专利名称：从蝇蛆中提取分离具有体外抗肿瘤作用的有效组份的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类抗肿瘤化合物，特别适用于抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖生长的从蝇蛆中提取分离具有体外抗肿瘤作用的有效组份不饱和脂肪酸。
背景技术：
据卫生部统计，近年来我国每年新增肿瘤患者160-170万，主要类型有胃癌(23.02％)、肝癌(17.83％)、肺癌(15.19％)、食管癌(15.02％)、白血病(3.53％)等。其中白血病是一种造血组织的恶性疾病，随着环境污染日益加重，白血病患者已越来越多，目前我国至少有400万白血病患者，且以每年3-4万速度增加，严重危害着人类健康。同时据卫生部全国肿瘤防治研究办公室的一项统计显示，过去5年，中国的肺癌病患者增加了约12万；发病年龄每5年降低1岁；每4个癌症死亡者中就有1人是肺癌患者。如不控制吸烟和空气污染，中国每年肺癌患者将超过100万人，成为世界第一“肺癌大国”，因此寻找抗白血病和肺癌的低毒高效药物已成为刻不容缓的工作。
随着癌症发病率的持续上升，我国恶性肿瘤治疗药物的市场规模也迅猛增长。其中天然抗肿瘤药物尤其受肿瘤患者的青睐，如康莱特、榄香烯、三尖杉酯碱、云芝多糖、香菇多糖等。抗肿瘤研究已成为目前科研的热点，对高效、无毒的抗肿瘤药物的开发也成为必然趋势，尤其天然抗肿瘤药物研究已是我国重点基础研究发展规划项目之一，患者也希望能使用毒副作用较小，对肿瘤细胞敏感的纯天然药物。
蝇蛆是一种新的、廉价的、必需氨基酸含量全面，可开发的前景资源。常用于治疗小儿疳积，随着现代天然药物研究的不断深入，人们发现蝇蛆还具有抗菌、消炎、活化上皮细胞等功能，其体内的凝集素、抗菌肽等活性物质还具有抗菌、抗癌、抗病毒的作用。目前，对蝇蛆的研究受到了广泛的关注。曹小红等已从家蝇蛹中提取出具有抗菌和抗癌作用的凝集素，他们在对工程蝇蛆体内有效成分初步分离的基础上，采用MTT法测定K562细胞的生长抑制率，通过倒置显微镜观察K562细胞的形态变化的方法，对工程蝇蛆体内活性物质及体外抗肿瘤K562细胞作用进行了研究。实验结果表明峰1组分半致死浓度IC50为100μg/mL，峰2组分半致死浓度IC50为80μg/mL。随所添加活性物质浓度的增大，肿瘤细胞受抑制作用增强；活性物质作用于K562细胞前后其细胞形态发生明显变化，受抑制细胞由一个完整细胞变为多个凋亡小体。因此，可以说明工程蝇蛆体内活性物质在体外对K562细胞具有抑制生长的作用。当前，家蝇抗菌肽对细菌和肿瘤细胞的作用机理研究的相对较多，文彩虹等人的研究表明含有抗菌肽的家蝇免疫血淋巴具有抗肿瘤作用主要是能引起肝癌细胞膜通透性增高，抑制能量代谢，抑制分裂增殖。
发明内容
本发明的目的是从外源物质诱导的蝇蛆中提取分离具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖的有效组份一不饱和脂肪酸，使提取方法简便，提取得到的组份高效无毒，具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖的作用，是天然资源中提取分离得到的极具开发潜力的抗肿瘤新药。
本发明公开了一类抑制人癌肿瘤细胞增殖的不饱和脂肪酸，该组份从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得，适用于抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖生长，当受试物浓度为250μg/ml时，外源物质诱导的蝇蛆干粉以及提取分离得到的不饱和脂肪酸体外抑制人原髓细胞白血病HL-60增殖生长的效果分别为25.5％与96.2％。抑制人肺腺癌A549细胞增殖生长的效果分别为26.8％与97.0％。结果证实，从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得的不饱和脂肪酸对人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖生长的抑制率比未提取的原粉有显著提高。
