专利名称：注射型藻酸钙/骨形态发生蛋白复合材料及制备方法
技术领域：
本发明属于材料科学与生物医学的交叉领域，具体涉及注射性藻酸钙/骨形态发生蛋白复合材料及制备方法，该复合物可用作充填、修复、替换人体骨组织的材料。
背景技术：
藻酸是一种海藻胶质的酸，藻酸盐是藻酸的盐类，是无水D-甘露糖醛酸的聚合体。藻酸盐在二价离子如钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的水凝胶。藻酸钙凝胶以其良好的生物相容性在组织工程骨(软骨)、药物缓释系统和细胞三维培养等方面得到了广泛应用。藻酸盐拥有良好的生物相容性，是较理想的组织工程支架材料。有学者利用藻酸盐制作微囊，并通过研究微囊对不同细胞的生存和蛋白质分泌影响，证明藻酸钙微囊是理想的细胞生存和蛋白质分泌载体。
骨形态发生蛋白(Bone morphogenticproteins，BMPs)是唯一一类能够启动成骨分化，并作用于成骨整个过程的细胞因子。BMP-2是第一个在体内实验中证明具有骨诱导活性的BMP分子，并且可作为诱导骨形成的充分条件，即在只有单独BMP-2存在的情况下即可诱导软骨和骨组织的形成，并作用于成骨的全过程。
发明内容
本发明的目的是提供注射型藻酸钙/骨形态发生蛋白(BMP)复合材料，该复合材料由藻酸钙和骨形态发生蛋白组成，复合的BMP(骨形态发生蛋白)为人基因重组骨形态发生蛋白-2(recombinant human BMP-2，rhBMP-2)，每10ml复合材料中rhBMP-2的含量为0.1mg，为凝珠状。复合材料制剂形式为注射剂。
本发明的另一个目的是提供注射型藻酸钙/BMP复合材料的制备方法，通过以下步骤实现分析纯低粘度藻酸钠购于Sigama公司，rhBMP-2购于华东制药集团基因研究所。藻酸钠溶于含有0.15M NaCl的溶液中，使藻酸钠的质量分数为1.2％，磁力搅拌机搅拌，PH值调为7.4，高压蒸汽灭菌备用。1.2％的藻酸钠溶液10ml加入rhBMP-2 0.1mg，混合均匀后缓慢滴入40ml 102mM CaCl2溶液中，交联形成凝珠，吸去CaCl2溶液，即制得藻酸钙/BMP复合材料。
本发明的有益之处是(1)藻酸钙微囊是理想的细胞生存和蛋白质分泌载体。藻酸是一种海藻胶质的酸，藻酸盐是藻酸的盐类，是无水D-甘露糖醛酸的聚合体。藻酸盐在二价离子如钙离子存在时可通过离子交联作用形成开放晶格的水凝胶。藻酸钙凝胶以其良好的生物相容性在组织工程骨(软骨)、药物缓释系统和细胞三维培养等方面得到了广泛应用。藻酸盐拥有良好的生物相容性，是较理想的组织工程支架材料。有学者利用藻酸盐制作微囊，并通过研究微囊对不同细胞的生存和蛋白质分泌影响，证明藻酸钙微囊是理想的细胞生存和蛋白质分泌载体。
(2)BMP-2是诱导骨形成的充分条件。在众多的骨生长因子中，BMP-2是最稳定的局部诱导骨形成的生长因子，其高效诱导成骨活性已经被许多实验和临床研究证实，但单纯的BMP在体内扩散太快，也易被蛋白酶分解，在有效的时间内不能作用于更多的靶细胞，其诱导活性难以充分发挥；另外，对于较大的骨缺损，BMP不能发挥支架作用，因此在获得高活性和纯度的BMP后，须选用合适的生物材料为载体，使其免受蛋白水解。本发明采用藻酸钙作为rhBMP-2的载体，取得良好的成骨效果。
(3)成骨方式和过程简易。材料支架+生长因子的成骨方式和材料支架+成骨细胞+生长因子的方式同样可以构建新生骨组织。从临床实用的层面来看，成骨方式和过程的简易具有相当的优点。采用注射的方式，藻酸钙/BMP-2复合材料即可以简易有效地形成一定体积的新生骨组织。应用骨骼肌异位诱导成骨原理，该复合材料在成骨过程中无需加入外源性的种子细胞。
(4)本发明制备的注射型藻酸钙/BMP复合材料，可以简易有效地形成一定体积的新生骨组织，不仅具有较强的骨诱导活性，且具有良好生物相容性和可降解性，可用于充填、修复、替换人体骨组织。
图1为复合材料间隙的种子细胞(HE，40×)。
图2为复合材料间隙的种子细胞可见核分裂相(透射电镜，2000×)。
图3为复合材料组4周时的大体标本。
图4为复合材料组4周时的组织学照片(HE，40×)。
