专利名称：用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种可用于筛选退色剂的色素化皮肤类 似物及其构建方法。
背景技术：
整形外科手术常用皮片移植修复较大面积的皮肤缺损，术后移植区与周 围皮肤颜色往往不同，多表现为色素沉着增加。近年来由于污染引起的环境 和臭氧层的破坏，使得黑素形成酶出现代谢紊乱，引起患有雀斑、黄褐斑、 老年斑等各种黑色斑症状的患者增多。因而治疗色素沉着过多等色素性疾病 具有较高的社会效益和经济效益。如何解决色素问题，已成为整形外科医师 及皮肤科医师研究的重要课题。
成熟的黑素细胞位于表皮细胞的基底层，是一种树突状细胞，每一个黑
素细胞与周围大约36个角质形成细胞构成"表皮黑素单元"。生理情况下黑 素细胞的增殖力较弱，基底层角质形成细胞和真皮成纤维细胞都可通过分泌 一些生长因子或细胞外基质成分，对黑素细胞形态、黑素合成和转运等活动 进行调节，角质形成细胞还可通过细胞间接触影响黑素细胞的行为。皮片等 移植后的创面修复中，不仅毛囊中角质形成细胞迁移，毛囊外根鞘中的黑素 细胞亦被激活，而在激活和移行中某个环节发生异常，并且局部炎性介质的 改变，可能是导致色素沉着的原因。黑素是一种含氮的复合物，在黑素细胞 的特有器官一黑素小体中合成。皮肤颜色的不同主要由于优/褐黑素比例的不
同、在角质形成细胞中的分布、黑素细胞的活性以及黑素小体的大小、数量、 分布、环境等因素决定。
由于皮肤是个由多种细胞构成的器官，除了角质形成细胞，朗格汉斯细 胞、成纤维细胞等都可影响黑素单元及黑素细胞的功能，其中角质形成细胞、
成纤维细胞在调节黑素细胞生长、形态、色素化及分tt:方面起着积极的作用。 自黑素细胞体外培养成功以来，人们对退色剂的研究进入了快速发展阶段。 由于这种方法具有能方便、快速筛选退色剂的优点，已成为当前研究退色剂 的主要方法。然而由于培养的细胞系及培养条件的不同，实验结果出入较大。 如有些实验使用的细胞系是人或哺乳动物的黑素瘤细胞，而肿瘤细胞的信号
传导途径及对外界刺激的反应均与正常体细胞有很大的不同；有些实验虽采 用正常人表皮黑素细胞，但培养基中添加的分裂原是12-0-十四烷酰佛波醇 -13-乙酯(TPA)，而TPA是一种强促癌剂，因此采用安全、稳定并接近体内环 境的培养系，将更具有说服力。
近年来用于研究黑素细胞及评估各种影响黑素细胞因素的模型很多，但 它们与皮肤结构相差较大，随着生物工程技术的进步及人们研究的深入，逐 步发展了以气-液平面技术来培养色素化皮肤，因此构建与皮肤更相近的模 型，将为黑素细胞体外生物学的研究、退色剂的筛选提供了更为理想的模型， 以期为临床应用治疗色素沉着等色素性疾病提供实验方法和理论依据。
发明内容
为了克服上述现有技术不足，本发明提供一种用于筛选退色剂的色素化 皮肤类似物模型及其构建方法，更接近正常皮肤，可为筛选美白退色剂提供
一种理想的皮肤类似物模型。
本发明的技术方案是这样实现的
本发明一种可筛选退色剂色素化皮肤类似物，由体外培养的皮肤成纤维细 胞与胶原构建真皮类似物层，在其上复合角质形成细胞、黑色素细胞后构建 而成。所述的成纤维细胞、角质形成细胞和黑色素细胞是从人包皮组织分离 后经扩大培养而获取的；成纤维细胞是以2X105/ml~3X 107ml与浓度为20% 的鼠尾I型胶原混合后凝固形成真皮类似物层后，再将角质形成细胞 (1.0X107ml)与黑色素细胞(0.3X107ml)接种于真皮类似物层上。
本发明构建方法包括有灭菌、消化、分离、培养，包括以下步骤
