且用包含血清(10% ) 的培养基填充下面的室。如所示将0. 1 μ g/ml Wnt-3a、0. 2 μ g/ml ffnt-5a和/或100 μ M Βοχ5加入上面的室中。然后允许这些细胞侵袭M小时，之后对膜的下侧上附连的细胞进行 计数。这些结果以平均值士SEM(n = 5-7)给出。* = ρ < 0. 05，# = ρ < 0. 01，并且
=P < 0.001，其中这些值是与对照比较的。(图OT，CM对CM+Box5，~ = ρ < 0. 05,"" = ρ < 0. 01，以及 = ρ < 0. 001)。图5展示了 Box5对A2058黑色素瘤细胞的基本迁移没有影响，但可能抑制TGF β 1 诱导的迁移。Α)在存在(口)或缺少(眷)100 μ M Βοχ5下Α2058细胞的创伤愈合分析。B) 使用或不使用100 μ M Βοχ5预孵化40分钟，并且然后如所示使用或不使用5ng/ml TGF β 1 进行进一步刺激的Α2058细胞的创伤愈合测定。所有创伤愈合数据都表示为0、16、40以及 48小时后所封闭的创伤面积的百分比。图6展示Wnt-fe/Ca2+信号传导途径对于Wnt-fe介导的黑色素瘤细胞侵袭是重要 的。A)rWnt-fe(0. lyg/l ；由箭头所示加入)在A2058细胞中触发了一个快速细胞质Ca2+ 信号。B)用10 μ M ΜΑΡΤ/ΑΜ预孵化Α2058细胞30分钟去除了 rWnt_fe(0. 1 μ g/ml)刺激 (由箭头指示)的胞质的Ca2+。OMAPT/AM去除了 Wnt-fe诱导的A2058细胞侵袭。用10 μ M ΜΑΡΤ/ΑΜ将细胞预孵化30分钟，然后使用/不使用rWnt-fe(0. 2μ g/Ι)进行刺激，并且然后 使用ΙμΜ ΜΑΡΤ/ΑΜ贯穿侵袭试验的持续时间(Μ小时)进行刺激，其中后者的处理条件对 Ca2+(以10 μ M ΜΑΡΤ/ΑΜ持续30分钟)具有相同的螯合作用，示于图6Α中。误差棒表示为 s. e. m. Paird t-tests ；*ρ < 0. 05, ***ρ < 0. 001。图7展示Βοχ5对诱导的Ca2+信号以及PKC活化的影响。将来自载入A2058黑色素瘤细胞、预孵化(过夜)以及缺少或存在Box5 (100 μ M) 孵化的fura-2的荧光信号进行记录随后或者用1μ g/ml)、内皮素-I(ET-I) (IOnM)亦或用卡巴胆碱(charbacol) (5 μ M)进行刺激。Α)来自用Wnt_5a、内皮素-1或卡 巴胆碱刺激的A2058细胞的代表性的Ca2+轨迹，后两者是G蛋白受体配体对照。B)来自用 Box5进行预孵化以及孵化，并且然后用Wnt-fe (第一箭头)进行刺激并且然后或者用内皮 素-1(第二箭头上部轨迹)亦或用卡巴胆碱(第二箭头下部轨迹)再次进行刺激的A2058 黑色素瘤细胞的两个Ca2+轨迹。所示的所有的轨迹是至少五个单独的实验的代表。C)以比 率值的形式(本底水平比峰水平)显示了从A2058细胞所记录的Δ Ca2+改变的累积结果，这些A2058细胞在缺少(空心棒)或存在Box5(实心棒)下用Wnt-^i、内皮素-1或卡巴胆 碱进行刺激。D) 45分钟后或rffnt-5a刺激(0. 2 μ g/ml)后用Box5 (100 μ Μ)预孵化过夜抑 制了 MARCKS磷酸化。使用InM PMA作为用于MARCHS磷酸化的阳性指示物。这些结果以平 均值 士SEM，*** = ρ < 0. 001 给出。图8展示了在Α2058和ΗΤΒ63黑色素瘤细胞中TGF- β 1信号对Wnt-fe蛋白表达 的影响。A)代表性的蛋白质印迹显示在缺少或存在选择性TGF-βΙ受体拮抗剂 SB431542 (10 μ Μ)下孵化ΗΤΒ63黑色素瘤细胞4或5天对它们的内源性Wnt-^i表达的影 响。使用重组体Wnt-fe作为阳性对照并且使用β-肌动蛋白作为上样对照。B)蛋白质印迹显示在Α2058细胞中使用逐渐增加浓度的TGF-β 1进行M小时刺 激对Wnt-fe表达的影响。使用重组体Wnt-fe作为阳性对照并且使用β-肌动蛋白作为上 样对照。C)蛋白质印迹显示在Α2058细胞中使用5ng/ml TGF-β 1刺激逐渐增加的一段时 间对Wnt-fe表达的影响。使用重组体Wnt-fe作为阳性对照并且使用β -肌动蛋白作为上 样对照。将每个所描绘的结果以独立试验的方式重复至少四次。图9展示了 TGF-β 1和Βοχ5对黑色素瘤细胞粘附和迁移的影响。Α)使用所示浓度的TGF-β 1刺激Α2058黑色素瘤细胞，用维尔烯进行分离，并且以 单个细胞的形式再悬浮于无血清的培养基中。然后允许这些细胞粘附到一个96孔板中并 且60分钟的一段时间之后将未粘附的细胞洗去同时将粘附的细胞染色并且确定它们的数 目。该数目表示为对照(无TGF-β 1刺激)的百分比。B)在一个12孔板中将ΗΤΒ63黑色素瘤细胞培养至汇合，之后在各孔中制造划痕， 将培养基换成新鲜的无血清的培养基(缺少(实心圆圈)或存在10 μ M SB431M2(空心方 块))。C)在一个12孔板中将A2058黑色素瘤细胞培养至汇合，之后对各孔施以划 痕，将培养基换成新鲜的无血清培养基(缺少任何添加剂(实心圆圈)、仅存在5ng/ml TGF- β 1 (空心方块)或存在5ng/ml TGF- β 1和100 μ M Βοχ5 (空心三角))。在图B和C 中所描绘的实施方案中，0、16、M、40或48小时后从相同区域的细胞从各刮痕/孔得到一幅 图像，并且将创伤-愈合表达为所封闭的创伤面积的百分比。D)在开始各试验之前，用维尔烯将A2058细胞(左侧两条棒)与HTB63细胞 (右侧两条棒)分离并且作为单个的细胞再悬浮于无血清的RPMI培养基中。然后将包含 25，000个细胞的一个等分部分的细胞悬浮液加入上面的Transwell室中，并且用包含血清 (10%)的培养基填充下面的室。如所示，允许这些细胞在缺少(空心棒)或存在或者5ng/ ml TGF-βΙ (实心棒)亦或10 μ M SB431M2(实心棒)下侵袭进入上面的室中。然后允许 这些细胞侵袭M小时，之后对膜的下侧上附连的细胞进行计数。这些结果以平均值士SEM (n = 5-10)给出。* = ρ < 0. 05，** = ρ < 0. 01，并且
