专利名称：用于治疗黑色素瘤的雄黄的制作方法
用于治疗黑色素瘤的雄黄
技术领域：
本发明涉及雄黄的用途，尤其涉及在皮肤疾病领域中的应用。背景技术：
黑色素瘤是目前恶性肿瘤中发病率增长最快的一种，年增长率约3% 5%。尽管 对III期患者来说高剂量IFN-a作为辅助治疗能够降低25% 30%相对复发风险，并已 有2个临床试验证实这部分患者可得到生存获益；也尽管对IV期转移性黑色素瘤患者来 说，高剂量IL-2客观反应率可达到15%，并有6. 6 %的CR率，且获CR的患者可持续CR数 年之久，但总体来说，目前仍然没有找到治疗转移性黑色素瘤最为有效的方法。雄黄最早载于《神农本草经》，辛温有毒，归肝、大肠经，其成分为二硫化二砷，具有 解毒、杀虫、燥湿、祛痰、截疟等作用，多作为外用药治疗痈疮肿毒、虫蛇咬伤、虫积腹痛、疥 癣秃疮。现代研究表明，雄黄具有抗肿瘤作用，其机制为抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细 胞凋亡、抑制核酸合成、诱导肿瘤细胞分化，作为血管内皮细胞抑制荆，雄黄有直接细胞毒 作用等。雄黄对于K562，NB4等白血病细胞具有抑制作用，同时也能诱导实体肿瘤细胞 的凋亡，如肺腺癌细胞SPC-A-1，肝癌细胞系BEL-7402，卵巢癌细胞株(OVCAR、GC、JAM、 CI80-13S)，其抗癌谱十分广阔。而同时雄黄的毒副作用通常也是在临床上十分关注的。
发明内容本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种雄黄的新用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是雄黄在制备治疗皮肤肿瘤疾病药物中的应用。所述的皮肤肿瘤疾病是黑色素瘤疾病。本发明优点在于(1)本发明对雄黄发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。(2)本发明的雄黄药理作用强，预示着很好的药用前景。(3)雄黄对于细胞的周期没有明显的影响，而是从细胞凋亡的方面，通过诱导细胞 凋亡而达到损伤黑色素瘤细胞的作用，从而治疗黑色素瘤皮肤疾病。
图1雄黄对细胞存活率的影响。
图2时效曲线。
图3生长曲线。
图4:A375正常组染色结果(400 X)
图5:A375给药组染色结果(400 X)
图6:L02正常组染色结果(400 X)
图7 :L02给药组染色结果(400 X)图8 :MKN45正常组染色结果(400 X)
图9 :MKN45给药组染色结果(400 X)图10 雄黄对三株细胞凋亡的影响，数据显示经药物作用一定时间以后，不同的 细胞的凋亡程度不同，而对于正常细胞，其凋亡指数< 5%，可以认为没有发生细胞凋亡。图11 雄黄对三株细胞周期的影响，数据显示经药物作用一定时间以后，细胞周 期发生了不同的改变，但是总的来说，其周期改变的程度并不明显，由此推断雄黄在细胞周 期改变的方面并没有显著的作用。图12 雄黄对三株细胞上清LDH的影响，雄黄作用后36小时，细胞上清的LDH相 对与未加药组有不同程度的上升，其中MKN-45的升高程度最为明显，而细胞凋亡或坏死而 造成的细胞膜结构的损害或完全裂解导致细胞浆内的酶释放外泄到培养液里，其中就包括 活性稳定的乳酸脱氢酶，所以结果显示雄黄对于MKN-45的损伤相对较深，而A375相对于正 常细胞基本没有显著的差异。图13 雄黄对三株细胞上清AKP的影响，雄黄作用后36小时，细胞上清的AKP相 对与未加药组有不同程度的上升，其中MKN-45的升高程度最为明显，提示药物可能对于 MKN-45细胞的促增生和分化作用比较强。图14 细胞中总LDH含量测定结果，对照组与实验组的总LDH含量无显著变化。图15 细胞中总AKP的含量测定结果。与对照组相比，上述三株细胞的实验组的 AKP都有不同程度的降低，推断雄黄对上述三株细胞均有一定程度的损伤。图16 雄黄对L02的DNA ladder检测结果。图17雄黄对KMN-45和A375的DNA ladder检测结果，正常细胞的对照组与实验 组无显著差异，都无明显的DNA ladder。与对照组相比，MKN-45, A375的实验组都有DNA ladder。图18 :GSH的测定结果，由图可知，雄黄作用24小时后，四株细胞的GSH水平都有 不同的增高，也都呈剂量依赖性的增高，H印G2，L02尤其明显。图19 :R0S的测定结果，由图可知，雄黄作用24小时后，四株细胞的R0S水平都有 不同程度的降低，也都呈剂量依赖性。
