恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂的制作方法

专利名称：恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂及诊断试剂盒、以及恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断方法。
背景技术：
黑色素瘤是被称为恶性黑色素瘤的皮肤癌的一种。皮肤癌的种类多种多样，但黑色素瘤为恶性度最高的一种皮肤癌。构成皮肤的细胞中有产生黑色素的细胞，它们被称为色素细胞(黑色素细胞)，此类细胞发生癌化后的状态被称为黑色素瘤。
在日本黑色素瘤的发病数为每10万人口中1.5～2人左右，推测在日本每年有1500～2000人左右发生黑色素瘤。据报道在欧美每10万人口有10人以上的发病率，澳大利亚每10万人口有20人以上的发病率，为世界第一高的发生数字。因此，欧美或澳大利亚的人们对黑色素瘤很重视，很注意黑色素瘤的发生。然而，令人惊奇的是，无论在国外还是在日本，黑色素瘤的发病数有逐年增加的倾向。最近的调查显示，在日本该病引起的每年死亡人数为450人左右。虽然在每个年龄段的人都有可能发生黑色素瘤，但特别多发于40岁以上，60岁～70岁为发生最多的年龄。幼儿的发病率非常少，但也不是完全不发生，最近有在20～30岁左右的年轻人身上发生的倾向。在性别方面没有哪一方特别多的倾向，男女皆有可能发生。日本人的黑色素瘤的易发生部位最多为脚底(脚的内侧面)，约占3成左右。在脚上或指尖部分多发是日本人的特征。此外，与欧美人相同，在身体、手、腿、脸、头等任何一处的皮肤都有可能发生黑色素瘤。
另一方面，血清肿瘤标记物的测定，不仅对黑色素瘤的诊断，对术后病例中复发的早期发现、及发展病例的治疗效果的判定也是非常重要的。作为黑色素瘤的肿瘤标记，迄今为止已知血清中的LDH或5-S-半胱氨酰多巴(5-S-CD)适用，近年来进一步报道了S-100β蛋白及Melanoma inhibitory activity(MIA)等更加敏感的标记物。在日本，广泛使用5-S-CD作为黑色素瘤的标记物。但是，任何一种肿瘤标记物，如果还未发展到所谓的第四阶段，都不呈阳性，因此在黑色素瘤的诊断、或术后复发的早期诊断等方面其适用性受到局限。
本发明人首先通过使用含有23,040种基因的基因组范围的cDNA微阵列技术，研究了在含有20种原发性肝细胞癌(HCC)及胚胎期的各种正常脏器中的上述基因的表达谱，发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)在胚胎期的肝脏、肾脏、肺中表达，在成人的正常器官中除胎盘以外的部位几乎均不表达，与此相对，其在HCC中均呈现高表达状态。另外，进一步报道了该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)为分泌型蛋白，使用ELISA方法可在40％的HCC患者的血清中检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，其作为HCC的新的肿瘤标记物有用(Nakatsura，T.等，Biochem.Biophys.Res Commun.306，16-25(2003))。
1996年，Pilia等报道了编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族成员之一的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)在Simpson-Golabi-Behmel综合征(SGBS)患者中发生突变(Pilia，G.等，Nat.Genet.12，241-247(1996))。SGBS为X连锁障碍，其特征在于，从出生前后的过度发育及在女性携带者中非常轻微的表现型，到男性婴儿的致死症状的宽广范围的临床表现(Neri，G.等，Am.J.Med.Genet)。作为SGBS的临床特征可举出特征的脸型(distinct facialappearance)、腭裂、并指、多指、副乳、囊肿性及异形肾、先天性心脏缺陷等(Behmel，A.