一种重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球及其制备方法

专利名称：：一种重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及药物以及包裹生物活性因子微球
技术领域：
，更具体地涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球及其制备方法和用途。
背景技术：
：重组骨形态发生蛋白-2是采用基因工程重组技术开发的一种骨分化调节生长因子，具有诱导未分化的间充质细胞向软骨细胞和成骨细胞定向分化的能力，促进成骨细胞分化成熟，参与骨和软骨的生长发育及其重建过程，进而加速骨缺损的修复。但重组骨形态发生蛋白-2在体内半衰期短，局部使用会被组织液稀释或蛋白酶所分解，能保持有效浓度的时间有限，不能有效发挥其骨诱导作用。所以重组骨形态发生蛋白-2的活性发挥必须需要有合适的载体，以便长时间缓慢地释放重组骨形态发生蛋白-2，实现在一定时间内保持局部较高的浓度，利于其有效发挥诱导成骨作用。微球作为一种控/缓释给药体系，具有保护药物免遭破坏、延长药物作用时间、降低用药量等优点，在药物释放领域受到很大关注。目前已有一些相关制备重组骨形态发生蛋白-2微球的报道，然而它们都或多或少存在一些明显的缺陷，例如制备步骤复杂，控释效果难以令人满意，以及杂质和反应物(如残留的单体、低聚物、催化剂、添加剂及降解产物)对产品性能有可能产生不良的影响。AntoniosGMikos等(P.QuintenRuhe，ElizabethL.Hedberg，NestorTorioPadron,PaulH.M.Spauwen，JohnA.J"ansen，AntoniosG.Mikos.rhBMP-2releasefrominjectablepoly饥-lactic-co-glycolicacid)/calcium-phosphatecementcomposites.JBoneJointSurgAm2003;85-ASu卯l3:75-81.)采用复乳法制备载重组骨形态发生蛋白-2的DL-乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)微粒。在该方法中，重组骨形态发生蛋白-2溶于磷酸缓冲盐溶液/牛血清白蛋白溶液中，然后注入PLGA的二氯甲烷溶液中形成初乳，漩涡震荡60秒后加入聚乙烯醇溶液形成复乳。漩涡震荡60秒后加入PVA和异丙醇4溶液，快速搅拌1小时后加入二氯甲烷促使微粒析出，经离心冻干后得微球。平均粒径为17.2±1.3um，包封率为79%±8%，28天累积释放率为18%±1.9%。胡蕴玉等人采用复乳-溶剂蒸发技术制备载重组骨形态发生蛋白-2的聚乳酸与聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球。制备的载药微球粒径在100~350nm，24小时体外释放为15.2%±0.8%，随后呈持续缓慢释放，28天时累积释放率达48.6%±5.3%。金岩等(ChenFaming,ZhaoYimin，ZhangRong，JinTao,SunHaihua，WuZhifen，JinY肌Periodontalregenerationusingnovelglycidylmethacrylateddextran(Dex-GMA)/gelatinscaffoldscontainingmicrospheresloadedwithbonemorphogeneticproteins.JournalofControlledRelease.2007,121:81-90)公开了一种制备载重组骨形态发生蛋白-2葡聚糖-縮水甘油基丙烯酸酯(Dex-GMA)/聚乙二醇(PEG)微球的方法。首先制备Dex-GMA:葡聚糖在氮气保护下于6CTC溶于DMAP/DMS0，完全溶解后冷却到3(TC加入三乙胺催化剂，搅拌15分钟后缓慢加入GMA，在氮气保护下于3(TC反应72小时，采用冷的异丙醇将产物析出，过滤，异丙醇清洗数次，室温真空干燥得到Dex-GMA。然后制备Dex-GMA/PEG微球将PEG溶液和Dex-GMA的氯化钾在氮气保护下晃动10分钟后转移到闪烁瓶中，涡流震荡60秒得到水-水乳液，室温下静置10-15分钟后加入TEMED和KPS，在37。C孵育30分钟，甲丙烯酰基连接到Dex-GMA链上。Dex-GMA/PEG微球采用复乳縮聚制得，离心清洗三次，冻干后得微球。然而，这种方法制备的微球易粘连，平均粒径为31.1±12.7um。