(1) 组织工程皮肤种子细胞来源、分离、培养
a) 手术切除的人包皮组织0.25%洗必泰溶液中浸泡；
b) 2.5g/L的DispaselI酶消化包皮组织，分离表皮、真皮；
c) 真皮组织剪切成lXlXlmm3大小的组织块后，置于成纤维细胞培养 液中扩增培养成纤维细胞；
d) 表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心，置于黑色素细胞培 养液中，培养扩增黑色素细胞；
e) 将成纤维细胞培养于铺满鼠尾I型胶原的培养瓶中，形成成纤维细胞 滋养层，分离表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后:离心置于含滋养层的 培养瓶中，加入KGM-G3F培养液中培养扩增角质形成细胞；
(2) 构建可筛选退色剂的色素化皮肤类似物
a) 成纤维细胞以2xl05/ml~3xl05/ml的密度与浓度为20%的鼠尾I型 胶原混合后凝固形成真皮类似物层；
b) 在表面加入1. OX 107ml的角质形成细胞与O. 3X lOVml的黑色素细 胞置于transwell培养小室中培养，加入KGM-G3F培养液；
c)培养l周后进行气一液平面培养，继续培养2周后获得可筛选退色 剂的色素化皮肤类似物模型。 .
本发明所述的成纤维细胞培养液成分为DMEM商用培养液，15%小 牛血清；所述的黑色素细胞培养液成分为RMP1640商用培养，并含碱性 成纤维细胞生长因子(bFGF) 2~3xl04U/L，霍乱毒素(CT) 0.20~0.25g/L， 转铁蛋白5 10mg/L，小牛血清100~150ml/L，氢化考的松2 5mg/L，胰岛素 100~150U/L，庆大霉素10~15万/L;所述的KGM-G3F培养液成分为 DMEM/F12(3:1)商用培养液，并含100ml~150ml/L胎牛血清，腺嘌呤 0.18~0.20mM，表皮生长因子EGF10~15ng/ml,氢化可的松0.4 0.50ug/ml， 胰岛素3 5ug/ml，异丙肾上腺素10~15uM，转铁蛋白5~10ug/ml，三碘甲状 腺氨酸2 3nM，氨卞青霉素100~120ug/ml，硫酸链霉素80~100ug/ml。
本发明所建立的黑色素细胞培养方法采用含有黑素细胞天然有丝分裂原 bFGF和CT配对的培养基，成功建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系，细 胞形态正常，是一种安全、稳定的培养系。所建立的角质形成细胞、成纤维 细胞培养方法可以使细胞保持高的活力，纯度可达100%。在成功建立细胞系 的基础上，本发明利用气一液三维培养技术成功构建色'素化皮肤类^(物模型， 结果表明构建的色素化皮肤类似物结构完整，表皮细胞和成纤维细胞活力良
好。色素化皮肤类似物构建的过程中随着培养时间的延长，类似物的颜色逐 渐加深。透射电镜显示黑素细胞分布在表皮的基底层，状态良好，胞浆中有 丰富的黑色素颗粒，突起深入到角质形成细胞间，与角质形成细胞关系密切; 角质形成细胞内也有一定数量的、大小不等的黑素小体，分布没有一定的规 律性，散在分布于整个胞浆内，反映了黑素细胞与角质形成细胞之间存有黑 素小体的转移。这一现象模拟了体内"表皮黑素单元"的结构。在表皮细胞 由基底层向角化层的移行过程中，角质形成细胞的胞核逐渐退化，与体内表 皮的表现一致。因此构建的色素化皮肤类似物模拟了皮肤的功能。
图1成纤维细胞培养照片
A显示成旋涡状生长，B波形蛋白染色阳性；
图2黑色素细胞的培养照片
A原代培养3天，B多巴染色阳性；