等，Hum.Genet.67，409-413(1984)；Garganta，C.L.及Bodurtha，J.N.，Am.J.Med.Genet.44，129-135(1992)；Golabi，M.及Rosen，L.，Am.J.Med.Genet.17，345-358(1984)；及Gurrieri，F.等，Am.J.Med.Genet.44，136-137(1992))。据报道GPC3的突变几乎均为点突变或包含外显子的多个碱基的缺失(Hughes-Benzie，R.M.等，Am.J.Med.Genet.66，227-234(1996)；Lindsay，S.等，J.Med.Genet.34，480-483(1997)；Veugelers.M.等，Hum.Mol.Genet.9，1321-1328(2000)；及Xuan，J.Y.等，J.Med.Genet.36，57-58(1999))。而且，由于患者的表现型与突变的位置没有相关性，因此可以推测SGBS有可能是由功能性GPC3蛋白质的缺损、及与家族内及家族间的表现型之间有关联的其它遗传因素所引发(Hughes-Benzie，R.M.等，Am.J.Med.Genet.66，227-234(1996))，GPC3缺失小鼠的研究结果也支持该假说(Cano-Gauci，D.F.等，J.Cell Biol.146，255-264(1999))。这些小鼠具有常见于SGBS患者的包括过度发育、囊肿性及异形肾等多种异常。
据采用RNA印迹分析的研究报道，GPC3 mRNA在HCC、胎盘、胎儿肝脏、胎儿肺、胎儿肾脏中过度表达(Zhu，Z.W.等，Gut 48，558-564(2001)；Hsu.H.C.等，Cancer Res.57，5179-5184(1997)；及Pellergrini，M.等，Dev Dyn.213，431-439(1998))。
另外，据报道由于GPC3为细胞增殖抑制剂，在某种肿瘤细胞中可诱导发生细胞凋亡(Cano-Gauci，D.F.等，J.Cell Biol.146，255-264(1999))；及Duenas Gonzales，A.等，J.Ceu Biol.141，1407-1414(1998))，因此GPC3的表达在多种起源的肿瘤中被下调。Lin等还提出，GPC3虽然在正常的卵巢中表达，但在某种卵巢癌细胞系中却不能被检测出(Lin，H.等，Cancer Res.59，807-810(1999))。在所有未发现GPC3表达的例子中，GPC3启动子被过度甲基化，编码区域中无突变，通过脱甲基化剂的处理GPC3的表达恢复。另外，还报道了GPC3的异常表达在多种卵巢癌细胞系中抑制了集落形成活性。作为GPC3和癌相关的其他数据，有从与正常大鼠间皮细胞及间皮肿瘤细胞系相关的mRNA差异显示研究中得到的结果(Murthy，S.S.等，Oncogene 19，410-416(2000))。在该研究中发现，GPC3在肿瘤细胞系中不断被下调。另外，相同的下调还出现在来源于原发性大鼠间皮细胞肿瘤及人间皮细胞肿瘤的细胞系中。与卵巢癌相同，GPC3编码序列中未出现突变，但几乎在所有的细胞系中的GPC3启动子区域均发现了异常甲基化。如报告所示(DuenasGonzales，A.等，J.Cell Biol.141，1407-1414(1998))，间皮肿瘤细胞系中的GPC3的异常表达抑制了集落形成活性。而最近，Xiang等报道了GPC3在人乳腺癌中也不表达(Xiang，Y.Y.等，Oncogene20，7408-7412(2001))。上述数据显示，GPC3在这些癌中起到了生长的负调节的作用。即，GPC3的表达在成人的GPC3阳性组织产生的癌中的肿瘤发展过程中降低，该降低现象被认为在恶性表现型的产生中起到了一定作用。