重组骨形态发生蛋白-2可通过两种方式载入，其一在加入PEG前将重组骨形态发生蛋白-2分散到Dex-GMA溶液中，包封率为87.8%±1.2%，另一是在涡流震荡前将重组骨形态发生蛋白-2加入到PEG/Dex-GMA中，包封率为86.6%±0，8%。然而，该方法制备的微球的暴释现象明显，近50%，此后第l-3天每天释放5%,第6-21天每天释放0.2%，28天累积释放率接近65%。冯庆玲等(NiuXufeng，FengQingling，WangMingbo,GuoXiaodong,ZhengQixin.PreparationandcharacterizationofchitosanmicrospheresforcontrolledreleaseofsyntheticoligopeptidederivedfromBMP-2.JournalofMicroencapsulation.D01:10.1080/02652040802319742)采用乳化-离子交联法制备载重组骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。将蛋白与壳聚糖的混合溶液滴入含表面活性剂司盘-80的液体石蜡中，室温下机械搅拌2小时后滴入三聚磷酸钠溶液继续反应2小时形成微球，采用大量石油醚、异丙醇清洗，冻干后备用。微球粒径10-60um，平均粒径为39nm，分布较宽，微球表面规整无裂纹，易粘连，交联反应持续2小时以上可保持微球的球形度，包封率在75%-90%。然而，该方法制备的微球易粘连，且释放到第7天时累积释放率就已达62.3%，故释放周期较短，难以达到4周释放周期。另外，乳化法虽然是一种较为成熟的高分子微球制备方法，通常与交联、溶剂蒸发联合使用，但在用于蛋白包裹的过程中，大量表面活性剂、乳化剂、化学交联剂的使用，有机溶剂的残留和"脱油"过程均会影响微球的生物相容性和蛋白的活性。此外，该工艺相对繁琐，乳剂稳定性不易控制，微球粒径不均匀，分布较宽等。综上所述，在目前现有的这些技术中，大多制备工艺复杂，并且制得的骨形态发生蛋白-2微球性能难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发工艺简便、且制备的骨形态发生蛋白-2微球性能优异的方法。
发明内容本发明的目的是提供一种重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。在本发明的第一方面，提供了一种人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，微球基质成分为壳聚糖，包裹的药物为人骨形态发生蛋白-2，壳聚糖通过与离子交联剂发生反应将人骨形态发生蛋白-2包裹其中，并且所述微球的平均粒径在501000陶，包封率在75%100%，蛋白活性90%100%保持，缓释周期达4周以上，28天累积释放为35%90%。在另一优选例中，所述微球的平均粒径为100-700微米。在另一优选例中，90。/。以上的所述微球的粒径在0.9M1.1M范围内，其中M是所述微粒的平均粒径。更佳地，95%的所述微球的粒径为0.9M1.1M范围内，其中M是所述微粒的平均粒径。在另一优选例中，所述微球中选自下组的物质的各自含量《0.05wt。/。表面活性剂、油相、和石油醚。在另一优选例中，微球中表面活性剂、油相、和石油醚的各自含量《0.005wt%，《0.001wt。/。或更低。通常，所述油相包括液体石蜡，所述的表面活性剂包括司班、吐温。在另一优选例中，所述壳聚糖的分子量为3100KDa，更佳地为550KDa。在另一优选例中，所述的壳聚糖是脱乙酰化的壳聚糖，其脱乙酰度为50%95%。在另一优选例中，所述微球保持了95%100%的蛋白活性。在另一优选例中，人骨形态发生蛋白-2与壳聚糖按重量比为1100:300，更佳地为350:300。在另一优选例中，所述的微球是采用静电液滴-离子交联法制备的。在本发明的第二方面，提供了一种活性蛋白的壳聚糖微球，微球基质成分为壳聚糖，包裹的药物为活性蛋白，壳聚糖通过与离子交联剂发生反应将活性蛋白包裹其中，微球的平均粒径在5Q1000陶，包封率在75%100%，蛋白活性90%100%保持，缓释周期达4周以上，28天累积释放为35%90%。在另一优选例中，所述壳聚糖微球的优选特征同本发明第一方面的优选特征。在本发明的第三方面，提供了一种制备活性蛋白的壳聚糖微球的方法，包括步骤(a)提供一含壳聚糖和所述活性蛋白的混合水溶液或水性溶液；其中，在所述混合溶液中，壳聚糖的浓度按重量体积比为0.2-6%;并且所述活性蛋白与壳聚糖的重量比1100:300;和(b)在静电场下，将所述的混合溶液滴入凝胶浴中，从而形成活性蛋白的壳聚糖微球，其中所述的凝胶浴是含离子交联剂的水溶液或水性溶液，其PH为27。