具体实施方式下面结合附图对本发明的具体实施方式
作详细说明。实施例1雄黄致肿瘤细胞凋亡的作用实验实验方法1.测定雄黄母液的砷浓度2.测定半数抑制浓度(IC5Q)值3.测定时效曲线4测定生长曲线5.通过HE染色观察细胞形态受试药物雄黄
受试细胞:A375,MKN45，8898，HepG2, L02A375(人黑色素瘤细胞株)；MKN45 (人胃癌细胞株)；8898 (人胰腺癌细胞株)， H印G2 (人肝癌细胞株)，L02 (正常人肝细胞)。一.实验材料1.主要仪器Bio-Rad 公司酶标仪(550 型)；倒置光学显微镜；96、24、6孔细胞培养板；2.主要试剂MTT四甲基偶氮唑蓝；RPMI-1640 培养基；二.实验方法1.测定雄黄母液的浓度经原子吸收光谱法测定砷浓度，实验结果由华东理工大学化学分析测试中心提 {共。2.测定雄黄药品的半数抑制浓度(IC5(I)值浓度设定10 u g/ml ；5 u g/ml ；2. 5 u g/ml ；1. 25 u g/ml ；0 共 5 个浓度细胞给药培养；取96孔细胞培养板，每孔接种细胞悬液lOOiiL、浓度1 X 105/mL，于37°C，5% C02 培养箱中培养。4小时后取出细胞培养板。每孔加入不同稀释浓度的药物100 yL;空白对 照组加培养液100P L。每组浓度设3个复孔。置37°C，5% C02及饱和湿度的培养箱培养 24h。细胞活性测定；实验终止前4小时取出细胞培养板，先以倒置显微镜下观察，后在每孔中加入MTT 工作液20iiL，终浓度5g/L。培养结束后，每孔加入lOOylDMSO，振荡lOmin。待MTT还原 产物完全溶解，在酶标仪上选择以492nm为检测波长，630nm为参考波长测定光密度值(0D 值)。计算细胞的存活率，并以不同时间点和细胞的存活率作图，实验重复三次。细胞存活率=[试验组0D平均值]/ [空白对照组0D平均值]X 100 %3.测定时效曲线时间点设定Oh，6h，12h，24h，36，48h细胞给药培养；取96孔细胞培养板，每孔接种细胞悬液100 y L、浓度随测定时间的增加而降低， 于371，5%0)2培养箱中培养。4小时后取出细胞培养板。每孔加入两倍IC5(1值浓度的药 物(L02除外，加入lOug/ml浓度的药物)，空白对照组加培养液100yL。每组浓度设3个 复孔。置37°C，5 % C02及饱和湿度的培养箱培养。细胞活性测定；实验终止前4小时取出细胞培养板，先以倒置显微镜下观察，后在每孔中加入MTT
Heraeous公司二氧化碳培养箱； 无菌操作台 磁力搅拌机
二甲基亚砜(DMS0，分析纯)； 苏木素伊红溶液工作液20 u L，终浓度5g/L。培养结束后，每孔加入100 u 1DMS0,振荡lOmin。待MTT还原 产物完全溶解，在酶标仪上选择以492nm为检测波长，630nm为参考波长测定光密度值(0D 值)。计算细胞的存活率，并以不同时间点和细胞的存活率作图，实验重复三次。细胞存活率=[试验组0D平均值]/ [空白对照组0D平均值]X 100 %4.测定生长曲线时间点设定ld，2d，3d，4d，5d细胞给药培养取24孔细胞培养板，每孔接种细胞悬液1000 y L、浓度随测定时间的增加而降低， 于371，5%0)2培养箱中培养。4小时后取出细胞培养板。每孔加入两倍IC5(1值浓度的药 物(L02除外，加入10ug/ml的药物)1000 u L ；空白对照组加培养液1000 u L。每组浓度设 3个复孔。置37°C，5% C02及饱和湿度的培养箱培养。细胞活性测定实验终止前4小时取出细胞培养板，先以倒置显微镜下观察，后在每孔中加入MTT 工作液200 u L，终浓度5g/L。培养结束后，每孔加入1000 u 1DMS0,振荡lOmin。待MTT还 原产物完全溶解，转移至96孔板，在酶标仪上选择以492nm为检测波长，630nm为参考波长 测定光密度值(0D值)。计算细胞的存活率，并以时间点和细胞的存活率作图，实验重复三 次。细胞存活率=[试验组0D平均值]/[空白对照组0D平均值]X 100%5.