图3角质形成细胞培养照片
A原代培养9天，B角蛋白染色阳性；
图4真皮类似物照片
A无钢环限制收縮，B有钢环限制收縮，C真皮类似物HE染色； 图5构建的色素化皮肤类似物颜色逐渐加深
A浸没培养3天，B浸没培养7天，C气一液平面'培养4天，D气一液平 面培养9天，E气一液平面培养14天；
图6色素化皮肤类似物HE染色照片，箭头示表皮角质层角化珠；
图7 Fontana Masson染色显示黑色素细胞位于皮肤基底部
图8色素化皮肤类似物透射电镜图片
A角质形成细胞核移行，B黑色素细胞状况；
图9电镜示色素化皮肤类似物中黑素小体的转运过程
箭头示黑素小体；
图10电镜示不同退色剂作用后照片
具体实施例方式
1.细胞的分离和培养
(1) 标本的分离
取健康人包皮环切术(年龄5 10岁)后的标本置于0.25%洗必泰溶液 中浸泡10min，置于0. 01M的PBS缓冲液中漂洗3遍，在超净台上用消毒器 械将皮下组织及肉膜尽量除净，然后将标本剪成lmmX2mm的细条状，在PBS 液中洗涤3次，每次5min,移入2. 5g/L的Dispase II酶中，4。C冰箱过夜冷 消化16-22 h。
(2) 成纤维细胞的培养及鉴定
取出经过冷消化的组织，用眼科镊分离表皮与真皮，将分离的真皮组织 加入适量的小牛血清，再将其剪切成lXlXlmffl3大小的组织块，放入25cm2 的培养瓶中，将培养瓶倒置放入37t、 02的培养箱内，30min后，补加少
量含15X小牛血清的DMEM培养液，再放置于培养箱内，4小时后取出培养瓶， 加入2ml培养液，将培养瓶慢慢翻转平放，静止培养叭第三天再加入5ml培 养液继续培养。每3天换液1次，待成纤维细胞迁移出组织块，生长成细胞 单层(图1A)。实验取第5 — 15代细胞。
取传代培养的成纤维细胞接种于盖玻片上，以含15%小牛血清的DMEM 培养液培养3天后，取出玻片，用预冷的丙酮固定10min，于玻片上滴加过 氧化物酶阻断溶液，5%正山羊血清封闭，室温孵育10min，倾去血清，勿洗， 于玻片上分别滴加一抗(鼠抗人波形蛋白单克隆抗体)，以PBS作为阴性对照， 波形蛋白染色阳性证实为成纤维细胞(图1B)。
(3)黑素细胞的培养
将上述经过冷消化的组织，用小镊子轻轻将表皮与真皮分离，表皮组织 移置于2. 5g/L胰蛋白酶中37-C消化10min，用吸管反复吹打成单细胞，见瓶 内液体混浊即加入与胰酶等量的黑素细胞培养液，以终止胰酶作用，280目 筛网过滤后吸取细胞悬液于离心管内，1000r/min离心10 min，弃上清液， 加培养液吹打成单细胞悬液，重复离心一次，加培养f吹打成单细胞悬液， 细胞计数。按2 4xl04/ml的密度接种于25 ml的培养瓶中，置入50ral/L C02, 37'C孵箱中培养。24 h后首次换液去除未贴壁的细胞，以后2 — 3天换液一 次(图2A)。本实验选用3—4代。取传代培养的3—4代黑素细胞接种于盖 玻片上，贴壁后，10Q^甲醛固定lh，双蒸水漂洗3次，加入O. 1%左旋多巴溶 液，37'C孵育45min,双蒸水漂洗后加入新鲜左旋多巴染液，继续37。C孵育 4h。倒置显微镜下观察，阳性者可见黑素细胞胞浆呈灰棕色或棕褐色(图2B)。
(4)角质形成细胞的培养
取上述培养的成纤维细胞，当其生长接近80%融合时，向HDF中加入丝裂 霉素，最终浓度为10ug/ml，在50mL/LC02， 37""C孵箱中孵育4h，用无妈镁PBS 洗2次，加入0.25y。的胰酶lml，在50ml/LCO2， 37。C孵箱中消化5min，倒置显 微镜下见细胞皱縮，细胞间隙增大即加入培养液中止消化，细胞悬液移入离 心管内，1000r/min离心5min后弃上清液，细胞用培养液重悬后计数，以 lX10Vml接种于已预铺胶原的培养瓶内，培养液为DMEM+15。/Q小牛血清，隔日 使用。