在另一优选例中，所述的离子交眹剂选自下组三聚磷酸钠、聚磷酸、或其组合。在另一优选例中，所述的凝胶浴的溶剂为水性溶剂，并且所述的水性溶剂是水与醇(如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其组合)构成的混合溶剂。在另一优选例中，按混合溶剂的总体积计算，醇的用量为5-50%。在另一优选例中，步骤(a)的混合溶液中含有0.01-1.5M酸，并且在所述浓度的酸存在下对活性蛋白的活性无不利影响。在另一优选例中，所述的酸为有机酸，更佳地所述的有机酸选自甲酸、乙酸、拧檬酸、乳酸或其组合。在另一优选例中，步骤(a)还包括将壳聚糖溶于稀酸溶液中，并将人骨形态发生蛋白-2溶于其中，从而形成混合溶液。更佳地，配制壳聚糖酸溶液所用的酸为甲酸、乙酸、柠檬酸、乳酸或其组合。在另一优选例中，所述的静电场是输出电压直流100-iooov(较佳地100-500V)的静电场。在另一优选例中，壳聚糖的分子量在550KDa，脱乙酰度在50%95%。在另一优选例中，配制壳聚糖酸溶液所用的酸浓度按重量比约为0.1%8%，更佳地约为0.2%5%。对于甲酸、乙酸等液态酸，也可使用体积比。通常，配制壳聚糖酸溶液所用的液态酸(如甲酸、或乙酸)浓度按体积比约为0.2%5%。在另一优选例中，在所述混合溶液中，壳聚糖的浓度按重量体积比为0.5%-50/0。在另一优选例中，在步骤(a)的所述混合溶液中，骨形态发生蛋白-2与壳聚糖按重量比为190:300。在另一优选例中，凝胶浴含有三聚磷酸钠或聚磷酸或其组合作为离子交联剂，并且溶剂是水与醇(如乙醇或丙醇)的混合溶剂。更佳地，三聚磷酸钠或聚磷酸的浓度按重量体积比为0.5-10%;乙醇或丙醇的浓度按体积比为5-50%。在另一优选例中，凝胶浴的pH为26.5。在另一优选例中，所述的活性蛋白是骨形态发生蛋白-2。在另一优选例中，所述的活性蛋白是重组的人骨形态发生蛋白-2。在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它含有药学上可接受的载体以及本发明第一方面中所述的人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球或第二方面中所述的活性蛋白的壳聚糖微球。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就壳聚糖的分子量而言，范围3100KDa的上限100KDa可以与另一优选范围550KDa的下限5KDa进行组合，从而构成范围5-100KDa。限于篇幅，在此不再--累述。图1显示了在本发明一个实例中，重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球制备过程示意图。图2显示了本发明的微球整体形态。图3显示了本发明的微球表面形态。图4显示了本发明重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球异位成骨活性。具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现将壳聚糖和骨形态发生蛋白-2的混合溶液，在高压静电条件下，滴加于三聚磷酸钠或聚磷酸的水溶液中，可以制得外观圆整，均匀度好，颗粒规则无粘连的微球。冻干后的微球不粘连，再分散性好，且控释性能优异，包封率为75%100%，蛋白活性90%100%保持，缓释周期达4周以上，28天累积释放35%90%。在此基础上，本发明人完成了本发明。本发明的微球制备方法工艺简单，生产成本低，易于实施，反应条件温和，无须添加乳化剂、化学交联剂，利于重组人骨形态发生蛋白-2的活性保持，通过调整壳聚糖分子量、壳聚糖脱乙酰度、壳聚糖浓度、重组人骨形态发生蛋白-2与壳聚糖重量比、凝胶浴浓度等工艺参数可调控微球粒径和包封率。活性成分如本文所用，术语"活性成分"狭义上指骨形态发生蛋白-2或其活性衍生物或活性片段。广义上，术语"活性成分"指各种蛋白或多肽类的活性蛋白，例如BMP-2，免疫球蛋白等。适用于本发明的骨形态发生蛋白-2没有特别限制，可以是人的骨形态发生蛋白-2或其他哺乳动物的骨形态发生蛋白-2。骨形态发生蛋白-2可以是天然的，也可以是重组的。当然，优选的骨形态发生蛋白-2是人的骨形态发生蛋白-2，尤其是重组的人骨形态发生蛋白-2。壳聚糖壳聚糖是由甲壳类动物提取的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖组成的多聚糖。壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，作为唯一的碱性氨基多糖，具有来源广泛，成本低廉等优点。此外，壳聚糖具有良好的生物黏附性、生物相容性、安全性，且降解产物无毒、无免疫原性、无致癌性并具有促进药物吸收的作用。另外，壳聚糖是一种线性长链高聚物分子，含有大量可以与其他细胞分子形成氢键的-0H和-则2基团，当环境pH小于其离子解离常数(6.5)时，-NH2质子化形成-NH/使分子带正电。上述分子特性使壳聚糖成为优良的生物粘附材料，可以有效携带骨形态发生蛋白-2等活性成分。在本发明中，所使用的壳聚糖没有特别限制，通常，壳聚糖分子量为3100KDa，较佳地550KDa。脱乙酰度通常为40-99%，较佳地为50%95%。可否在将壳聚糖与其他物质(尤其是一些可生物降解的材料)混合，构成包封材料。骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球复合物本发明提供了一种人骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球，其中微球基质为壳聚糖，包裹的药物为重组人骨形态发生蛋白-2。如本文所用，术语"本发明微球"和"本发明的骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球"可互换使用，都指由骨形态发生蛋白-2和壳聚糖为原料，通过静电液滴-离子交联法所制备的微球。在本发明的微球中，壳聚糖直链上的NH3+通过与离子交联剂上P30,。5一发生分子间离子交联反应形成紧密地"梯"状结构将重组人骨形态发生蛋白-2包裹其中。本发明微球外观圆整，均匀度好，颗粒规则无粘连，平均粒径为50900Wn，包封率为75%100%，蛋白活性95%100%保持。冻干后的微球不粘连(图2)'，再分散性良好，表面多皱褶(图3)，缓释周期达4周以上，28天累积释放35%90%。药物组合物本发明还包括含有骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球的药物组合物。所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明上述的骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球。本发明还包括含有活性蛋白的壳聚糖微球的药物组合物。所述的药物组合物含有药学上可接受的载体以及本发明上述的活性蛋白的壳聚糖微球。本发明的微球可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，例如与其他促进骨生成的化合物一起联用。当本发明的微球用于治疗时，它可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，从而形成药物组合物。通常，本发明的药物组合物包括以下剂型如下口服给药片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(混悬剂)(含有如约0.05-5%悬浮剂(助溶剂))、糖浆(含有如约10_50%糖)、和酏剂(含有约20-50%乙醇)，或者以无菌可注射溶液或混悬剂形式(在等渗介质中含有约0.05-5%助溶剂)进行非肠胃给药。这些药物制剂通常可含有与载体混合的约0.5-99.5wt%，较佳地2.5-90wt%，更佳地5y。-60wty。(重量)的活性成分(本发明的微球)，按组合物的总重量计。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、口服或局部给药。一种优选的给药方式是将本发明微球与修补骨损伤的材料混合，制成与骨缺损处相吻合的形状，从而用于促进在骨损伤处新骨的形成。所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。通常，当本发明微球每天以约0.05-100mg/kg动物体重(较佳地0.1-50mg/kg体重，更佳地O.5-20mg/kg体重给药)的剂量给予时，能得到令人满意的效果。制备方法
技术领域：