经HP6890/5973 GC/MS联用仪分析，其有效组份不饱和脂肪酸的含量为82.75％(面积归一化法)，其中所含有的物质单体分别为十六碳一烯酸(C16:1)，十六碳二烯酸(C16:2)，十六碳三烯酸(C16:3)，十七碳一烯酸(C17:1)，十八碳一烯酸(C18:1)，十八碳二烯酸(C18:2)，二十碳二烯酸(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，二十碳四烯酸(C20:4)，二十碳五烯酸(C20:5)及二十二碳六烯酸(C22:6)。
生物活性对本发明中分离得到的粗蛋白、粗脂肪和不饱和脂肪酸进行了体外抗肿瘤活性的评价试验1.方法
1.1外源物质诱导的蝇蛆干粉有效组份分析1.2粗脂肪与粗蛋白的提取外源物质诱导的蝇蛆干粉，经乙醚回流提取，提取物挥尽乙醚，得粗脂肪。剩余部分挥尽乙醚，得粗蛋白。
1.3不饱和脂肪酸的提取脂肪经皂化反应后，用石油醚抽提除去非皂化物，皂化物再经酸化和石油醚提取、浓缩得不饱和脂肪酸。
1.4体外肿瘤细胞增殖抑制试验(MTT法)取对数生长期肿瘤细胞，调整细胞悬液浓度，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，接种24小时后给药(100μl/孔)，分别设空白对照组(只加培养液，无细胞和药物，用于计算药物抑制率时扣除培养板的吸光度)、细胞对照组、外源物质诱导的蝇蛆干粉以及提取物各5个剂量组。继续培养72小时后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃培养2～4小时，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定570nm处吸光度，计算受试药物对HL-60和A549细胞增殖抑制率。
1.5小鼠口服急性毒性试验依据食品安全性毒理学评价程序和方法(GB15193.1-2003)采用最大耐受量试验法，选用18-20g体重的小鼠，雌雄各半各10只，受试物为外源物质诱导的蝇蛆中提取的不饱和脂肪酸，用食用油作溶剂配制成1mg/ml的溶液，以20ml/kg容量一次性灌胃，饲养观察14天，动物不出现死亡，则认为受试物对某种动物的经口急性毒性剂量大于某一数值(g/kg)。
2.结果2.1外源物质诱导的蝇蛆干粉基本成份分析结果，见表1表1外源物质诱导的蝇蛆干粉基本成份分析结果
2.2外源物质诱导的蝇蛆干粉脂肪酸成分分析，经面积归一化法计算，其结果见表2表2外源物质诱导的蝇蛆干粉脂肪酸成分分析结果
2.3外源物质诱导的蝇蛆干粉不饱和脂肪酸成分分析，经面积归一化法计算，其结果见表3表3外源物质诱导的蝇蛆干粉不饱和脂肪酸成分分析结果
详见说明书附图HP6890/5973 GC/MS联用仪分析图谱HP6890/5973 GC/MS联用仪分析特种蝇蛆不饱和脂肪酸成分
Sum of corrected areas3221832004070117.D HE-2003.MThu Jan 18 15:24:15 2007
2.4外源物质诱导的蝇蛆干粉、粗脂肪、粗蛋白及不饱和脂肪酸抑制人白血病HL-60肿瘤细胞试验结果，见表4表4外源物质诱导的蝇蛆干粉及分离提取物抑制人原髓细胞白血病HL-60增殖试验结果
2.5外源物质诱导的蝇蛆干粉及不饱和脂肪酸抑制人A549肺癌细胞增殖试验结果，见表5表5外源物质诱导的蝇蛆干粉及不饱和脂肪酸抑制人A549肺癌细胞增殖试验结果
注表4、表5中YQ-1、YQ-2、YQ-3、YQ-4分别指蝇蛆干粉、粗脂肪、粗蛋白和不饱和脂肪酸2.6从外源物质诱导的蝇蛆中提取的不饱和脂肪酸，经小鼠口服急性毒性试验证实其LD50大于10g/kg，属实际无毒。
图1为有效组份之一十六碳一烯酸(C16:1)分析图谱。
图2为有效组份之一十六碳二烯酸(C16:2)分析图谱。