相反，就HCC而言，肿瘤在只在胎儿中表达GPC3的肝脏组织中产生，GPC3在肿瘤向恶性发生转变时具有再次表达的倾向。GPC3的再次表达在此类肿瘤的发展中是否重要还不清楚。在此数年中，已证实细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)对成纤维细胞生长因子(FGF)及Wnt等肝素结合性生长因子的最佳活性十分必要(Yayon，A.等，Cell 64，841-848(1991)；及Schlessinger，J.等，Cell 83，357-360(1995))。磷脂酰肌醇蛋白聚糖属于GPI锚定型细胞表面的HSPG家族，在肿瘤形成与GPC3表达水平的关系中该组织的特异性差异，推测是因为GPC3在各组织中使成长和生存因子不同而进行调节。GPC3被认为至少在这些脏器中作为癌胚蛋白发挥作用。一般而言，癌胚蛋白在肿瘤的发展中并未起着重要的作用，但可以作为肿瘤标记物或免疫治疗的标靶进行使用(Coggin，J.H.Jr.，CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 5，37-55(1992)；及Matsuura，H.及Hakomori S.-I.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，6517-6521(1985))。对于GPC3的癌胚作用能否用在临床用途中、该磷脂酰肌醇蛋白聚糖的再次表达在HCC的发展中是否重要等方面还有待深入研究。

发明内容
作为黑色素瘤的肿瘤标记物，有血清的LDH或在日本广泛使用的5-S-半胱氨酰多巴(5-S-CD)、以及近年来作为更加敏感的标记物报道的S-100β蛋白及黑色素瘤活性抑制剂(MIA)，但任一种肿瘤标记物，如果还未发展到所谓第IV阶段的程度，都不呈阳性，因此在黑色素瘤的诊断、或术后复发的早期诊断等方面其适用性受到限制。在黑色素瘤的早期诊断中有必要使用有效的肿瘤标记物。即，本发明的课题为提供一种新型且在临床上有效的恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂。
本发明人首先通过cDNA微阵列技术鉴定了人肝细胞癌中特异地过量表达的、作为新型癌胚蛋白的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)，在HCC患者血清中检测出可溶性GPC3蛋白质，证明GPC3为HCC的新型肿瘤标记物。本发明人此次首次发现在小鼠黑色素细胞株B16中GPC3的表达，证实GPC3在黑色素瘤中也与在HCC中同样地高表达，可以作为有效的肿瘤标记物。另外本发明人进行的用于确认的试验结果显示，GPC3可作为迄今为止尚未出现过的可进行黑色素瘤早期诊断的肿瘤标记物。本发明基于上述发现而完成。
即，本发明提供以下(1)～(6)项内容。
(1)恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂，该诊断试剂包含抗GPC3的抗体、或可检测GPC3表达的探针或引物。
(2)恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断用试剂盒，该诊断试剂盒包含抗GPC3的抗体、或可检测GPC3表达的探针或引物。
(3)恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断方法，该诊断方法包含检测或测定样品中的GPC3的步骤。
(4)如(3)所述的诊断方法，该方法包含使样品与抗GPC3的抗体相接触的步骤。
(5)如(3)或(4)所述的诊断方法，该方法包含定量样品中的GPC3的步骤。
(6)将GPC作为恶性黑色素瘤(melanoma)的肿瘤标记物使用的方法。


图1表示GPC3 mRNA的表达。
A小鼠细胞系中的GPC3 mRNA的表达电泳道1EL4，2Colon26，3B16，4MH129F，5MH129P，6MH134该结果显示在B16黑色素瘤细胞系中GPC3 mRNA有强烈的表达，但在EL4，Colon26，MH129F，MH129P，MH134中未见类似的表达。
B人黑色素瘤细胞系中的GPC3 mRNA的表达电泳道1164，2888mel，3Ihara，4CRL1579，5526mel，6G361，7MeWo，8SK-MEL-28，9SK-MEL-19，10Colo38，11HMV-I，12HEMn(黑色素细胞)在164、888mel、Ihara、CRL1579、MeWo黑色素瘤细胞系中GPC3 mRNA有强表达，在526mel、G361、SK-MEL-28细胞系中有中等程度的表达，而在SK-MEL-19，Colo38，HMV-I中未见类似的表达(图1B)。另外，在培养的黑色素瘤细胞中也发现有一些表达。