通过苏木素伊红(HE)染色观察A375，L02, MKN45细胞形态细胞给药培养取6孔细胞培养板，每孔接种细胞悬液1500 y L、浓度随测定时间的增加而降低， 于371，5%0)2培养箱中培养。4小时后取出细胞培养板。每孔加入两倍IC5(1值浓度的药 物(L02除外，加入10ug/ml浓度的药物)1500 u L ；空白对照组加培养液1500 u L。每组浓 度设3个复孔。置37°C，5% C02及饱和湿度的培养箱培养36小时。固定液(4%多聚甲醛)的配置称取40g多聚甲醛，置烧杯中，加入800ml 0. lmol/L磷酸缓冲液(PBS)，加热至 60°C左右，磁力搅拌使粉末完全溶解，滴加少许lmol/L NaOH才能使溶液清亮，最后补足 0. lmol/L的PBS于1000ml，充分混勻，备用。样品处理用4%多聚甲醛固定15min，接着用蒸馏水洗涤2min，再换用新鲜的蒸馏水，再洗 涤 2min。HE 染色对于上述处理好的样品，苏木素染色液8min，接着用自来水中冲洗去多余的染色 液lOmin，蒸馏水再洗涤5s，95%乙醇5秒，伊红染色液A染色5min，接着伊红染色液B再染 色5min。显微镜下观察结果。三.实验结果(参见图1至图9)1.雄黄母液的浓度测定结果砷浓度177. 0ug/ml (以后IC5(1等所涉及的浓度未提及即为砷浓度)
6
2.测定雄黄药品的半数抑制浓度(IC5(I)值L02, > 10ug/ml (约 50ug/ml 左右)；H印G2，6. 89ug/ml ；MKN45，9.37ug/ml ；8898，9. 06ug/ml ；A375,3.78ug/ml3.时效曲线测定结果结论对于五株给药细胞，药物对细胞的抑制作用都呈时间依赖型，其中36h时药 物对细胞的抑制作用较显著。4.生长曲线的测定结论对于五株给药细胞，药物对细胞的抑制作用基本呈时间依赖型。对于L02，药物对细胞抑制作用的第四天产生反射性下调。对于H印G2，药物对细胞的抑制作用在3-5天无明显差异。对于MKN45，药物对细胞的抑制作用在3-5天无明显差异。对于8898，药物对细胞的抑制作用在3-4天无明显差异。对于A375，药物对细胞的抑制作用呈显著的时间依赖型。5.苏木素伊红(HE)染色结果5. 1A375 组A375正常组染色结果细胞核与细胞质界限分明，较正常；A375给药组染色结果细 胞皱缩，细胞核与细胞质界限不明显，并且周围伴有较多微粒，但是胞膜尚完整。5. 2L02 组L02正常组与给药组染色结果细胞核与细胞质界限分明，较正常，显示药物对于 L02细胞损伤较不明显。5. 3MKN45 组MKN45正常组染色结果细胞核与细胞质界限分明，较正常；MKN45给药组染色结果 细胞核与细胞质界限不明显，细胞皱缩但是胞膜较完整。四.统计学方法数据以平均值士标准偏差表示。采用数理统计学软件GraphPad Instatversion 2. 04 进行统计学分析，*p < 0. 05，**p < 0. 01，***p < 0. 001。实施例2雄黄致肿瘤细胞凋亡的作用实验(二)实验方法1.流式细胞术2.测定细胞上清中LDH，AKP的含量3.测定细胞中总LDH，AKP的含量4.细胞凋亡DNA ladder检测受试药物雄黄受试细胞A375，MKN45,L02一、实验材料1主要仪器Bio-Rad公司酶标仪(550型)；Heraeous公司二氧化碳培养箱；倒置光学显微镜； 无菌操作台；96、24、6孔细胞培养板；半自动生化分析仪
2主要试剂RPMI-1640培养基；碘化丙锭(propidium iodide, PI)；乳酸脱氢酶试剂盒(北 京北化康泰临床试剂有限公司)；GENMED乳酸脱氢酶(LDH)总活性比色法定量检测试剂盒 (上海杰美基因医药科技有限公司)；碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒(南京建成生物工程研 究所第一分所)；凯基细胞凋亡DNA Ladder检测试剂盒(凯基生物科技有限公司)。二、实验方法1.流式细胞术检测细胞周期和凋亡1. 1 1X106个细胞用雄黄处理36h。1. 2消化、收集细胞(lOOOrpm，5min)，用PBS缓冲液洗细胞2次，离心收集 (lOOOrpm,5min)。