：本发明还提供了一种制备本发明微球的方法。简而言之，本发明方法可以称为静电液滴-离子交联法。参见图1，制备本发明微球的静电液滴-离子交联法的基本制备过程如下首先，提供含壳聚糖和骨形态发生蛋白-2的混合溶液。在所述混合溶液中，壳聚糖的浓度按重量体积比为0.2-6%，较佳地为0.5%-5%。在所述混合溶液中，骨形态发生蛋白-2与壳聚糖的重量比通常为l100:300，较佳地为190:300，更佳地为350:300。所述混合溶液的溶剂为水或水性溶剂。如本文所用，"水性溶剂"指由水和其他溶剂(如醇溶剂)构成的混合溶剂，其中在混合溶剂中水占50wt。/。以上。一类优选的水性溶剂是水与醇(如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其组合)构成的混合溶剂。然后，在高压静电作用下，将混合溶液滴入凝胶浴中，从而形成人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。在本发明中，高压静电场通常为输出电压直流100-1000V的静电场，较佳地为输出电压直流100-500V的静电场。可采用市售的设备来产生所需的高压静电场。将混合溶液滴入凝胶浴的速度没有特别限制，通常可以是l-500ml/h，较佳地为5-200ml/h。在本发明中，凝胶浴是含离子交联剂的水溶液或水性溶液，其pH为27(较佳地pH3-6.5，更佳地pH4-6)。离子交联剂宜为三聚磯酸钠、聚磷酸、或其组合。溶剂为水或水性溶剂。在本发明中，优选的水性溶剂是水与醇(如乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其组合)构成的混合溶剂。其中，按混合溶剂的总体积计算，醇的用量为5-50%。本发明的结果表明，在凝胶浴中添加醇有利于微球分散，不产生粘连。本发明的凝胶浴无毒性，可溶于水，易清洗，不易残留。在本发明的一个实例中，首先将壳聚糖溶于稀酸溶液中，所用的壳聚糖分子量在550KDa，脱乙酰度在50%95%，所用的酸为甲酸、乙酸、柠檬酸、或乳酸，壳聚糖的溶液按重量体积比为0.5%-5%，然后将重组人骨形态发生蛋白-2按其与壳聚糖重量比为1100:300溶于壳聚糖溶液中，在高压静电作用(输出电压直流100-400V)下，将混合液滴入凝胶浴中，通过离子交联制备出重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，然后用去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。本发明的主要优点包括(1)微球粒径分布均匀，可在50900Wn之间调控，分散性和球形度良好；(2)凝胶浴pH为27，壳聚糖直接与其接触，直链上的NH/通过与离子交联剂上PA。5—发生分子间离子交联反应形成"梯"状结构将重组人骨形态发生蛋白-2紧密包裹其中，交联反应迅速，包封率可达75%100%;(3)反应条件温和，无剪切震荡，无须添加乳化剂、化学交联剂，利于保持重组人骨形态发生蛋白-2的活性，蛋白活性95%100%保持；(4)冻干后微球表面多皱褶，增大比表面积，利于被紧密包裹在微球内部的重组人骨形态发生蛋白-2的释放，28天累积释放35%90%，缓释周期可达4周以上；(5)制备工艺简单，生产成本低，易于实施，可以通过调整壳聚糖分子量、壳聚糖脱乙酰度、壳聚糖浓度、重组人骨形态发生蛋白-2与壳聚糖重量比、凝胶浴浓度等工艺参数达到对微球粒径、包封率的可控。(6)与现有技术中表面活性剂、油相、和石油醚等物质残留量高相比，本发明制备工艺中所用的原料如乙酸、三聚磷酸钠、乙醇等，均溶于水，在后处理清洗过程中可去除，基本不残留。解决了传统乳化法制备载重组人骨形态发生蛋白-2微球不均匀、分散性差，引入表面活性剂、乳化剂、有机溶剂或化学交联剂影响微球的生物相容性和蛋白的活性等问题。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比按重量计。通用方法(1)平均粒径显微镜下随机挑取2-3组微球，每组不少于20个微球，读取微球的粒径，计算平均值。(2)包封率采用Bradford蛋白检测法，按以下公式计算包封率=(原料液中蛋白质含量-凝胶浴中蛋白质含量)/原料中蛋白质含量X100(3)累积释放率累积释放率=蛋白累积释放量/微球中蛋白含量X100%(4)蛋白活性率将包裹在壳聚糖微球中的重组人骨形态发生蛋白-2破囊后提取出。按提取出的人骨形态发生蛋白-2蛋白，取等量重组人骨形态发生蛋白-2为对照，采用常规小鼠异位成骨技术及甲基麝香草酚蓝比色法检测活性，按下式计算蛋白活性保持率。蛋白活性率=提取蛋白的活性/对照蛋白的活性X100%实施例1:将分子量为5KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖溶于2%乙酸的水溶液中，配制成重量体积比为1%的溶液，按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为3:100将重组人骨形态发生蛋白-2溶于其中，混合液在高压静电作用(输出电压直流350V)下滴入pH为4的凝胶浴中，制备成重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。