图5为复合材料组6周时的大体标本。
图6为复合材料组6周时的组织学照片(HE，40×)。
图7为复合材料/BMSC组4周时的大体标本。
图8为空复合材料/BMSC组4周时的组织学照片(HE，40×)。
图9为复合材料/BMSC组6周时的大体标本。
图10为复合材料/BMSC组6周时的组织学照片(HE，40×)。
具体实施例方式
本发明结合实施例和附图作进一步的说明。
实施例一注射型藻酸钙/BMP复合材料的制备分析纯低粘度藻酸钠购于Sigama公司，rhBMP-2购于华东制药集团基因研究所。藻酸钠溶于含有0.15M NaCl的溶液中，使藻酸钠的质量分数为1.2％，磁力搅拌机搅拌，PH值调为7.4，高压蒸汽灭菌备用。1.2％的藻酸钠溶液10ml加入rhBMP-2 0.1mg，混合均匀后缓慢滴入40ml 102mM CaCl2溶液中，交联形成凝珠，吸去CaCl2溶液，即制得藻酸钙/BMP复合材料。
实施例二含有骨髓基质细胞(BMSC)注射型藻酸钙/BMP复合材料的制备将新西兰白兔以速眠新(0.1ml/kg)肌注麻醉，以肝素抗凝处理过的16号穿刺针于兔股骨第三转子下抽取骨髓1～2ml，置于含10mlα-MEM完全培养液(含10％胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml)的离心管中，2000转/min离心，去除脂肪成分后接种于培养皿，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，第5日首次全量换液，以后隔日换液。待细胞生长至80-90％汇合时，用0.1％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化(37℃、3～5min)，按1∶3传代培养，收集第二代细胞用于实验。
第二代骨髓基质细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)消化后，1000转/min离心10min浓集，进行细胞计数，然后加入预先制备好的1.2％藻酸钠溶液使细胞密度为4.0×106/ml，吸入10ml注射器中，加入1.0mg rhBMP-2混合均匀。再将此混合溶液缓慢滴入40ml的102mM CaCl2溶液中，立即交联形成凝珠，室温下反应10min以达到最佳交联效果。吸出CaCl2溶液，用0.15M NaCl溶液反复冲洗4次，α-MEM完全培养液冲洗1次，既得复合材料/BMSC的混合物。将凝珠移入培养皿中，加入α-MEM完全培养液，37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，每三天换液一次，共计4周。
4周时挤破凝珠行台盼蓝染色，倒置相差显微镜下观察细胞活力。另取藻酸钙凝珠置于2％戊二醛固定液中前固定，1％锇酸固定液后固定，醇逐级脱水，618包埋液包埋，超薄切片，透射电镜下观察。
观察结果藻酸钙凝珠复合细胞后呈淡黄色，置入培养液后立即变为淡红色。4周时将复合BMSC的藻酸钙凝珠取出，大体观可见凝珠体积增大，但仍能保持良好形态。外力将凝珠挤破后可见细胞团流出，用0.02％台盼蓝染色此细胞团，倒置相差显微镜下可见细胞为圆形，大小不一，部分细胞呈团状分布，胞核清楚，个别为双核细胞，几乎无蓝染细胞。
HE染色显示，细胞均匀分布于材料交联形成的间隙(参见图1)。甲苯胺蓝染色显示细胞均匀着色，大小不一，核大浆少，个别为双核或多核细胞，可见细胞分裂相，细胞结构完整、轮廓清楚，周围有少量的异染性反应。透射电镜观察显示细胞呈圆形或椭圆形，有不规则突起及微绒毛存在，细胞超微结构正常，无线粒体肿大及核糖体脱颗粒现象发生；胞核完整，形态幼稚且较大，呈圆形、椭圆形或不规则形，可见双核；胞浆内粗面内质网、线粒体发达，可见较多的无界膜空泡，空泡边缘可见高电子密度小颗粒；细胞质分布均匀，内含大量形状类似次级溶酶体的颗粒状包涵体，有些细胞内有大的脂质包涵体或含强异染性物质的囊泡(参见图2)。