C在人黑色素瘤组织中GPC3 mRNA的表达电泳道1正常皮肤，2Pt1黑色素瘤原发灶，3Pt2黑色素原发灶，4Pt2黑色素瘤淋巴结转移灶，5Pt3黑色素瘤原发灶，6Pt4黑色素瘤原发灶，7先天性色素痣病例1，8先天性色素痣病例2并未在正常皮肤中发现GPC3 mRNA的表达，但几乎在所有黑色素瘤组织中都发现GPC3 mRNA的表达。另一方面，在先天性色素痣中也发现了GPC3 mRNA的表达。
图2表示经免疫组织化学分析得出的在黑色素瘤和色素痣中的GPC3蛋白质的表达。
A(Pt6)X100 GPC3黑色素瘤癌化部分与非癌化部分的交界区域，B(Pt7)X200 GPC3黑色素瘤癌化部分，C色素痣病例3X100 GPC3在正常皮肤中GPC3蛋白质几乎不表达，相反，在黑色素瘤细胞及色素痣中GPC3蛋白质具有高表达。
图3A表示黑色素瘤细胞系分泌到培养上清中的GPC3蛋白质的ELISA定量结果。将1ml 1×105个HepG2细胞培养24小时后的培养上清中的GPC3蛋白质浓度规定为1U/ml。虽然比HepG2培养上清中的GPC3蛋白质的量少，但在11种黑色素瘤细胞株中，有5种培养上清中检测出GPC3蛋白质。
图3B表示黑色素瘤患者血清中的可溶性GPC3蛋白质的存在。通过ELISA对91名术前黑色素瘤患者、5名巨大先天性色素痣患者、及60名健康的供体(HD)的血清中的GPC3蛋白质的量进行评价。在60名HD、5名巨大先天性色素痣患者血清中完全未检测出GPC3蛋白质。91名黑色素瘤患者的39.6％(36/91)、5名巨大先天性色素痣患者的0％(0/5)、HD的0％(0/60)为GPC3蛋白质阳性。而且，其中在可以追踪术后情况的所有14个例子中，在摘除手术后血清中均未检测出GPC3蛋白质。
图4A表示黑色素瘤患者血清中的各阶段的可溶性GPC3蛋白质的存在。(+)为在术前患者、(-)为在术后患者中不存在黑色素瘤的病例。N为病例数。
图4B表示黑色素瘤患者血清中的各阶段的5-S-CD。
表示与图4A相同的病例的5-S-CD(nmol/L)。设定界值为10(nmol/L)。
图4C表示黑色素瘤患者血清中的各阶段的MIA。
表示与图4A相同的病例的MIA(ng/ml)。设定界值为17(ng/ml)。
具体实施例方式
本发明人采用(Nakatsura，T.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.306，16-25(2003))中记载的方法，发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)是对黑色素瘤的早期诊断有效的血清肿瘤标记物。
人GPC3蛋白质的氨基酸序列已经被公布，例如可以作为Accession No.NP 004475登录GenBank的蛋白质数据库，对于本领域人员来说可以容易的获取。
本发明提供一种恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂，其含有抗GPC3的抗体、或可检测GPC3表达的探针或引物。
可以通过本领域人员公知的方法(参照例如“新生化学实验讲座1，蛋白质I，389-406，东京化学同人”)制备抗GPC3的抗体。GPC蛋白质的氨基酸序列如上所述已公知，可采用通常的蛋白质表达技术制造基于该氨基酸序列的GPC蛋白质，还可以采用市售的产品(Santa Cruz，CA)。在使用市售的GPC3时，优选根据需要采用SDS-OutTM(十二烷基磺酸钠沉淀剂，Sodium Dodecyl SulfatePrecipitation Reagent；经PIERCE，Rockford，IL购得)以除去SDS。而GPC3的部分肽，可通过从GPC3的氨基酸序列中选择适当的部分序列，使用通常的肽类合成技术进行制造。