氺氺氺=ρ < 0. 001。实验抗体和肽使用以下的一抗β-肌动蛋白单克隆AC-15 Ab (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), TGF-β 1 鸡多克隆 Ab (R&D Systems Europe Ltd.，Abingdon, UK)。如前所述(Jonsson etal.，2002)在本发明人的实验室中生成抗Wnt-^i的多克隆抗体抗成熟的Wnt-^i分子的氨 基酸275490。二抗过氧化物酶偶联的抗鸡IgY(IgG)全分子是来自Sigma Aldrich(St. Louis, MO)的；所有其他过氧化物酶偶联的IgG是从Dakopatts (Glostrup，Denmark)得 到的。Inbiolabs有限公司(Tallinn, Estonia)在两个不同的场合合成该新的Wnt-5a 衍生的N- 丁氧羰基六肽(Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu ；Box5)。在发明人的测定中这两 批Box5肽具有相似的结果。通过RP-HPLC和质谱法对所合成批次的Box5肽(> 95 % 纯)进行质量控制。所使用的甲酰化的对照肽(甲酰基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys)是 来自Sigma-Aldrich(M.Louis，M0)的。化学品苯甲脒、牛血清、所有类型的组织培养基 是来自 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)的。人重组体 Wnt_5a、ffnt-3a 和 TGF-β 1 蛋白购 于R&D Systems Europe Ltd. (Abingdon，UK)。人类猪内皮素_1和卡巴胆碱购于Sigma Aldrich(St. Louis, M0)。蛋白酶抑制剂Pefabloc、亮抑蛋白酶肽，以及抑肽酶是来自 Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Germany)白勺。TGF—β I舌
激酶ALK5及其相关物ALK4以及7 SB431542 (Inman et al.，200 的选择性抑制剂购于 Tocris Bioscience (Tocris Cookson Ltd.，Bristol，UK)。增强型化学发光(ECL)检测试 剂购于Santa Cruz Biotechnology公司(Mockholm，Sweden)，而所有其他电泳试剂来自 BioRad(Richmond，CA)。所有其他化学品是分析纯并且购于 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO)。细胞培养人恶性黑色素瘤细胞系A2058是来自匈牙利布达佩斯kmmelweis大学病理学和 实验癌症研究系的L0szl0 Kopper惠赠的。将该A2058细胞系维持在添加有10% FBS、5U/ ml青霉素、0. 5U/ml链霉素、和2mM谷氨酰胺的RPMI 1640中。HTB63 (也称为HT144)人恶性黑色素瘤细胞系购于美国种质保存中心(ATCC ；LGC Promochem AB,Boras, Sweden)并且维持在添加有 10% FBS、5U/ml 青霉素、0. 5U/ml 链霉素、 以及2mM谷氨酰胺的McCoy，s 5A培养基中。将人乳腺癌细胞MCF7(用于Wnt-^i表达的阳性对照)生长于添加有10% FBS、5U/ ml青霉素、0. 5U/ml链霉素、和2mM谷氨酰胺的DMEM中。将所有细胞培养物维持在37°C下 在5%二氧化碳的潮湿的气氛中。蛋白质印迹将这些细胞或者直接在包含DTT的IX Laemmli缓冲剂中进行溶解并且煮沸10分 钟，或者在包含 50mM Tris-HCKpH 7. 5) ,1% Triton X-IOOUOOmM NaClUOmM MgCl2,20% 甘油、ImM Na3VO4、以及蛋白酶抑制剂μ g/ml抑肽酶、1 μ g/ml亮抑蛋白酶肽、2. 5mM苯 甲脒、以及2mM Pefabloc)的缓冲剂中进行溶解。在4°C将用溶解缓冲剂处理过的细胞在 15，OOOrpm下离心5分钟。对每个样品中的蛋白含量进行确定以及调节从而确保将蛋白相 同上样于每个泳道中。此后，加入50mM DTT和切浓缩的Laemmli缓冲剂并且将这些样品 煮沸5分钟。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些样品进行分离并且随后转到PVDF膜上。 为了免疫印迹，将这些膜在添加有0.2% Tween 20以及脱脂奶(用于Wnt-5a)或3% 脱脂奶(对于所有其他抗体)PBS中封闭1小时。此后，在2%脱脂奶或1.5% BSA中用所 指示的一抗(对于β-肌动蛋白1 25，000、对于Wnt-^i 1 1，000并且对于TGF-β 1 1 1，000)将这些膜在室温下孵化1小时或在4°C下过夜。用含有0. 2% Tween的PBS充 分清洗后，用2%脱脂奶或1. 5% BSA中的辣根过氧化物酶偶联的二抗将这些膜孵化1小时并且进行再次充分清洗。最后，使用增强型化学发光法检测该抗体-抗原复合物。对于反 复探测，用来自 Chemicon International (Temecula, CA)的 Reblot Strong 溶液将这些膜 进行再生。所显示的蛋白印迹是至少三个独立的实验的代表。RT-PCR按照生产厂家的说明书使用来自^witrogenO的TRIzo 1 进行RNA提取。使用 一台Nanodrop分光光度计ND-1000(Bio-Rad(Hercules CA))来测量RNA浓度。在逆转 录之前，用 lU/μΙ DNaseianvitrogen)对 RNA 进行处理。使用 M-MuLV RT(Fermentas, Helsingborg, Sweden)使用来自 Fermentas (Helsingborg, Sweden)的随机六聚物、1-2 Ug 总RNA合成cDNA。50 μ 1体积中的PCR反应使用IX Taq聚合酶缓冲剂(75mM Tris-HCl, 20mM[NH4]2S04,0. 01% Tween 20)中 5 μ 1 RT 反应，其中加入 2. 5mM MgCl2,200mM dNTPs、每 种引物 1 μ M 以及 1 单位 iTaq DNA 聚合酶(Fermentas，Helsingborg, Sweden)。PCR 引物如 下Wnt-5a 正向5，-GGATTGTTAAACTCAACTCTC-3，(SEQ. ID. NO :16)；ffnt-5a 反向5，-ACACCTCTTTCCAAACAGGCC-3，(SEQ. ID. NO :17)；β -肌动蛋白正向5，-TTCAACACCCCAGCCATGTA-3，(SEQ. ID. NO :18)；β -肌动蛋白反向5，-TTGCCAATGGTGATGACCTG-3，(SEQ. ID. NO :19)；Frizzled-2 正向5' -ACATCGCCTACAACCAGACC-3‘ (SEQ. ID. NO :20)以及Frizzled-2 反向5' -CTCGCCCAGAAACTTGTAGC-3‘ (SEQ. ID. NO 21)；Frizzled-5 正向5' -ACACCCGCTCTACAACAAGG-3‘ (SEQ. ID. NO :2 以及Frizzled-5 反向5' -CGTAGTGGATGTGGTTGTGC-3‘ (SEQ. ID. NO :23)。