1. 3加入预冷的70%乙醇lml，4°C固定细胞4 8h。1. 4离心(1500rpm，5min)，去固定液，用PBS缓冲液洗细胞1次，离心收集 (1500rpm,5min)。1. 5 加入 RNase 终浓度 10 ii g/ml，37°C，反应 30min。1.6用终浓度为50iig/ml的碘化丙锭(propidium iodide, PI)染色，4°C避光 lOrnin。1. 7使用FACSCalibur流式细胞仪检测，CELLQUEST软件分析数据并作图，亚二倍 体峰被定量，作为测定凋亡的标准。2.测定细胞上清中LDH，AKP的含量2. 1测定细胞上清中LDH的含量2. 1. 1将上述三株细胞培养于010cm平皿中，用雄黄处理36小时后，取上清。2. 1. 2将R I用10mLR II溶解，配成工作液，稳定10分钟后使用。2. 1. 3测定条件波长340nm，光径1. 0cm，反应温度37°C。2. 1. 4取2. 5mL工作液于干净比色杯中，保温37°C以空气调仪器吸光度为零。2. 1. 5加0. 10mL样本于此比色杯中，混勻，保温30秒，开始读数每30秒读一次数， 直至2分钟，计算每分钟吸光度变化值AA。2. 1.6 计算消光系数NADH在340nm的毫摩尔消光系数为6. 3。2. 2测定细胞上清中AKP的含量2. 2.1操作步骤 充分混勻，37 °C水浴15分钟 立即混勻，520nm，0. 5cm或1cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度。2. 2. 2计算公式
碱性磷酸酶(金氏单位/100ml)= 3.测定细胞中总LDH，AKP的含量3. 1将上述三株细胞培养于010cm平皿中，用雄黄处理36小时后，用1 %的 TrizonX-100 裂解细胞，4°C 30min。3. 2细胞中总LDH的含量3. 2. 1在96孔酶标板上做好相应标记背景对照和样品。3. 2. 2分别移取195 u LGENMED缓冲液(Reagent A)到相应孔中。3. 2. 3分别加入5uL GENMED阴性液(Reagent D)或待测样品。3. 2. 4 分别加入 25 u L GENMED 反应液(Reagent B)。3. 2. 5轻轻摇动96孔酶标板。3. 2. 6 在 25°C温度下孵育 5min。3. 2. 7 分别加入 25 u L GENMED 底色液(Reagent C)。3. 2. 8轻轻摇动酶标板。3. 2. 9即刻放入酶标仪检测，包括(Omin初始读数和lmin读数)。3. 2. 10活性计算[(样品读数-背景读数)X样品稀释倍数X0.25] +
3. 3细胞中总AKP的含量3. 3.1操作步骤 充分混勻，37 °C水浴15分钟 立即混勻，520nm，0. 5cm或1cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度。3. 3. 2计算公式 4细胞凋亡DNA ladder检测(凯基细胞凋亡DNA Ladder检测试剂盒)4. 1离心收集细胞(1500Xg，5min)于1. 5ml微量离心管中。4. 2 用 PBS 洗涤细胞二次(1500Xg，5min)，弃上清。4. 3沉淀的细胞中加入100 u LLysis Buffer,涡旋振荡器上剧烈混合10秒，离心 (1000Xg,5min)移上清于另一个微量离心管中。4. 4沉淀再加入100 ii L Lysis Buffer重复上步，合并两次的上清液。4. 5在上述合并的上清液中加入20ii LSolutionA再加入20ii LEnzyme A55°C反应 1小时。4. 6 加入 20u LEnzymeB37°C 1 小时。4. 7加入130 u LPrecipitant和950 u L冷乙醇混勻置_20°C 1小时以上或过夜。4. 8 4°C 12000-14000rpm 离心 15min_30min 小心弃去上清，收集沉淀的 DNA。4. 9 加入 0. 5 ii L70%7令乙醇，洗 DNA 沉淀，再 12000_14000rpm 离心 20min4. 10弃上清，DNA沉淀于室温干燥lOmin后，加入10_15iiL TE Buffer，充分搅拌 溶解DNA。4. 