多克隆抗体的制备可通过在例如兔、豚鼠、小鼠、鸡等动物中给予适量的GPC3蛋白质或其部分肽进行。给药也可与能够促进抗体产生的佐剂(FIA或FCA)共同进行。给药通常进行数周时间。通过进行多次免疫，可提高抗体滴度。最终免疫后，通过从免疫动物身上采血获得抗血清。对于该抗血清，可通过例如硫酸铵沉淀或阴离子色谱法进行分离，通过使用蛋白A或固化抗原的亲和色谱进行纯化，可制备多克隆抗体。另一方面，单克隆抗体的制备可通过将GPC3蛋白质或其部分肽按照上述相同的方法免疫动物，在最终免疫后，从该免疫动物中取出脾脏或淋巴结。使用多克隆抗体使在该脾脏或淋巴结中含有的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞发生融合，制备杂交瘤细胞。筛选目标杂交瘤细胞进行培养，可从该培养上清制备单克隆抗体。单克隆抗体的纯化可通过例如使用硫酸铵沉淀或阴离子色谱法进行分离，通过使用蛋白A或固化抗原的亲和色谱进行纯化。另外，为了本发明的目的，抗体还可为识别GPC3的任一种抗原表位的抗体。
本发明中使用的抗体可使用如上所述制备的免疫球蛋白组分，也可以使用仅将与GPC3蛋白质结合的部位分离的F(ab’)2，Fab’，Fab等组份。
为了达到作为诊断试剂的准确性，抗体优选人源抗体或人抗体。人源抗体例如如果是小鼠-人嵌合抗体可如下制备，即从产生抗GPC3蛋白质的抗体的小鼠细胞分离抗体基因，将其H链恒定部分重组为人IgE H链恒定部分基因，导入小鼠骨髓细胞中进行制备。另外，人抗体可通过使用GPC3蛋白质对将免疫系统与人进行转换的小鼠进行免疫而制备。
本发明的诊断试剂中的抗体浓度并无特别限制，例如可使用0.1至10μg/ml的浓度。诊断试剂中除了上述抗GPC3抗体外，还可根据需要含有适量的可药用的载体等。
本发明还提供一种包含检测或测定样品中的GPC3的黑色素瘤的诊断方法。例如，通过使样品与抗GPC3抗体接触，可检测或测定样品中的GPC3。作为本发明的样品，可举出从怀疑患有黑色素瘤的被检测者身上得到的血清、唾液、或尿等体液、或皮肤组织切片等，优选为血清。样品与上述抗体的接触可通过本领域通常使用的方法进行，并无特别限定。
以皮肤组织切片作为样品时，使用抗GPC3抗体对通过常用方法制备的脏器的组织切片进行免疫染色，通过观察有无GPC3的表达，可以判断是否生成恶性黑色素瘤(melanoma)。
而以血清等体液作为样品时，如可通过在使上述样品和上述抗体接触后，使用荧光物质或发光物质、酶等标记的二次抗体等对样品中存在的GPC3和抗体的特异结合进行定量检测，由此进行。
即，为了通过本发明的方法检测或测定样品中的GPC3，只要使样品和抗GPC3抗体反应，检测出为反应生成物的复合物即可。通过预先将酶、放射性物质、荧光物质等标记物与抗体相结合，可检测出为反应生成物的复合物。具体而言，可采用抗GPC3抗体，通过例如三明治法、竞争法、凝集法、或蛋白质印迹法等公知的测定法检测或测定GPC3，由此，能够诊断恶性黑色素瘤(melanoma)。
另外，用于诊断的反应可在孔等液相中进行，或也可在固定了抗GPC3抗体的固相支撑物上进行。此时，通过与采用未患黑色素瘤的正常样品、或证明为黑色素瘤的样品预先制作的标准值作比较，可判断测定值是否为黑色素瘤阳性。另外，在诊断时，优选测定多数黑色素瘤患者和健康人的血清中GPC3的量，设定界值。
本发明的诊断方法，除了可用于诊断是否患有黑色素瘤，还可以经时性地用于确认针对黑色素瘤的治疗效果。
另外，在本发明的恶性黑色素瘤(melanoma)诊断中检测或测定GPC3时，不仅仅将GPC3作为蛋白质检测，还可以使用检测GPC3的mRNA的方法。即，可以使能与GPC3的mRNA杂交的DNA或RNA与样品反应，检测样品中GPC3的mRNA与DNA或RNA的杂交产物。作为检测mRNA的方法，可以举出如原位杂交法、RNA印迹法、RT-PCR法等。即，通过本发明，可提供一种含有可检测GPC3的表达的探针或引物的恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂。上述探针或引物，本领域人员可基于公知的GPC3蛋白质的氨基酸序列(例如GenBank的蛋白质数据库的Accession No.NP 004475)进行适当的设计及制备。