图1中所示的RT-PCR是至少三个独立的实验的代表。细胞粘附将如下述预处理过的和刺激过的细胞用维尔烯进行分离，再悬浮于无血清的RPMI 培养基中，并且将来自各处理组的包含30，000个细胞的样品加入到一个96孔板的各孔中。 在37°C下在5% 二氧化碳的潮湿气氛下允许这些细胞粘附60分钟，之后用PBS将未粘附的 细胞洗去。在室温下将粘附的细胞固定于戊二醛中持续10分钟并且然后用20%甲醇 中的0.5%结晶紫染色10分钟。最后，将来自各组细胞的染色溶解于50%乙酸中。此后在 一台 Fluostar 酶标仪(BMG Lab Technologies GmbH, Offenberg, Germany)中在 544nm 下 测量所溶解的来自各孔的染色的量。将来自各单独的实验的这些单独的样品进行四次重复 分析并且这些累积的数据是基于5个单独的实验的。这些结果在图4中展示。A)用所示浓度的Wnt-fe刺激A2058黑色素瘤细胞，用维尔烯分离并且以单个细胞 再悬浮于无血清的培养基中(在存在或不存在重组体Wnt-fe下，在指定浓度下)。然后允 许细胞粘附在96孔板中。在60分钟的一个时期后，将未粘附的细胞洗去，同时将粘附的细 胞染色并且确定它们的数目。该数目表示为对照(无Wnt-5a)刺激的百分比(图4A)。B)在一个12孔板中将A2058黑色素瘤细胞培养至汇合，之后在各孔施以划痕，将 培养基换成缺少(实心圆圈)或包含0.2 μ g/ml Wnt-fe(空心方块)的新鲜的无血清的培 养基(图4B)。C)在一个12孔板中将A2058黑色素瘤细胞培养至汇合，之后在各孔施以划痕， 将培养基换成新鲜的无血清培养基(缺少任何添加剂(实心圆圈)、仅存在0.2 μ g/ml ffnt-5a (空心方块)或存在0. 2 μ g/ml ffnt-5a和100 μ ΜΒοχδ (空心三角))(图4C)。
D)在一个12孔板中将HTB63黑色素瘤细胞培养至汇合，之后在各孔施以划痕，将 培养基换成新鲜的无血清的培养基(实心圆圈)、条件培养基(空心方块)或添加有ΙΟΟμΜ Βοχ5的条件培养基(空心三角)。为了在图8-0中记录迁移的改变，0、16、24、40或48小时 后从相同区域的细胞从各刮痕/孔绘制一幅图像，并且将创伤-愈合表达为所封闭的创伤 面积的百分比(图4D)。Ε)在开始各试验之前，用维尔烯将Α2058细胞(左侧六条棒)与ΗΤΒ63细胞(右 侧两条棒)分离并且作为单个的细胞再悬浮于无血清的培养基中。在缺少(空心棒)或存 在(实心棒)100 μ M Βοχ5下在连续搅拌下将这些细胞预孵化40分钟。然后将包含25，000 个细胞的一个等分部分的细胞悬浮液加入上面的iTransweIl室中，并且用包含血清(10% ) 的培养基填充下面的室。如所示将0. 1 μ g/ml Wnt-3a、0. 2 μ g/ml ffnt-5a和/或100 μ M Βοχ5加入上面的室。然后允许这些细胞侵袭M小时，之后对膜的下侧上附连的细胞进行 计数。这些结果以平均值士SEM(n = 5-7)给出。* = ρ < 0. 05，# = ρ < 0. 01，并且*** =P < 0.001，其中这些值是与对照比较的。(图4D，CM对CM+Box5，~ = ρ < 0. 05,"" = ρ < 0. 01，以及 = ρ < 0. 001)。创伤愈合测定将细胞铺于12孔板中并且允许在完全RPMI (对于A2058细胞)或完全McCoy’ s 5A培养基(对于HTB63细胞)中生长成一个汇合的层。如所示，在连续搅拌下用该Box5肽 (ΙΟΟμΜ)或对照溶剂将细胞预孵化40分钟。然后通过用一个枪头制造一个穿过该汇合层 细胞的刮痕施以创伤。在该测定的迁移过程期间，将细胞或者在无血清的培养基中亦或在 ΗΤΒ63的情况下在从培养了 48小时并且收集后在2天内使用的细胞中收集的它们自己的无 血清的条件培养基中进行孵化。各试验的确切的条件在上面进行了描述。为了避免活性损 失，24小时后更换细胞培养基。在0、16、24、40和48小时处在相同区域的细胞中获得各刮 痕的图像，并且将创伤愈合测量为所封闭的创伤面积的百分比。对于各实验条件将创伤愈 合进行分析重复三次。如所示，所有数据都是基于3至8个单独的实验。细胞侵袭使用BD Matrigel 侵袭室测定(BD Biosciences, Bedford, MA)对细胞侵袭进行 分析。在起始各试验之前，用维尔烯将细胞分离并且以单个细胞的形式再悬浮于无血清的 RPMI培养基中。如所示，在连续搅拌下用该Box5肽(ΙΟΟμΜ)或对照溶剂将细胞预孵化40 分钟。然后将包含25，000个细胞和ΙΟΟμΜ Βοχ5或对照溶剂的一个等分部分的细胞悬浮 液加入上面的Transwell室中，并且用包含血清(10%)的培养基填充下面的室。同时，如 图7中所示将Wnt-fe、ffnt-3a或TGF- β 1抑制剂SB431542加入上面的室中。将这些侵袭 室水平地摇动5分钟以确保将这些细胞均勻分布于悬浮液中并且随后跨过膜表面。在37°C 下在5% CO2的潮湿气氛下允许细胞侵袭所示的一段时间。将培养基弃去并且将细胞固定 于4%多聚甲醛中持续10分钟。用20%甲醇中的0.5%结晶紫将细胞染色10分钟并且用 一个棉头的涂抹器将膜的内侧上的未侵袭的细胞去除。使用手术刀片将膜从该室切除并且 对该膜的下面室侧面上的染色的细胞进行计数。确定胞质自由钙水平在37°C下在培养基中将生长在一个玻璃盖玻片上的细胞用4 μ M fura-2/AM孵化 30分钟(Dejmek et al.，2006)。fura_2载入细胞后，将盖玻片进行清洗并且固定在一个特别设计的室中，将包含钙的培养基(136mM NaCl、4. 7mM KClU. 2mM MgSO4U. ImM CaCl2, 1. 2KH2P04、5mM NaHCO3,5. 5mM葡萄糖以及20mM Hepes,pH 7.4)加入该室中。然后将该室置 于一个系统中，该系统的组成为一个NIKON Diaphot显微镜，该显微镜被连接到一个Wioton Technology International (PTI)成像系统上。在进行任何刺激之前首先允许将这些细胞 静置10分钟。然后连续地记录用或者Wnt-fe、内皮素-1亦或卡巴胆碱(如图8的图例中 所示)刺激之前以及之后来自这些细胞的Fura-2荧光(使用在340至380nm之间快速交 替的激发波长，而发射波长设定在510nm处)。随后计算荧光强度比率(340/380nm)并且使 用该PTIImage Master软件进行分析。统计分析使用对于未配对样品的Mudent’ s t_检验来分析这些实验中的差异， 其中 * = ρ < 0. 05、** = ρ < 0. 01、并且 *** = ρ < 0. 001。A2058和HTB63黑色素瘤细胞系的表征为了进一步研究黑色素瘤细胞中Wnt-fe表达以及信号的作用，已经决定使用两 种不同的人类黑色素瘤细胞系，A2058和HTB63。