11取上述10-15 u L样品加入2-3 u L Loading Buffer,琼脂糖凝胶电泳(凝胶 和电泳缓冲液TBE均加入0. 5mL的溴化乙啶)。4. 12电泳1小时，紫外灯下观察并拍照。三、实验结果1.流式细胞术检测细胞周期和凋亡结果(参见图10，图11)雄黄对于正常细胞没有明显的诱导凋亡的作用，而对于MKN-45和A375有不同程 度的诱导凋亡的作用。2.细胞上清中LDH，AKP的含量的测定结果(参见图12，图13)3.细胞中总LDH，AKP的含量测定结果(参见图14，图15)4.细胞凋亡DNA ladder检测(参见图16，图17)。实施例3
测定雄黄致细胞中ROS，GSH水平的变化情况受试药物雄黄受试细胞A375，HepG2,MKN45, L02实验材料荧光酶标仪；Thermos公司二氧化碳培养箱；倒置光学显微镜；无菌操作台；96、24、6孔细胞培养板；半自动生化分析仪CDCFH 探针(Sigma 公司)谷胱甘肽试剂盒(南京建成)实验方法1谷胱甘肽的测定1. 1上清液制备取待测样本0. 5ml，加试剂一应用液2ml混勻，3500 4000转/ 分离心10分钟，取上清液1ml进行显色反应。1.2显色反应 混勻，静置5分钟，420nm处，1cm光径，蒸馏水调零比色测定各管0D值。2细胞内氧化活性水平原位的测定2. 1细胞用不同浓度的雄黄处理24小时；2. 2用PBS轻轻淋洗两次；2. 3 加入含 10 ii M CDCFH,培养 3 小时；2.4轻轻吸弃上清，加入卩85;2. 5用荧光酶标仪(ex :480nm, em :538nm)测定荧光强度，荧光强度直接反映了细 胞内的氧自由基水平。实验结果
谷胱甘肽(GSH)的测定结果和四株细胞的R0S(参见图18，图19)。实施例4平行实验1材料与方法1. 1 动物C57BL/6小鼠，18只，雄性，SPF级，4 6周龄，体重16 18g，购自中国科学院上 海实验动物中心。1. 2主要试剂和主要仪器设备生理盐水，蒸馏水，雄黄，酒精，天平、眼科剪、眼科弯镊、lml无菌注射器并带6号 针头若干支1. 3实验方法和结果方法由B16细胞接种产生的移植性黑色素瘤C57BL/6小鼠18只，随机分3组，每组 6只，每鼠分别以0. lmL的纯酒精(纯酒组)，雄黄(雄黄组，雄黄lmg，用蒸馏水进行20倍 左右的稀释)，以及酒精与雄黄混悬液(雄酒组，雄黄lmg)，局部瘤内注射，每周注射2次。 每10d观察各组肿瘤大小，并于30d杀鼠剥离肿瘤称重。结果雄黄组6鼠中有1鼠，于第3 次注射后20h死亡。雄酒组中有3鼠，于第2次注射后死亡。接种30d后，纯酒组、雄黄组、 雄酒组的瘤重分别为(2. 08士 1.63)、(0.13士0. 10)、(2. 49士 1. 32) g，雄黄组与其它各组间 均有显著差别(P < 0. 05)。结论很低剂量(lmg)雄黄溶液瘤内注射治疗移植性黑色素瘤小 鼠，可明显抑制肿瘤生长，有临床应用的潜力。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
权利要求
雄黄在制备治疗皮肤肿瘤疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，雄黄在制备治疗黑色素瘤疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及雄黄在制备治疗皮肤肿瘤疾病药物中的应用，所述的皮肤肿瘤疾病是黑色素瘤疾病。本发明对雄黄发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。本发明的雄黄药理作用强，预示着很好的药用前景。雄黄对于细胞的周期没有明显的影响，而是从细胞凋亡的方面，通过诱导细胞凋亡而达到损伤黑色素瘤细胞的作用，从而治疗黑色素瘤皮肤疾病。
文档编号A61K33/36GK101884647SQ20091005137
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月15日 优先权日2009年5月15日
发明者刘建文, 吴国华, 章莉, 陈思宇, 陈明苍, 马勇 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院