所述凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为2%，乙醇的浓度为10%,且溶剂为水。去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。微球外观圆整，均匀度好，颗粒规则无粘连。冻干后的微球不粘连，再分散性良好，表面多鮍褶(图2和图3)。经测试，平均粒径为100Wii，包封率为95%,蛋白活性100%保持，缓释周期达4周以上，28天时累积释放85.5%±5.8%。将昆明种小白鼠按体重的3%进行水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于手术板上，取右侧的大腿剃毛消毒，切开约1cm的皮肤切口，钝性分离大腿肌袋，用手术钳扩充出肌袋，植入含如上制备的含100微克rhBMP-2的壳聚糖微球的样品后，缝合肌膜和皮肤。手术后放入饲养盒中，进行正常的洁净级标准饲料喂养。4周致死动物，迅速取出植入材料及其周围软组织。异位成骨活性试验测试表明，4周后在肌袋内形成新鲜骨的平均鲜重为180毫克。证实所制备的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有好的诱导成骨活性(图4)。实施例2:将分子量为5KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖溶于5%乙酸水溶液中，配制成重量体积比为5%的溶液，按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为1:10将重组人骨形态发生蛋白-2溶于其中，混合液在高压静电作用(输出电压直流150V)下滴入pH为4的凝胶浴中制备成重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为2%，乙醇的浓度为30%，且溶剂为水。去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。经测试，微球平均粒径为760Wn，包封率为80%，蛋白活性95%保持，缓释周期达4周以上，28天时累积释放52.9%±3.8°/0。样品经小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均鲜重为140毫克。证实所制备的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有好的诱导成骨活性。实施例3:将分子量为50KDa、脱乙酰度为50%的壳聚糖溶于0.2%乙酸的水溶液中，配制成重量体积比为0.2%的溶液，按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为5:100将重组人骨形态发生蛋白-2溶于其中，混合液在高压静电作用(输出电压直流300V)下滴入pH为5的凝胶浴中制备成重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为2%，乙醇的浓度为30%，且溶剂为水。去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。经测试，微球平均粒径为250陶，包封率为90%，蛋白活性98%保持，缓释周期达4周以上，28天时累积释放37.6%±5.7%。样品经小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rh丽P-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均鲜重为110毫克。证实所制备的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有好的诱导成骨活性。实施例4:将分子量为30KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖溶于2%乙酸的水溶液中，配制成重量体积比为2%的溶液，按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为1:100将重组人骨形态发生蛋白-2溶于其中，混合液在高压静电作用(输出电压直流220V)下滴入pH为4的凝胶浴中制备成重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为3%，乙醇的浓度为30%，且溶剂为水。