A2058和HTB62黑色素瘤细胞两者在黑色素 瘤细胞中表达Frizzled-5受体(图1A)(推荐的Wnt-^i受体)(Weeraratna 2002)。相比之 下，在细胞系中观察到Frizzled-2受体的弱得多的表达。进一步的表征揭示了 A2058细胞 缺少Wnt-^i mRNA以及蛋白的内源性表达，而相比之下HTB63细胞展示了 Wnt-^i mRNA(图 1A)以及蛋白(图1B)的切实的内源性表达。为了确定HTB63细胞中所表达的内源性的确是分泌的，通过蛋白质印迹 检测Wnt-fe的存在对这些细胞所生长在其中的培养基进行分析。图IB中下面的印迹 清楚地揭示了 HTB63细胞不仅表达而且分泌Wnt-fe。在这些试验中使用表达Wnt-fe和 Frizzled-5的MCF-7乳癌细胞以及重组体Wnt-fe作为阳性对照。这些数据表明在这些细 胞系中Wnt-fe的表达是以转录水平被调控的，这与乳癌组织和细胞相反，在乳癌组织和细 胞中它是以翻译水平被调控的(Dejmel^Leandersson)。至今为止，在黑色素瘤细胞中调节 Wnt-5a转录的因子是未知的。Wnt-fe拮抗剂肽的开发以前，本发明人已经鉴定了一种Wnt-^i衍生的、N-甲酰化(N-formulated)的六肽 (R)Xy5 ；图2A)，该六肽作为Wnt-fe信号的一种促效剂起作用。这种肽在乳癌细胞系中模 拟Wnt-fe的作用，并且在体内具有抗肿瘤生成的功能。据发现R)xy5还可以在A2058黑色 素瘤细胞中(图2B)模拟Wnt-fe的前迁移作用，表明这种肽在不同的细胞类型中作为一种 Wnt-fe促效剂起作用。有趣的是，以前已经显示的是一个甲酰化的细菌衍生的趋化肽(甲 酰基-Met-Leu-Phe)的特异性修饰将该分子从一种促效剂转化为一种拮抗剂类似物。现在 已经显示的是i^Xy5的这样一种修饰还可以将其Wnt-fe促效剂功能改变为一种拮抗剂的 功能。这种 t-boc-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu 肽已经被命名为 Box5 (图 3)。ffnt-5a和N- 丁氧羰基六肽Box5对细胞粘附和迁移的影响测试了 Wnt-^i对A2058黑色素瘤细胞的粘附性的影响。Wnt-fe提高了 A2058黑色 素瘤细胞的粘附能力并且用0.2 μ g/ml刺激后得到最大的作用(图4A)。基于这些发现，然 后研究的是在创伤-愈合测定中重组体Wnt-fe的浓度是如何影响A2058细胞的迁移的。图 4B中所勾画的结果清楚地显示在这些实验的开始时加入Wnt-^i (0. 2 μ g/ml)增加了 A2058 黑色素瘤细胞的迁移。为了特异性抑制这种Wnt-fe诱导的黑色素瘤细胞的迁移，随后将它进行发展并且测试一个新的并且N- 丁氧羰基修饰的肽。以前已经显示的是Wnt-fe衍生的 甲酰化的六肽可以模仿Wnt-fe在体内在乳癌细胞迁移上的抑制作用(Safholm 2006)并 且这种肽在小鼠模型中还抑制乳癌转移(Safholm，2008)。在此测试了它的将一个丁氧羰 基加入该六肽的N-端甲硫氨酸残基上从而得到一个Wnt-fe信号的抑制剂的可能性。这个 操作的根据是以下发现，即已经报告了一种细菌衍生的趋化性肽(甲酰基-Met-Leu-Phe) 的这样一种修饰用来将该肽的行为从促效剂变成拮抗剂(Derian，1996)。在一个创伤-愈 合测试中测试了这种丁氧羰基修饰的六肽(以下称为Bod)抑制A2058和HTB63黑色素瘤 细胞的迁移的能力。Box5消除了 A2058细胞的Wnt-fe诱导的迁移(图4C)但对缺少内源 性表达的这些细胞的内部迁移没有影响(图5A)。还显示的是可以通过用Box5进行预孵 化阻断A2058细胞的TGFl β介导的迁移(图5Β)。通过这些发现这些数据还表明Βοχ5，而 不是一个甲酰化的对照六肽(数据未显示)，以与条件培养基(包含分泌的Wnt-5a)到新 鲜的无血清培养基(缺少Wnt-5a)的改变相同的程度抑制HTB63细胞的迁移(图4D)。该 创伤-愈合测定研究了以单层存在的细胞的迁移，该单层的特征是多个细胞-细胞相互作 用。然而，它没有反映体内的情况，其中肿瘤细胞被强迫侵袭细胞外基质并且因此将它随后 在一个侵袭测定中进行类似的实验。在转移过程期间，肿瘤细胞需要侵袭进入细胞外基质中，从而在一个3维细胞培 养模型中测试了 Box5阻断细胞侵袭的效能。加入Box5消除了 A2058细胞的Wnt-fe诱导 的侵袭，当用典型的Wnt配体Wnt-3a刺激这些细胞时，没有看到一种作用(图4E)。通过对 抗内源性的Wnt-fe的作用，Box5还具有抑制HTB63细胞的侵袭的能力(图4E)。总之，这 些数据显示Box5是黑色素瘤细胞的Wnt-fe介导的迁移以及侵袭的一种有效的拮抗剂，这 两者是转移过程的重要部件。对于Wnt-fe刺激A2058黑色素瘤细胞的侵袭的能力，在侵袭测定中对创伤-愈 合测定中得到的结果进行确认。此外，当用典型的配体Wnt-3a刺激这些细胞时，没有看 到Wnt-fe对黑色素瘤细胞侵袭的影响。而且，加入Box5肽消除了 A2058黑色素瘤细胞的 Wnt-fe诱导的侵袭但对它们基本的侵袭没有影响。此外，Box5还能够抑制HTB63黑色素瘤 细胞的侵袭，该HTB63黑色素瘤细胞具有一种内源性表达和分泌的Wnt-fe。Wnt/Ca2+信号传导路径对于介导的黑色素瘤细胞侵袭是重要的为了鉴别Box5的对抗性功能的分子基础，对对于Wnt-fe诱导的黑色素瘤细胞侵 袭是重要的信号传导路径进行了研究。发现的是在A2058细胞中Wnt-fe刺激了一个快速 的胞质Ca2+信号(图6A)，该信号可以通过使用细胞内的Ca2+螯合剂MAPT/AM进行抑制(图 6B)。在缺少Wnt-fe Ca2+诱导的信号下使用MAPT/AM Ca2+螯合作用来评估黑色素瘤细 胞的侵袭能力。Wnt-fe对A2058细胞的原侵袭作用被MAPT/AM完全地消除了(图6C)。这 证实了 Wnt-fe刺激的Ca2+信号组分对于介导黑色素瘤细胞侵袭是重要的。N- 丁氧羰基六肽Box5对诱导的信号的影响为了进一步研究Box5六肽的特性及其与Wnt-fe受体的选择性的相互作用，分析 了它对立即的Wnt-fe诱导的受体信号的影响。以前已经显示Wnt-fe触发甲状腺细胞中 (Kremenevskaja, 2005)以及乳癌细胞中(Dejmek，2006)胞质的自由Ca2+的迅速增加。这 些数据显示出，与由两种其他的G蛋白偶联的对照受体配体(内皮素-1和卡巴胆碱)(图7A)所诱导的迅速的应答类似，在A2058黑色素瘤细胞中(图7)Wnt-fe还触发快速胞质的 Ca2+信号。应当注意的是为了获得对于所有三种配体大致相似的Ca2+应答，在这个系列的 实验中将ffnt-5a浓度从0. 2 μ g/ml减少到0. 1 μ g/ml。