本发明可进一步提供一种包含抗GPC3的抗体、或可检测GPC3表达的探针或引物的恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断用试剂盒。作为本发明的试剂盒，如果使用抗GPC3的抗体，可举出含有在进行三明治法、竞争法、凝集法、或蛋白质印迹法等分析时所必需的试剂的试剂盒。另外，如果使用可检测GPC3表达的探针或引物，可举出含有在进行原位杂交法、RNA印迹法、RT-PCR法等分析时所必需的试剂的试剂盒。
本发明还涉及作为恶性黑色素瘤(melanoma)的肿瘤标记物使用GPC3的方法。该方法包含通过使用GPC3作为恶性黑色素瘤(melanoma)的肿瘤标记物以诊断恶性黑色素瘤(melanoma)的所有方法，其方案并无特别限制。作为恶性黑色素瘤(melanoma)的肿瘤标记物使用GPC3的方法的具体例子，包含使用抗GPC3抗体，通过例如三明治法、竞争法、凝集法、或蛋白质印迹法等检测或测定样品中的GPC3的方法、以及，使用可检测或测定GPC3表达的探针或引物，通过原位杂交法、RNA印迹法、RT-PCR法等检测或测定样品中GPC3的表达的方法。
以下举出实施例对本发明进行进一步说明，本发明并不限定于下述实施例。
实施例[实施例1]小鼠细胞株中GPC3 mRNA的表达对使用逆转录-PCR(RT-PCR)的GPC3 mRNA表达进行了研究。为小鼠细胞系的MH129F、MH129P及MH134来源于东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心。EL4、Colon26、B16由熊本大学的M.Ogawa博士馈赠。
RT-PCR根据公知的方法(例如Nakatsura，T.等，Biochem.Biophys.Res Commun.281，936-944(2001))进行。设计扩增500bp片段的小鼠GPC3基因特异性PCR引物，使用其进行由94℃、5分钟的初期变性、及58℃的退火温度的30个扩增循环构成的RT-PCR反应。使用的GPC3 PCR引物的序列为有义5’-ACGGGATGGTGAAAGTGAAGA-3’(序列编号1)、反义5’-GAAAGAGAAAAGAGGGAAACA-3’(序列编号2)。
比较小鼠细胞系中的GPC3 mRNA的表达。其结果显示在B16黑色素瘤细胞系中GPC3 mRNA有强表达，但在EL4、Colon26、MH129F、MH129P、MH134中未见上述表达(图1A)。
人黑色素瘤细胞株中的GPC3 mRNA的表达对使用逆转录-PCR(RT-PCR)的GPC3 mRNA表达进行了研究。为黑色素瘤细胞系的G361、CRL1579、SK-MEL-28、HMV-I及HMV-II来源于东北大学加龄医学研究所医用细胞资源中心。另外，526mel、888mel由庆应大学的Y.Kawakami博士馈赠。另外，Ihara、MeWo、colo38由熊本大学的T.Kageshita博士馈赠。而培养人表皮黑色素细胞HEMn由クラボウ(仓敷纺织株式会社)处购得。
RT-PCR根据公知的方法(例如Nakatsura，T.等，Biochem.Biophys.Res Commun.281，936-944(2001))进行。设计扩增939bp片段的人GPC3基因特异性PCR引物，使用其进行由94℃、5分钟的初期变性、及58℃的退火温度的30个扩增循环构成的RT-PCR反应。使用的GPC3 PCR引物序列为，有义5’-GTTACTGCAATGTGGTCATGC-3’(序列编号3)、反义5’-CTGGTGCCCAGCACATGT-3’(序列编号4)，用于对照实验的β-肌动蛋白PCR引物序列为有义5’-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3’(序列编号5)、反义5’-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3’(序列编号6)。
经对照的β-肌动蛋白mRNA进行标准化后，对在黑色素细胞系中的GPC3 mRNA的表达进行比较。其结果显示在164、888mel、Ihara、CRL1579、MeWo黑色素瘤细胞系中GPC3 mRNA有强表达，在526mel、G361、SK-MEL-28细胞系中有中等程度的表达，在SK-MEL-19、Colo38、HMV-I中未见上述表达(图1B)。另外，在培养的黑色素细胞中发现有若干表达。