去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。经测试，微球平均粒径为450um，包封率为100%，蛋白活性100%保持，缓释周期达4周以上，28天时累积释放48.6%±4.3%。样品经小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均鲜重为130毫克。证实所制备的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有好的诱导成骨活性。实施例5:将分子量为30KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖溶于2%乙酸溶液中，配制成重量体积比为2%的溶液，按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为30:100将重组人骨形态发生蛋白-2溶于其中，混合液在高压静电作用(输出电压直流250V)下滴入pH为6.5的凝胶浴中制备成重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为3%，乙醇的浓度为30%。去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。经测试，微球平均粒径为520ym，包封率为75%,蛋白活性95%保持，缓释周期达4周以上，28天时累积释放70.3%±8.3%。样品经小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rh函P-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均鲜重为160毫克。证实所制备的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有好的诱导成骨活性。实施例6-18重复实施例1的制备过程，不同点仅在于分别用以下条件替换实施例1中的相应条件。在实施例6中，在凝胶浴中，用10%异丙醇替换10%乙醇。在实施例7中，在凝胶浴中，用10%异丙醇+10%乙醇替换10%乙醇。在实施例8中，用2%的柠檬酸溶液替换2%乙酸溶液。在实施例9中，用1%的甲酸溶液替换2%乙酸溶液。在实施例10中，用分子量为15KDa、脱乙酰度为70%的壳聚糖替换分子量为5KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖。在实施例ll中，人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为1:300。在实施例12中，人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为80:300。在实施例13中，高压静电条件为输出电压直流480V。在实施例14中，高压静电条件为输出电压直流200V。在实施例15中，凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为6%。在实施例16中，凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为10%。含有1%聚磷酸。在实施例18中，凝胶浴中三聚磷酸钠的浓度为2%并且含有3%聚磷酸。结果同样制备了骨形态发生蛋白-2的壳聚糖微球。经测试，这些微球平均粒径为70-800微米。包封率为75-95%，蛋白活性保持率约95%，缓释周期达4周以上。另外，实施例1-18的结果提示，骨形态发生蛋白-2和壳聚糖的混合溶液中壳聚糖的浓度越大，则微球的平均粒径越大。高压静电的电压值越高，平均粒径约小。骨形态发生蛋白-2和壳聚糖的混合溶液中壳聚糖重量比例越大，凝胶浴中离子交联剂浓度越大，凝胶浴pH越小，包封率越高。另外，本发明微球大小非常均一，其粒径发布窄，几乎90%以上(如100%)的微球粒径在0.9M1.1M范围内，其中M是微粒的平均粒径(如下表所示)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例19实施例19与实施例4基本相同，不同点在于使用不含醇的凝胶浴。方法如下将分子量为30KDa、脱乙酰度为95%的壳聚糖溶于2%乙酸溶液中，配制成重量体积比为2%的溶液，按照重组人骨形态发生蛋白-2/壳聚糖重量比为1:100将重组人骨形态发生蛋白-2溶于其中，混合液在高压静电作用下滴入pH为4的凝胶浴中制备成重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。