然后测试了 Box5对细胞的影响，这些细胞首先用Wnt-fe进行刺激并且随后用或 者内皮素-1亦或卡巴胆碱进行刺激(图7B)。这些试验显示在A2058黑色素瘤细胞中Box5 选择性地抑制了 Wnt-fe诱导的细胞内Ca2+信号，但没有抑制内皮素-1或卡巴胆碱诱导的 细胞内Ca2+信号。在Box5如何影响诱导的Ca2+信号上累积的结果显示当与在缺 少Box5下Ca2+信号的峰值进行比较时，存在超过70%的抑制(图7C)。类似的Ca2+实验 (其中在缺少或存在Box5下用或者内皮素-1或者卡巴胆碱对细胞进行刺激)显示这种肽 对Ca2+信号没有显著的影响(图7C)。在黑色素瘤细胞中Wnt-fe信号的下游作用之一是PKC活化。刺激A2050 细胞导致MARCKS(—种内源性PKC底物)磷酸化增加，这被Box5肽的存在所抑制(图7D)。 这些数据表明Box5通过直接拮抗Wnt-fe刺激Ca2+和PKC信号来发挥作用从而阻断黑色素 瘤细胞侵袭，导致Wnt-fe介导的细胞侵袭的下游抑制。虽然记录细胞内Ca2+的改变是用于研究G蛋白偶联的受体信号的调整的一个非 常敏感的测定，它还没有直接地与黑色素瘤细胞的活力相关联。然而，以前的研究已经证实 了 Wnt-^i诱导的PKC活化对黑色素瘤细胞迁移的调节的下游影响(Weeraratna et al., 2002, Dissanayake et al. ,2007) 在本研究中，没有估计I3KC自磷酸化的水平(Weeraratnaet al.，2002， Dissanayake et al.，2007)，因为它与I3KC激酶活性的相关性还不清楚。相反地以一种直接 的方法估计这些黑色素瘤细胞中的PKC的活性水平，对Wnt-fe和Box5对内源性PKC底物 MARCKS的磷酸化的影响进行分析。Wnt-fe刺激A2058黑色素瘤细胞导致了在9至15分钟 时MARCKS磷酸化峰显著增加(图7A)。ffnt-5a的这种作用被Box5肽所消除(图7B)。这 些结果再次确定了 Box5对黑色素瘤细胞迁移以及侵袭的选择性影响(图4C-D)并且进一 步支持了这种假设，即Box5是一种Wnt-fe选择性的肽拮抗剂。在HTB63以及A2058细胞中SB431542和TGF-β 1对Wnt-fe蛋白表达的影响目前，黑色素瘤细胞中Wnt-fe转录的调节是不清楚的。在其他细胞类型中，最近 地在发育期间在乳腺导管上皮细胞中所证实的(Roarty and krra，2007)，已经发现的是 TGF-β 1负责调节Wnt-fe在转录水平上的表达。为了研究类似的机理存在于黑色素瘤细胞 中的可能性，直接测试了在这些细胞中选择性TGF-β 1类型I受体抑制剂SB431542与重组 体16 -0 1影响1壯-如表达的能力。图7C中所描绘的数据显示当将ΗΤΒ63细胞(该细胞 具有内源性的Wnt-^i表达)保持在添加有10 μ M SB431542的完全McCoy，s 5A培养基中 持续4至5天时，孵化4天后内源性的Wnt-fe蛋白表达被显著地减少，并且孵化5天后几乎 被消除。用不同浓度的重组体TGF- β 1刺激Α2058细胞(该细胞缺少内源性Wnt-fe表达) 持续36小时导致Wnt-fe蛋白的表达增加(图8B)。这些数据显示当用5ng/ml TGF-βΙ (图 8B)刺激时实现近乎最大的Wnt-fe表达，并且用5ng/ml TGF- β 1刺激Α2058细胞要求36 小时刺激从而导致Wnt-fe蛋白表达的清楚地可检测的增加(图8C)。这些结果证明在本研 究中所使用的至少两个恶性黑色素瘤细胞系中TGF-β 1调节Wnt-fe表达。这增加了这种 可能性，即可以通过阻断这些细胞中TGF-β 1信号来间接地拮抗Wnt-5a-介导的黑色素瘤细胞迁移。TGF-β 1、SB431542和Βοχ5对黑色素瘤细胞粘附、迁移以及侵袭的影响为了研究Wnt-fe是否的确是TGF-β 1诱导的细胞迁移的一种下游调节剂，首先测 试了 TGF- β 1对Α2058黑色素瘤细胞的粘附的影响。已经发现的是TGF- β 1刺激了 Α2058 黑色素瘤细胞的粘附能力并且发现用5ng/ml刺激后得到最大影响(图9A)。基于这些发 现，然后研究的是在创伤-愈合测定中重组体TGF-β 1的浓度是如何影响Α2058细胞的迁 移的。图9Β中所勾画的结果清楚地显示在这些实验的开始时加入TGF-β 1 (5ng/ml)增加 了 A2058黑色素瘤细胞的迁移。与这些结果很好地一致，发现10 μ M SB431542(TGF-i3类 型I受体的一种抑制剂)抑制了 HTB63细胞的迁移(图9C)。接下来在一个创伤-愈合 测定中测试了 Box5抑制A2058的迁移的能力。在该二维创伤_愈合测定中Box5消除了 TGF-β 1-诱导的迁移(图9D)。Βοχ5对Α2058黑色素瘤细胞的基本的迁移没有影响(数 据未显示)。然而，当在一个更复杂的迁移测定中测试TGF-β 1 (5ng/ml)对迁移的影响时， 得到矛盾的结果。在侵袭测定中，TGF-β 1抑制了 A2058细胞的迁移并且SB431542刺激了 HTB63细胞的迁移(图9E)。因此得到的结论是TGF- β 1是一种用于阻断Wnt-fe依赖性黑 色素瘤细胞迁移的不可预测的目标物，推测地由于其多种下游作用引起。在本研究中，已经证实的是在创伤-愈合以及侵袭测定中在黑色素瘤细胞中一种 修饰的Wnt-5a-衍生的六肽Box5选择性地抑制了 Wnt-5a-诱导的信号并且阻断了这些细 胞的Wnt-5a-介导的迁移。用于Box5的设计的基础来自以前的工作(其中根据PHD方法 (Rost, 1996)完成一个第二 /溶剂可进入的表面预测)，并且然后筛选具有重构Wnt-fe对 乳腺肿瘤细胞的影响的能力的Wnt-5a-衍生的小肽，这些乳腺肿瘤细胞缺少Wnt-fe的内 源性表达(SSrndahl, 2006)。在该研究中，对一个Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu六肽进行表 征，即N端Met甲酰化后(称为，能够模拟Wnt-fe对乳癌细胞迁移的信号以及抑 制的影响(Sarndahl, 2006) 如果用一种以前描述的(Sen 2001 ；Weeraratna 2002)封闭 抗-Frizzled-5抗体孵化这些细胞，Foxy5的这些影响已经失去了，表明R)xy5经由G-蛋白 偶联的受体Frizzled-5介导了它对乳癌细胞的影响(Safholm 2006)。该相同的Frizzled 受体已经表明负责Wnt-fe对黑色素瘤细胞的信号和功能性影响(Weeraratna 2002以及 Dissanayake 2007)。存在肽配体的几个实例，这些肽配体能够特异性地活化不同的受体；这些包 括三肽Arg-Gly_Asp(该三肽作为一种整联蛋白受体配体起作用(PiersctAacher and Rouslahti, 1984))、两个六肽(它们特异性地活化G-蛋白-偶联的蛋白酶-活化的受体1 和4 (Andersen，1999))以及拮抗性七肽(s印tap印tide)(该七肽结合凝血酶的G-蛋白-偶 联的受体(Pakala 2000))。