取上述经过冷消化组织，用小镊子轻轻将表皮与，皮分离，表皮组织移 置于2.5g/L胰蛋白酶中37t:消化10min，用吸管反复吹打成单细胞，见瓶内液 体混浊即加入与胰酶等量的KGM-G3F培养液，以终止胰酶作用，IOO目筛网过 滤后吸取细胞悬液于离心管内，1000r/min离心10 min，弃上清液，加KGM-G3F 培养液吹打成单细胞悬液，细胞按2 4X 107ml的密度接种于含HDF滋养层的 25cm2的培养瓶中，置入50ml/LC02， 37。C孵箱中培养，48h后换液，以后每3 天换液一次。每天于倒置显微镜下观察细胞形态(图3A)。取第2至3代细胞用 于实验。
将原代培养的角质形成细胞调整细胞悬液浓度为lX10Vml，吸取lml 细胞悬液接种到培养皿内预铺胶原以及HDF滋养层的载玻片上，放入37。C、 5%0)2培养箱中培养，4天后取出玻片，用预冷的丙酮固定10min，于玻片上 滴加过氧化物酶阻断溶液，5%正山羊血清封闭，室温孵育10min，倾去血清， 勿洗，于玻片上分别滴加一抗(广谱的鼠抗人角蛋白单克隆抗体AE,/AE3)， 以PBS作为阴性对照，阳性证实为角质形成细胞(图3B)。
2.色素化皮肤类似物模型的构建 (l)真皮类似物的培养
取7份鼠尾I型胶原溶液和2份5XDMEM液，混匀置于冰浴中，用 0.5mol/LNa0H调整溶液PH至中性，然后加入l份小牛血清，冰浴中浪匀，将 适量的混悬液加入12孔transwell培养小室中，置于50ml/L C02， 37。C孵箱 中，等待胶原溶液凝固。同时再取7份鼠尾胶原溶液和2份5XDMEM液，混匀 置于冰浴中，用0.5mol/LNaOH调整溶液PH至中性，然后加入l份成纤维细胞 溶液(细胞数2X107ml — 3X107ml，用小牛血清重悬)，冰浴中混匀，将 混悬液加入上述胶原凝胶已经凝固的12孔transwell培养小室中，每孔500 ul，置于50ml/L C02， 37。C孵箱中，待胶原溶液凝固后，补加含15%小牛血 清的DMEM培养液浸没培养，每两天换一次液，培养一周。将培养两周的真 皮类似物用109&甲醛固定液室温固定3h， 25%的蔗糖过夜，冰冻切片，厚度 10um，常规服染色(图4)，结果可见成纤维细胞均匀地分布于胶原中，与 正常真皮组织相比，真皮类似物中的成纤维细胞呈梭形及不规则形，细胞 排列紊乱，大多数细胞两极为两个较长的突起，极少数细胞有较多的突起， 细胞较小，胞核呈椭圆形，胞浆少。凝胶中的支架呈浅红色，波浪状，常 有分支并互相交织。 ，
(2)色素化皮肤类似物的培养
取生长状态良好的黑素细胞和角质形成细胞，常规消化、离心，细胞 记数后以KGM-G3F培养液重悬，将两种细胞悬液混合，调整角质形成细胞 浓度为1.0X107ml、黑素细胞浓度为0.3X107ml。将transwell培养小室 中的培养液吸弃，取150 ul两种细胞混悬液加入到transwell培养小室内 真皮类似物培养后表面所形成的凹槽中，于50ml/L C02, 37t:孵箱内放置 2h，再补加适量的KGM—G3F培养液于transwell培养小室中，浸没培养， 每两天换一次液，浸没培养一周。