凝胶浴为三聚磷酸钠的水溶液，浓度为3%。去离子水清洗微球，冷冻干燥后保存待用。经测试，微球较易分散，平均粒径为470um，包封率为100%,蛋白活性100%保持，缓释周期达4周以上，28天时累积释放50.4%±3.6%。样品经小鼠肌袋内植入异位成骨活性试验测试表明，4周后含100微克rhBMP-2的微球的样品在肌袋内形成新鲜骨的平均鲜重为134毫克。证实所制备的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球具有好的诱导成骨活性。与实施例19(不含醇溶剂的凝胶浴出)相比，添加一定浓度的醇溶剂(如实施例4)有利于微球分散，不产生粘连，对粒径、包封率等影响不显著。实施例20重复实施例1的制备过程，不同点仅在于用免疫球蛋白G蛋白替换重组的人骨形态发生蛋白-2。结果，制得了免疫球蛋白G的壳聚糖微球。经测试，微球平均粒径约为120微米，包封率为75%。这表明，本发明的静电液滴-离子交联法同样可适用于包封其他活性蛋白。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1、一种人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，其特征在于，微球基质成分为壳聚糖，包裹的药物为人骨形态发生蛋白-2，壳聚糖通过与离子交联剂发生反应将人骨形态发生蛋白-2包裹其中，并且所述微球的平均粒径在50～1000μm，包封率在75％～100％，蛋白活性90％～100％保持，缓释周期达4周以上，28天累积释放为35％～90％。2、如权利要求1所述的人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，其特征在于，90%以上的所述微球的粒径在0.9ML1M范围内，其中M是所述微粒的平均粒径。3、如权利要求1所述的人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，其特征在于，所述微球中选自下组的物质的各自含量《0.05wt%:表面活性剂、油相、和石油醚。4、如权利要求1所述的人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，其特征在于，所述的微球是采用静电液滴-离子交联法制备的。5、一种制备活性蛋白的壳聚糖微球的方法，其特征在于，包括步骤(a)提供一含壳聚糖和所述活性蛋白的混合水溶液或水性溶液；其中，在所述混合溶液中，壳聚糖的浓度按重量体积比为0.2-6%;并且所述活性蛋白与壳聚糖的重量比1100:300;和(b)在静电场下，将所述的混合溶液滴入凝胶浴中，从而形成活性蛋白的壳聚糖微球，其中所述的凝胶浴是含离子交联剂的水溶液或水性溶液，其PH为27。6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)的混合溶液中含有0.01-1.5M酸，并且在所述浓度的酸存在下对活性蛋白的活性无不利影响。7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，配制壳聚糖酸溶液所用的酸浓度按重量比为0.1%8%。8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述混合溶液中，壳聚糖的浓度按重量体积比为0.5%-5%。9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的活性蛋白是骨形态发生蛋白-2。10.—种药物组合物，其特征在于，它含有药学上可接受的载体以及权利要求1所述的人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。全文摘要本发明涉及一种重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球及其制备方法。本发明的微球基质成分为壳聚糖，包裹的药物为重组骨形态发生蛋白-2，平均粒径为50-900μm，包封率可达75％～100％，蛋白活性保持率高，缓释周期长。本发明微球外观圆整，均匀度好，颗粒规则无粘连，冻干后的微球不粘连，再分散性良好。本发明还提供了制备所述微球的方法，该方法工艺简单，生产成本低，易于实施，反应条件温和，无须添加乳化剂、化学交联剂。文档编号A61K9/16GK101637454SQ20091005128公开日2010年2月3日申请日期2009年5月14日优先权日2009年5月14日发明者刘昌胜,马莉华申请人:华东理工大学