然而，对于本研究最令人感兴趣的肽配体是细菌衍生的甲酰化 的-Met-Ieu-Phe三肽，该三肽通过高亲和性地结合到这些细胞上的G-蛋白-偶联的甲酰 基肽受体上活化了白细胞(Le，2002)。如果将这种肽的甲酰基用丁氧羰基进行交换，该三 肽仍然结合到相同的受体上但不是作为一种促效剂起作用，现在这种丁氧羰基化的三肽作 为一种拮抗剂起作用(Derian 1996)。如在此所示，显而易见地Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu 六肽的相同的修饰将它转变为黑色素瘤细胞中一种Wnt-fe选择性拮抗剂肽。这些数据清楚地显示Wnt-fe信号在A2058和HTB63黑色素瘤细胞两者中都持续 地刺激迁移无论创伤-愈合或侵袭测定是否使用，并且在所有这些情况中Box5都阻断了黑色素瘤细胞的Wnt-fe依赖性迁移。尽管现在证明了 TGF- β 1在Α2058和ΗΤΒ63黑色素瘤 细胞系两者中都调节了 Wnt-fe的转录，并且证明了加入Wnt-fe总是刺激黑色素瘤细胞迁 移，当用TGF-β 1刺激黑色素瘤细胞时还注意到非常不一致的影响。所得到的这些影响看 起来与用于研究细胞迁移所使用的测定的类型相关。TGF-β 1对黑色素瘤细胞迁移的最可 能的这些不同的影响涉及其已证明的对肿瘤细胞的多种影响。应当注意的是在这些情况下 当TGF-β 1刺激黑色素瘤细胞迁移时，Box5有限地抑制了其对迁移的影响。结果，这些数 据看起来支持通过一个化合物例如Box5直接干预Wnt-fe发信号可以是一种有效的新的治 疗方法用于选择性抑制恶性黑色素瘤转移。所使用的缩写是BMP-骨形态发生蛋白；EMT-上皮-间质转化；I3KC-蛋白激酶C;以及TGF-β-转化生长因子-β。药物配方当用作药物制剂时，本发明的化合物通常以药用组合物的形式给予。这些化合物 可以通过多种途径给药，包括口服、和直肠给药。这些化合物作为口服组合物是有效的。这 类组合物以一种药物学领域熟知的方式进行制备并且包括至少一种活性化合物。本发明还包括多种药用组合物，它们包含作为活性成分的在此描述的与药物上可 接受的载体结合的一种或多种化合物。在制备本发明的组合物中，通常将该活性成分与一 种赋形剂进行混合，通过赋形剂进行稀释或封装在这样一种载体之内，该载体可以是胶囊、 小药囊、纸或其他容器的形式。当该赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体的、半固体的、或液 体的物质，它可以作为该活性成分的运载体、载体或介质起作用。因此，这些组合物可以是 处于片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮液、乳液、溶液、糖浆、软胶囊和硬胶 囊、栓剂、以及封装粉剂的形式。在制备一种配制品中，在与其他成分组合之前，将一个化合物进行研磨以便提供 适当粒径可能是必要的。如果该化合物是基本上不可溶的，通常地将它研磨成粒径小于200 目。如果该化合物是基本上可溶于水的，正常地通过研磨对粒径进行调节以提供配制品中 基本上均勻的分布，例如约40目。适合的赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉 伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯酮、纤维素、无菌 水、糖浆、以及甲基纤维素。这些配制品可以另外包括润滑剂例如滑石、硬脂酸镁、以及矿 物油；湿润剂；乳化以及悬浮剂；防腐剂例如羟苯甲酯以及羟苯丙酯；甜味剂；以及调味剂。 可以将本发明的组合物按配方进行制造从而通过使用本领域已知的步骤给予患者之后提 供快速地、持续地或延迟地释放该活性组分。优选地将这些组合物配制成一种单位剂型。术语“单位剂型”指适合以单一的剂 量用于人类受试者以及其他哺乳动物的物理上分离的单位与适合的药物赋形剂进行结合， 每个单位包含一个计算产生所希望的疗效的预定量的活性物质。优选地，以不超过该药用 组合物的约20重量％使用以上化学式(I)的化合物，更优选地不超过约15重量％，其余的 是药学上惰性的一种或多种载体。
该活性化合物在跨越一个宽的剂量范围上是有效的并且总体上以一个药学上有 效的量进行给药。例如，当通过口服途径将该药物进行给药时，每个剂量包含从约Img至约 IOOOmg的活性成分，优选约2mg至约500mg，更优选约5mg至约lOOmg，甚至更优选约5mg至 约60mg。然而应当理解的是应当根据相关情况(包括有待治疗的病症、所选择的给药途径、 所给予的实际化合物及其相对活性、个体患者的年龄、体重、以及应答、患者症状的严重性， 等)由医师来确定实际给予的化合物的量。从原理的观点看，可以将该配制品与食物摄入 同时给予，并且然后应当以一个提供足够的抑制脂类的量进行给予。因此从营养的观点看 身体可能需要一些脂类，并且这然后可以影响所给予的本发明的抑制化合物的量。本发明 的化合物的作用发生在小肠中并且没有进一步的作用这样被获得，但受这些化合物的可能 的代谢物的作用。 为了制备固体组合物例如片剂，将主要的活性成分与一种药物赋形剂进行混合从 而形成包含本发明的一种化合物的一种均勻的混合物的一种固体前配制品组合物。当称这 些前配制品组合物为均勻的时，它是指该活性成分被均勻分散到该组合物各处从而可以将 该组合物容易地再分成相同地有效的单位剂型例如片剂、丸剂以及胶囊。然后将这种固体 的前配制品再分成上述类型的包含本发明的活性成分的单位剂型。可以将本发明的片剂、丸剂或粒料进行包被或另外地化合以提供一种剂型，该剂 型提供长时间发挥作用的优点。例如，该片剂或丸剂可以包括一种内部剂量组分以及一种 外部剂量组分，后者以外壳的方式位于前者的上面。可以通过一种肠衣将这两种组分进行 分离，肠衣用于抵抗在胃中分解并且允许该内部组分完整地穿过进入十二指肠或允许该内 部组分被延迟释放。对于这类肠衣或肠溶衣可以使用多种物质，这类物质包括多种聚合物 酸以及聚合物酸与例如虫胶、鲸蜡醇、以及醋酸纤维素这类物质的混合物。可以用一种能够在胰脏处释放的持续释放的包衣包被本发明的片剂、丸剂或粒 料，其中该胰脂肪酶被释放到肠中。因此这类持续释放的包衣将允许在胃中少量释放(如 果有)，但允许在小肠的上面部分中全部释放。例如，可以通过压缩或模制制备片剂。可以通过在一台适合的机器中压制处于自 由流动形式的(例如粉末或粒料)本发明的一种组合物来制备压片剂，可任选地与粘合剂、 润滑剂、惰性稀释剂、和/或表面活性或分散剂进行混合。可以通过在一个适合的机器中将 用一种惰性液体稀释剂湿润的粉状的化合物的一个混合物进行模制制备模制片剂。在一个优选的实施方案中，至少一种药学上可接受的赋形剂是一种粘合剂、填充 齐 、或其一种混合物。适合的赋形剂包括润滑剂、崩解剂、及其混合物。