实施例三肌袋试验新西兰白兔14只，4～6周龄，体重2.0～2.5KG，雌雄不限。随机分成两组，注射型藻酸钙/BMP复合材料组(简称复合材料组)6只，含有BMSC注射型藻酸钙/BMP复合材料组(简称复合材料/BMSC组)8只。复合材料组共制作6份，复合材料/BMSC组共制备8份，制备方法分别见实施例一和二。
6份单纯复合材料分成共分成12小份，每份5ml；每份复合材料/BMSC混合物(共8份)分别均匀分成两份，每份5m1，分别用于相应白兔的注射(即各白兔注射的BMSC均来源于自体)。各新西兰白兔分别以速眠新麻醉后，在双侧下肢股四头肌肌袋中置入。4W进行X线检查，2、4、6周取材后标本进行ALP染色(钙钴法)和Von Kossa染色，分别观察成骨细胞活性和钙沉着情况。各标本均以10％中性醛固定，HE染色，切片，进行组织学观察。对两组织学切片以Olympus HA-2CCD读取图像，平均选定4-6视野/张，采用Leica Qwin(Ver1.0)骨形态分析软件进行新骨面积计量，并以SPSS 8.0统计软件分析两组标本新生骨面积的差异。
1.ALP染色、Von kossa染色和X线检查ALP染色单纯复合材料组和复合材料/BMSC组在2周时，均呈现环形黑染(++～+++)，表明细胞均有成骨活性。
Von kossa染色单纯复合材料组和复合材料/BMSC组在4周时，均呈现棕黑染色(++～+++)，表明标本钙盐沉着矿化。
X线检查单纯复合材料组和复合材料/BMSC组在4周时均显示股四头肌内形成高密度骨组织阴影，提示钙化的骨组织。
2.大体检查和HE染色单纯复合材料组2周时，组织学检查发现材料开始降解，可见软骨、类骨质及少量的新生编织骨形成，其表面见大量成纤维样细胞贴附；4周时，标本大体观见部分表面呈软骨形态，体积与植入材料相当(参见图3)，组织学检查发现材料进一步降解，大量编织骨形成，细胞数量明显减少(参见图4)；6周时，大体观见标本体积轻微缩小，表面软骨形态不明显(参见图5)，HE染色见新生编织骨数量未见显著增加，但骨陷窝增多，材料吸收较多，但仍未完全吸收(参见图6)。
复合材料/BMSC组2周时，亦可见材料开始降解，可见软骨、类骨质及少量的新生编织骨形成，其表面细胞数目少于单纯复合材料组；4周时标本大体观见部分表面呈软骨形态，体积与植入材料相当(参见图7)，组织学观察见编织骨大量形成(参见图8)；6周时大体观见标本体积轻微缩小，表面软骨形态不明显(参见图9)，新生骨数量也未见显著增多，材料仍未完全吸收(参见图10)。
3.新生骨计量对单纯复合材料组和复合材料/BMSC组6周的标本进行新生骨面积计量，统计学分析结果见表1，表明两组标本在新生骨数量上无统计学上显著性差异。
表1两组材料新生骨计量(x±s)
成骨量p＝0.9权利要求
1.一种注射型藻酸钙/骨形态发生蛋白复合材料，其特征是复合材料由藻酸钙和骨形态发生蛋白组成，复合的骨形态发生蛋白为人基因重组骨形态发生蛋白-2，每10ml复合材料中人基因重组骨形态发生蛋白-2的含量为0.1mg，复合材料为凝珠状。
2.根据权利要求1所述的注射型藻酸钙/骨形态发生蛋白复合材料，其特征是复合材料的制剂形式为注射型。
3.根据权利要求1或2所述的注射型藻酸钙/骨形态发生蛋白复合材料的制备方法，其特征是通过以下步骤实现将藻酸钠溶于含有0.15M NaCl的溶液中，使藻酸钠的质量分数为1.2％，磁力搅拌机搅拌，PH值调为7.4，高压蒸汽灭菌备用，将10ml 1.2％的藻酸钠溶液加入0.1mg的人基因重组骨形态发生蛋白-2，混合均匀后缓慢滴入40ml 102mM CaCl2溶液中，交联形成凝珠，吸去CaCl2溶液，即制得藻酸钙/骨形态发生蛋白复合材料。
全文摘要
本发明提供一种注射型藻酸钙/BMP复合材料，复合的BMP为rhBMP－2，每10ml复合材料中rhBMP－2的含量为0.1mg。该复合材料为凝珠状、可注射型。通过将藻酸钠溶于含有NaCl的溶液中，搅拌，pH值调为7.4，灭菌后在藻酸钠溶液中加入rhBMP－2，混合均匀后缓慢滴入102mM CaCl
文档编号A61L27/54GK101036807SQ20071006822
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者徐靖宏, 谈伟强, 林军 申请人:浙江大学