人黑色素瘤组织中的GPC3 mRNA的表达同样的，对人正常皮肤、人黑色素瘤、人色素痣组织中的GPC3mRNA表达进行了研究。检测样品来自熊本大学医学部皮肤科学讲座中接受治疗的知情同意志愿者，由T.Kageshita博士馈赠。其结果显示在正常皮肤中未发现GPC3 mRNA的表达，而在几乎所有的黑色素瘤组织中均发现GPC3 mRNA的表达。另一方面，在先天性色素痣中也发现了GPC3 mRNA的表达。
在黑色素瘤中的GPC3蛋白质的表达对从21名黑色素瘤患者身上切除的黑色素瘤组织周围的黑色素瘤和非癌性区域、及从11名色素痣患者身上切取的色素痣组织周围的色素痣和正常皮肤区域中的GPC3进行了免疫组织化学分析。
免疫组织化学分析根据本领域公知的方法进行(Nakatsura，T.等，Biochem.Biophys.Res Commun.281，936-944(2001))。将以福尔马林固定的石蜡包埋的厚度为4μm的组织样品切片与稀释至1∶200的抗GPC3抗体共同染色。代表性的结果在图2中表示。
如图2A、B所示，与正常皮肤中GPC3蛋白质几乎不表达相反，黑色素瘤2例中在黑色素瘤细胞中GPC3蛋白质为高表达。另一方面，如图2C所示，色素痣中GPC3也为高表达。黑色素瘤的21例中的17例(81.0％)及色素痣中的11例中的10例，GPC3蛋白质为高表达。
黑色素瘤细胞系的培养上清及黑色素瘤患者血清中的可溶性GPC3蛋白质的存在为了对GPC3 303-464位的氨基酸对应的重组蛋白质而制造的抗GPC3兔多克隆抗体(Santa Cruz，California)进行生物素化，使用FluoReporter Mini-Biotin-XX蛋白标记试剂盒(F-6347)(MolecularProbes，Inc.，Eugene)。将96孔的ELISA板(Nunc，Denmark)在4℃、一晚上、PBS、pH7.4的条件下采用0.1μg/孔的抗人GPC3303-464(Santa Cruz)进行涂布。然后，使用100％BLOCK S(大日本制药株式会社)，在室温下对板进行1小时的封闭。将阳性对照的标准样品及培养上清、用10％BLOCK S稀释了200倍的患者血清与生物素化抗GPC3抗体共同添加，在室温下进行2小时的孵育。以PBS洗涤3次以后，在各孔中添加HRP-共轭链霉素亲合素(ENDOGEN，Woburn)。在30分钟的孵育后，以PBS洗涤3次板，添加TMB基质溶液(ENDOGEN)。使用ELISA READER(型号550，Bio-Rad)在405nm下进行分析。
获得知情同意后，从熊本大学医学部皮肤科学讲座中接受治疗的黑色素瘤患者身上获得血清样品。有报道指出GPC3为GPI-锚定型膜蛋白，可能是一种分泌型蛋白(Filmus J.，Glycobiology 11，19R-23R(2001))。本发明人之前报道了该磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一种分泌型蛋白，并可使用ELISA方法在40％的HCC患者的血清中检测出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)，这是一种有效的HCC的新型的肿瘤标记物(Nakatsura，T.等，Biochem.Biophys.Res Commun.306，16-25(2003))。因此此次在黑色素瘤中也尝试检测了GPC3是否也是分泌产生的。
使用抗GPC3 303-464抗体及生物素化抗GPC3抗体通过酶联免疫吸附检测法(ELISA)进行检测。使用GPC3 303-464对应的市售的重组蛋白质，确认在ELISA系统中GPC3的定量的精度。对使用HepG2培养上清的连续稀释、基于OD数据定量GPC3蛋白质的标准曲线进行了评价。将1ml 1×105个HepG2细胞培养24小时后的培养上清中的GPC3蛋白质的浓度规定为1U/ml。虽然比HepG2培养上清中的GPC3蛋白质的量少，但在11种类的黑色素瘤细胞株中，有5种的培养上清中检测出GPC3蛋白质。另外，在培养黑色素细胞的培养上清中未检测出GPC3蛋白质(图3A)。