优选的赋形剂包括 但不限于乳糖、交联羧甲纤维素、微晶纤维素、预胶化淀粉、以及硬脂酸镁。适合用于制备本发明的药物组合物的剂型配制品的粘合剂包括但不限于玉米淀 粉、马铃薯淀粉、或其他淀粉、明胶、天然的和合成的树胶例如阿拉伯胶、海藻酸钠、海藻酸、 其他藻酸盐、西黄蓍胶粉、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、醋酸纤维素、羧 甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶化的淀粉、羟丙基甲 基纤维素(例如Nos. 2208,2906,2910)、微晶纤维素及其混合物。微晶纤维素的适合的形式包括例如作为AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103以及 AVICEL-PH-105 (可以从宾夕法尼亚州Marcus Hook的美国黏胶纤维部FMC公司获得)进行 销售的材料。一种特别适合的粘合剂是微晶纤维素与羧甲基纤维素钠的混合物(由FMC公司作为AVICEL RC-581 进行销售)。对于与本发明化合物的剂型一起使用适合的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳 酸钙(例如，粒料或粉末)、微晶纤维素、粉状纤维素、葡聚糖结合剂、白陶土、甘露醇、水杨 酸、山梨糖醇、淀粉、预胶化的淀粉、及其混合物。典型地，本发明的一种固体剂型的约50重量％至约99重量％是粘合剂和/或填 充剂。使用崩解剂来使该片剂当暴露于水性环境中时进行崩解。太多的崩解剂可以生产 片剂，这些片剂可以由于空气的水分在瓶子中进行崩解；太少的崩解剂可以是不足以发生 崩解并且因此可以改变本发明的化合物从该剂型中释放的速率和程度。因此，应该使用一 个足够量的崩解剂(即为了不对改变药物的释放产生不利影响该足够量的崩解剂既不能 太少也不能太多)来形成本发明的固体剂型。所使用的崩解剂的量根据配制品的类型以及 给药方式进行改变，并且对于本领域普通技术人员是容易辨别的。典型地，可以将约0. 5重 量％至约15重量％的崩解剂，优选地约1至约5重量％的崩解剂，用于该药物组合物中。可以用于形成固体剂型的适合的崩解剂包括但不限于琼脂、海藻酸、碳酸钙、微晶 纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、波拉克林钾、淀粉乙醇酸钠、马铃薯淀粉或木薯淀 粉、其他淀粉、预胶化的淀粉、其他淀粉、粘土、其他褐藻胶、其他纤维素、树胶及其混合物。与固体剂型一起使用的适合的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、 轻矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢 化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、麻油、橄榄油、玉米油、以及大豆油)、硬脂酸 锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂、及其混合物。另外的润滑剂包括例如一种硅胶(AER0SIL 200，由W. R. Grace Co. of Baltimore, Md.制造)、一种合成硅石的凝结的气溶胶(由 Degussa Co. of Piano, Tex.销售)、CAB-O-SIL( —种由 Cabot Co. of Boston, Mass.销售 的生热的二氧化硅产品)、及其混合物。可以任选地加入一种润滑剂，典型地以一个少于该 药物组合物的约1重量％的量。优选地，每个固体剂型包含约5mg至约3000mg的本发明的化合物。优选地，每个 固体剂型包含约5mg、约25mg、约100mg、约200mg、约250mg、或约500mg的本发明的化合物。 适合用于口服给药的固体剂型优选地包含从约5mg至约200mg本发明的化合物。其中可以掺入本发明的新的组合物的用于口服给药的液体剂型包括水溶液、适当 味道的糖浆、水性的、以及具有使用油(例如玉米油、棉籽油、麻油、椰子油、或花生油)的有 味道的乳液以及酏剂和类似的药物运载体。还可以将液体配制品用于吸入给药，其中将该 活性组分悬浮在有待使用鼻分配器进行给予的液体中。由此，可以或者通过鼻通道内的粘 膜将活性化合物进行再吸收亦或通过肺进行再吸收。其他的鼻给药组合物以干组合物形式存在，使用一种推进剂气体来将该干燥的组 合物驱使进入鼻通道和/或肺中。此外，可以将包含一种或多种本发明的化合物的药物组合物与任何其他适合的药 物进行组合给予例如用于治疗胃肠疾病。当使用组合治疗时，包含本发明的一种或多种化 合物的药物组合物与第二种药物可以同时地、顺序地或分别地给药。以足以用于其想要的 目的的一个量使用该组合治疗中所使用的各组分。例如，以足以在体内导致所讨论的症状 减轻的量使用该第二药物。
优选地，本发明的化合物的剂量范围是从约Img至约IOOOmg/剂量，更优选地约 2mg至约500mg、甚至更优选地约5mg至约lOOmg、并且仍然更优选地约5mg至约60mg。而 且，所使用的具体的剂量将取决于患者(年龄、体重、等)、以及该疾病的严重性(轻微、中 等、严重)。最后，还可以制备一种包含两种活性成分的药物组合物用于同时给予这些药物。由于消化，当脂肪酶-辅脂肪酶被释放时，本发明的一种或多种药物的给药将正 常地与食物摄取相关联而发生，并且将在十二指肠以下得到最佳的抑制。 ^M给出以下制品以及实例从而使本领域普通技术人员能够更清楚地理解并且实践 本发明。它们不能被认为是限制本发明的范围，而应仅将其视为说明性的或代表性的。配制品实例实例 1制备包含以下成分的硬明胶胶囊量成分(mg/胶囊)活性成分30.0淀粉305.0硬脂酸镁5.0将上述成份进行混合并且以340mg的量填充入硬明胶胶囊中。实例2使用以下成分制备一种片剂处方量成分(mg/片剂)活性成分25.0微晶纤维素200.0胶态二氧化硅 10.0硬脂酸5.0将这些组分进行共混并且压制以形成片剂，每个重240mg。实例3如下制备片剂，每个包含30mg活性成分量成分(mg/片剂)活性成分30. Omg淀粉45. Omg微晶纤维素 35. Omg聚乙烯吡咯酮 4. Omg(为无菌水中10%溶液)羧甲基淀粉钠 4. 5mg硬脂酸镁0. 5mg滑石1. Omg