一周后，将transwell培养小室中的培养液吸弃，每孔加入适量的KGM 一G3F培养液，将孔中的培养液液面调整至transwell培养小室内室的膜底 水平，进行构建物的气一液平面培养，继续培养两周，以促进角质形成细 胞的成熟角化。色素化皮肤类似物构建的过程中每天记录培养物的状态(图 5)，结果显示在真皮类似物上接种黑色素细胞与角质形成细胞后，浸没培 养的第三天，即可以见到轻微的色素出现，呈浅棕黑或黄褐色，随着培养 时间的延长，类似物的颜色逐渐加深。
将培养的色素化皮肤类似物固定过夜，以70%的酒精脱色后，服染色， 光镜下观察，结果可见体外培养的色素化皮肤类似物，其结构与正常的皮 肤相似，具有上皮层和真皮层，其中上皮层较薄，真皮层较厚，但缺少毛 囊和汗腺等皮肤附属器官；颗粒层不连续，部分颗粒层缺如，颗粒层由大 约卜3层的较扁平的梭形细胞组成，位于棘层上方，胞核大部分己退化， 细胞形态不规则，大小不等，胞浆中含有较多的颗粒；角质层较薄，部分 地方缺失，细胞呈均质状，轮廓不清。大部分角质层为正角化，少部分为 不全角化(图6)。 FontanaMasson染色结果可见基底层含有被染成黑色的 黑素细胞，黑素细胞形态良好(图7)。
透射电镜观察色素化皮肤类似物，结果可见角质形成细胞在由基底层 向角化层移行的过程中细胞核逐渐退化(图8A)。黑色素细胞分布在表皮基
底层，胞浆中有丰富的黑色素颗粒，突起深入到角质形成细胞间(图8B)。 色素化皮肤类似物模型可以允许黑素小体的转移。在模型中我们可以看到 黑素小体从黑素细胞的树突，逐渐靠近黑素细胞树突的胞膜(图9A、 B)， 最后进入角质形成细胞中(图9C、 D)
上述结果表明，本发明成功构建能模拟黑素小体f运过程、与皮肤结构 相似的色素化皮肤类似物。
3.不同退色剂作用于色素化皮肤类似物
实验药物分为芦荟苦素、雄果苷、茶多酚共三大组，吸弃上清液，每孔 加入KGM-G3F 450"l及药物溶液50y 1，每组药物最终浓度分别为1， 0.1, 0. 01 g/L，每一浓度7个孔。空白组每孔加KGM-G3F 450 u 1和50u 1 100ml /L PEH共7个孔。37°C， 50ml/L 0)2孵箱中继续培养一周。
药物作用一周后，将上述三种药物的最高浓度孔及空白组标本各取一 孔，固定，脱水，包埋，常规制作超薄切片，透射电镜观察。结果可见熊 果苷组和芦荟苦素组(均为lg/L):角质形成细胞中的黑素小体较空白组的 少，黑素小体直径变小，角质形成细胞状态良好，胞浆内有少量空泡存在。 茶多酚组(lg/L):角质形成细胞中的黑素小体较熊果苷组和芦荟苦素组的 少，角质形成细胞状态不佳，胞浆内有大量的空泡存在(图IO)。
本发明采用生物工程的方法利用少量的皮肤组织，体外扩增培养黑色 素细胞及影响皮肤色素的另两种重要细胞成纤维细胞及角质形成细胞，利 用这三种细胞成功构建与皮肤结构相似的色素化皮肤类似物模型，该模型 可模拟黑素小体的转运过程，与皮肤结构相似，并可观察不同退色剂的作
用机理，为进一步研究退色剂、化妆品的退色机制提供了理想实验模型。 虽然模型培养过程复杂，但其良好的生理功能已成为国内外研究色素问题 的最佳体外模型，将具有重要的临床价值和社会经济价值。
权利要求
1.一种可筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型，其特征在于，由体外培养的皮肤成纤维细胞与鼠尾I型胶原构建真皮类似物层，在其上复合角质形成细胞、黑色素细胞后构建而成，所述的成纤维细胞、角质形成细胞和黑色素细胞是从人包皮组织分离后经扩大培养而获取的；成纤维细胞是以2×105/ml～3×105/ml与浓度为20％的鼠尾I型胶原混合后凝固形成真皮类似物层后，再将角质形成细胞1.0×107/ml与黑色素细胞0.3×107/ml接种于真皮类似物层上。