然后，进行黑色素瘤患者血清中的可溶性GPC3蛋白质的检测(图3B)。从91名术前黑色素瘤患者身上采取血液样品，从医疗记录收集患者资料，基于TNM分类决定临床阶段。使用ELISA评价了91名黑色素瘤患者、5名巨大先天性色素痣患者、及60名健康供体(HD)的血清中的GPC3蛋白质的量(图3B)。在60名HD及5名巨大先天性色素痣患者中的血清中的完全未检测出GPC3蛋白质。91名黑色素瘤患者的39.6％(36/91)、5名巨大先天性色素痣患者的0％(0/5)、HD的0％(0/60)的GPC3蛋白质为阳性。并且，其中可以追溯术后经过的全部14例中，在摘除手术后血清中未检测出GPC3蛋白质。表1表示黑色素瘤患者血清中的可溶性GPC3、5-S-CD、MIA。
表1

a比同一临床阶段组的其他例子显著高的值用下划线表示从图4A、B、C、及表1的结果可知，现有的黑色素瘤的肿瘤标记物、5-S-CD(图4B)、最近很受关注的MIA(图4C)的任一种均只对发展为阶段III、IV的黑色素瘤有效，而GPC3(图4A)对阶段0、I、II的早期的黑色素瘤的诊断也有效，证明其作为黑色素瘤的新型肿瘤标记物有效。需要说明的是，MIA测定法中使用德国Roche公司的MIA ELISA试剂盒。
表2表示黑色素瘤肉眼分类的黑色素瘤患者血清中的可溶性GPC3。
表2

从表2的结果可知，与日本人中多在脚内侧发生的肢端雀斑型相比，对欧美人群中多见的表浅蔓延型或恶性雀斑型的诊断的倾向更强，可认为不仅对日本，对世界范围内的黑色素瘤的诊断也具有充分意义。
产业实用性通过本发明，证实GPC3作为可进行黑色素瘤的早期诊断的肿瘤标记物有效。根据本发明使用GPC3作为黑色素瘤的肿瘤标记物，可以在早期且简便的对是否患有黑色素瘤进行诊断。GPC3对于针对世界范围内的广大黑色素瘤患者的癌症诊断的用途非常有效。
序列表<110>熊本技术产业财团<120>恶性黑色素瘤的诊断试剂<130>A41803A<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>1acgggatggt gaaagtgaag a21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>2gaaagagaaa agagggaaac a21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物
<400>3gttactgcaa tgtggtcatg c21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>4ctggtgccca gcacatgt18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5cctcgccttt gccgatcc18<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6ggatcttcat gaggtagtca gtc 2权利要求
1.恶性黑色素瘤的诊断试剂，该诊断试剂包含抗GPC3的抗体、或可检测GPC3表达的探针或引物。
2.恶性黑色素瘤的诊断用试剂盒，该试剂盒包含抗GPC3的抗体，或可检测GPC3表达的探针或引物。
3.恶性黑色素瘤的诊断方法，该方法包含检测或测定样品中的GPC3的步骤。
4.如权利要求3所述的诊断方法，该方法包含使样品与抗GPC3的抗体接触的步骤。
5.如权利要求3或4所述的诊断方法，该方法包含定量样品中的GPC3的步骤。
6.作为恶性黑色素瘤的肿瘤标记物使用GPC的方法。
全文摘要
本发明的目的为提供一种恶性黑色素瘤(melanoma)的新型且在临床上有效的诊断试剂。根据本发明，可提供一种含有抗GPC3抗体、或可检测GPC3表达的探针或引物的恶性黑色素瘤(melanoma)的诊断试剂。
文档编号A61BGK1894587SQ20048003220
公开日2007年1月10日 申请日期2004年10月28日 优先权日2003年10月29日
发明者西村泰治, 中面哲也 申请人:财团法人熊本高新技术产业财团