总计120. Omg将活性成分、淀粉和纤维素经过一个NO :20目美国筛并且进行充分混合。将聚乙 烯吡咯酮的溶液与得到的粉末进行混合，然后将它们经过一个16目美国筛。在50°C至60°C 下将这样生成的粒料进行干燥，并且经过一个16目美国筛。之前将羧甲基淀粉钠、硬脂酸 镁以及滑石经过一个NO 30目美国筛，然后加入该粒料中，混合后将该粒料在压片机上压 制从而生产每个重120mg的片剂。实例4如下制备胶囊，每个包含40mg药物量成分(mg/胶囊)活性成分40. Omg淀粉109. Omg硬脂酸镁l.Omg总计150. Omg将活性成分、淀粉、以及硬脂酸镁进行共混，经过一个NO :20目美国筛，并且以 150mg的量填充入硬明胶胶囊中。实例5如下制备栓剂，每个包含25mg活性成分成分量活性成分25mg饱和脂肪酸甘油酯至2，OOOmg将活性成分经过一个NO 60目美国筛并且悬浮在之前使用必要的最小热量融化 的饱和脂肪酸甘油酯中。然后将该混合物倒入一个标称2. Og容量的栓剂模中并且允许进 行冷却。实例6如下制备悬浮液，每个包含每5. Oml剂量50mg药物成分量活性成分50. Omg黄原胶4. Omg羧甲基纤维素钠(11%)微晶纤维素(89%)50. Omg蔗糖1. 75g苯甲酸钠10. Omg 调味剂和染料q. s.净化水至5. Oml将活性成分、蔗糖以及黄原胶进行共混，经过一个NO 10目美国筛，并且然后与之 前制备的一个溶液(微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液)进行混合。用一些水稀释苯 甲酸钠、调味剂、以及染料并且在搅拌下加入。然后将足够的水加入从而生成所要求的体 积。
实例 7可以如下制备一种配制品量成分(mg/胶囊) 活性成分15. Omg淀粉407. Omg硬脂酸镁3. Omg总计425. Omg将活性成分、淀粉、以及硬脂酸镁进行共混，经过一个NO :20目美国筛，并且以 425. Omg的量填充入硬明胶胶囊中。对于用于本发明的其他适合的配制品可以在E.W.Martin编辑的Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 18th ed. , 1990)中找至Ij0
权利要求
1.一种Wnt5-a肽的一种无支链的氨基甲酸酯衍生物，该α肽选自下组，其组 成为具有SEQ. ID. NO 1的肽、具有SEQ. ID. NO 2的肽、具有SEQ. ID. NO 3的肽、具有SEQ. ID. NO 4的肽、具有SEQ. ID. NO 5的肽、具有SEQ. ID. NO 6的肽、具有SEQ. ID. NO 7的肽、具 有 SEQ. ID. NO 8 的肽、具有 SEQ. ID. NO 9 的肽、具有 SEQ. ID. NO :10 的肽、具有 SEQ. ID. NO 11的肽、具有SEQ. ID. NO :12的肽、具有SEQ. ID. NO :13的肽、具有SEQ. ID. NO :14的肽、以及 具有 SEQ. ID. NO 15 的肽。
2.根据权利要求1所述的一种无支链的氨基甲酸酯衍生物，其中该衍生物选自下组， 其组成为N-甲氧基羰基衍生物、N-乙氧基羰基衍生物、N-正丙氧基羰基衍生物以及N-丁 氧羰基衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的一种Wnt5-a肽的一种无支链的氨基甲酸酯衍生物用于 治疗黑色素瘤和胃癌。
4.一种用于治疗遭受黑色素瘤或胃癌的人的方法，其中将一个治疗活性量的具有选 自下组的一个序列的一个Wnt5_ α肽的一种无支链的氨基甲酸酯衍生物给予所述人，该组 的组成为具有SEQ. ID. NO 1的肽、具有SEQ. ID. NO 2的肽、具有SEQ. ID. NO 3的肽、具有 SEQ. ID. NO 4 的肽、具有 SEQ. ID. NO 5 的肽、具有 SEQ. ID. NO 6 的肽、具有 SEQ. ID. NO 7 的 肽、具有SEQ. ID. NO 8的肽、具有SEQ. ID. NO 9的肽、具有SEQ. ID. NO :10的肽、具有SEQ. ID. NO :11 的肽、具有 SEQ. ID. NO :12 的肽、具有 SEQ. ID. NO :13 的肽、具有 SEQ. ID. NO :14 的 肽、以及具有SEQ. ID. NO 15的肽。
5.一种用于预防性治疗黑色素瘤或胃癌的方法，其中将一个治疗有效量的一种无支链 的氨基甲酸酯衍生物、具体地具有选自下组的一个序列的一个Wnt5_ α肽的N- 丁氧羰基衍 生物给予处于获得黑色素瘤或胃癌的危险区内的受试者，该组的组成为具有SEQ. ID. NO 1的肽、具有SEQ. ID. NO 2的肽、具有SEQ. ID. NO 3的肽、具有SEQ. ID. NO 4的肽、具有SEQ. ID. NO 5的肽、具有SEQ. ID. NO 6的肽、具有SEQ. ID. NO 7的肽、具有SEQ. ID. NO 8的肽、具 有 SEQ. ID. NO 9 的肽、具有 SEQ. ID. NO :10 的肽、具有 SEQ. ID. NO :11 的肽、具有 SEQ. ID. NO 12的肽、具有SEQ. ID. NO :13的肽、具有SEQ. ID. NO :14的肽、以及具有SEQ. ID. NO :15的肽。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述衍生物是选自下组，其组成为N-甲氧基 羰基衍生物、N-乙氧基羰基衍生物、N-正丙氧基羰基衍生物以及N- 丁氧羰基衍生物。
7.一种药物组合物，包含具有选自下组的一个序列的一个Wnt5_ α肽的一种无支链的 氨基甲酸酯衍生物与一种或多种药学上可接受的惰性赋形剂和/或辅助剂组合，该组的组 成为具有SEQ. ID. NO 1的肽、具有SEQ. ID. NO 2的肽、具有SEQ. ID. NO 3的肽、具有SEQ. ID. NO 4的肽、具有SEQ. ID. NO 5的肽、具有SEQ. ID. NO 6的肽、具有SEQ. ID. NO 7的肽、具 有 SEQ. ID. NO 8 的肽、具有 SEQ. ID. NO 9 的肽、具有 SEQ. ID. NO :10 的肽、具有 SEQ. ID. NO 11的肽、具有SEQ. ID. NO 12的肽、具有SEQ. ID. NO :13的肽、具有SEQ. ID. NO :14的肽、以及 具有 SEQ. ID. NO 15 的肽。
8.根据权利要求7所述的一种药物组合物，其中该无支链的的氨基甲酸酯衍生物是 N-甲氧基羰基、N-乙氧基羰基、N-正丙氧基羰基或N- 丁氧基羰基衍生物的组中的一项。
9.根据权利要求7或8所述的一种药物组合物，其中该组合物被配制成一种局部性组 合物。
10.根据权利要求7或8所述的一种药物组合物，其中该组合物被配制成一种可注射的组合物。
全文摘要
本发明涉及一种新颖的无支链的氨基甲酸酯衍生物、具体地某些Wnt5-α肽的N-丁氧羰基衍生物，并且涉及在治疗黑色素瘤或胃癌方面它们的用途，以及一种用于治疗黑色素瘤的方法以及一种包括这种衍生物的药物组合物。
文档编号A61P35/00GK102105162SQ200980129491
公开日2011年6月22日 申请日期2009年8月13日 优先权日2008年8月13日
发明者汤米·安德森 申请人:温特研究公司