2. —种如权利要求1所述的可筛选退色剂的色素化皮肤类似物模型的构 建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)组织工程皮肤种子细胞来源、分离、培养a) 手术切除的人包皮组织0.25%洗必泰溶液中浸泡；b) 2.5g/L的DispaselI酶消化包皮组织，分离表皮'、真皮；c) 真皮组织剪切成lxlxlmr^大小的组织块，放入培养瓶中，30min后， 待成纤维细胞迁移出组织块，扩增培养成纤维细胞；d) 表皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心，置于黑色素细胞培养 液中，培养扩增黑色素细胞；e) 将成纤维细胞培养于含胶原的培养瓶中，形成成纤维细胞滋养层，表 皮组织置于2.5g/L胰蛋白酶中消化后，离心置于含滋养层的培养瓶中，加入 KGM-G3F培养液中培养扩增角质形成细胞； (2)构建可筛选退色剂的色素化皮肤类似物a) 成纤维细胞以2xl05/ml~3xl05/ml的密度与浓度为20%的鼠尾I型胶 原混合后凝固30分钟后，加入培养液培养一周，构建'真皮类似物层；b) 在表面加入1.0xl07/ml的角质形成细胞与0.3xl07/ml的黑色素细胞置 于transwell培养小室中培养，加入KGM-G3F培养液；c) 培养1周后进行气一液平面培养，继续培养2周后获得可筛选退色 剂的色素化皮肤类似物模型。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于；所述的transwell 培养小室为商用培养板；所述的成纤维细胞培养液成分为DMEM商用培养 液，15%小牛血清；所述的黑色素细胞培养液成分为RMP1640商用培养， 并含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 2~3xl04U/L，霍乱毒素(CT) 0.20~0.25g/L，转铁蛋白5 10mg/L，小牛血清100 150ml/L，氢化考的松 2~5mg/L，胰岛素100~150U/L，庆大霉素10~15万/L;所述的KGM-G3F培 养液成分为DMEM/F12(3:1)商用培养液，并含100ml~150ml/L胎牛血清， 腺嘌呤0.18~0.20mM，表皮生长因子EGF10 15ng/ml ，氢化可的松 0.4~0.50ug/ml ，胰岛素3~5ug/ml，异丙肾上腺素10~15uM，转铁蛋白 5 10ug/ml，三碘甲状腺氨酸2~3nM，氨卞青霉素100~120ug/ml，硫酸链霉 素80~100ug/ml。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种可用于筛选退色剂的色素化皮肤类似物及其构建方法，由体外培养的皮肤成纤维细胞与胶原构建真皮类似物层，在其上利用气-液平面三维培养技术接种角质形成细胞、黑色素细胞后构建而成。获得的色素化皮肤类似物与皮肤结构相似，可模拟黑素小体转运过程，并可用于筛选退色剂，为黑素细胞体外生物学的研究、退色剂及美白化妆品的筛选提供了更为科学的模型。
文档编号A61L27/38GK101347640SQ20081015082
公开日2009年1月21日 申请日期2008年9月5日 优先权日2008年9月5日
发明者屠军波, 张铁良, 杨壮群, 王正辉, 鹏 荔 申请人:西安交通大学