图3为有效组份之一十六碳三烯酸(C16:3)分析图谱。
图4为有效组份之一十七碳一烯酸(C17:1)分析图谱。
图5为有效组份之一十八碳一烯酸(C18:1)分析图谱。
图6、7为有效组份之一十八碳二烯酸(C18:2)分析图谱。
图8为有效组份之一二十碳二烯酸(C20:2)分析图谱。
图9为有效组份之一十碳三烯酸(C20:3)分析图谱。
图10为有效组份之一二十碳四烯酸(C20:4)分析图谱。
图11、12为有效组份之一二十碳五烯酸(C20:5)分析图谱。
图13为有效组份之一二十二碳六烯酸(C22:6)分析图谱。
本发明的有效组份不饱和脂肪酸来源于外源物质诱导的蝇蛆，与先前大量报道的工程蝇蛆中的抗肿瘤成分主要是抗菌肽、凝集素、免疫蛋白是完全不同的一类物质，从而首次提出外源物质诱导的蝇蛆抗肿瘤的有效组份是不饱和脂肪酸。本发明提取方法简便，提取得到的组份高效无毒，具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖的作用，是天然资源中提取分离得到的极具开发潜力的抗肿瘤新药。
具体实施例方式
实施例1制备脂肪酸(1)外源物质诱导的蝇蛆经20-80℃烘干、粉碎、过20-100目筛，称取100g，以乙醚回流提取2-8小时，减压回收溶剂，得乙醚提取物约30-35g，该提取物即为蝇蛆的混合脂肪酸。
实施例2制备脂肪酸(2)外源物质诱导的蝇蛆经低温冷冻干燥、粉碎、过20-100目筛，称取100g，以乙醚回流提取3-6小时，减压回收溶剂，得乙醚提取物约30-35g，该提取物即为蝇蛆的混合脂肪酸。
实施例3制备不饱和脂肪酸取实施例1、2制得的混合脂肪酸40g，加入10倍质量1mol/L的KOH乙醇溶液，密封2小时，离心，取滤液，滤液在-30℃放置1小时，离心，上清液经减压浓缩部分乙醇，加水稀释，用石油醚抽提除去非皂化物，水层经稀HCL酸化，再用石油醚提取，石油醚层用水洗至中性，以无水硫酸钠干燥，回收溶剂，得不饱和脂肪酸，经HP6890/5973 GC/MS联用仪分析，见说明书附图1。
实施例4体外人原髓细胞白血病HL-60细胞增殖抑制试验取对数生长期HL-60细胞，调整细胞悬液浓度为1×105个/ml，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中。次日给药(100μl/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组、外源物质诱导的蝇蛆干粉和提取物31.25、62.5、125、250、500μg/ml剂量组。继续培养72h后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃培养4h，离心弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定各孔570nm处吸光度，计算受试物对HL-60细胞的增殖抑制率。结果为蝇蛆干粉对人原髓细胞白血病HL-60的增殖抑制率为-4.2％、-2.8％、1.6％、25.5％、90.3％，提取物的增殖抑制率为-2.9％、10.4％、73.8％、96.2％、99.9％。生物显微镜下观察，给药后24h蝇蛆干粉500μg/ml剂量组和提取物125μg/ml剂量组细胞即发生明显的形态变化，与对照组细胞相比细胞体积变小，膜皱缩，芽生形成细胞膜包裹的小体；随着药物处理时间延长，形态变化进一步加剧，大部分细胞膜破裂，呈坏死状。
实施例5体外人肺腺癌A549细胞增殖抑制试验取对数生长期A549细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液浓度为5×104个/ml，每孔100μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中。次日给药(100μl/孔)，分别设空白对照组、细胞对照组、外源物质诱导的蝇蛆干粉和其提取物不饱和脂肪酸31.25、62.5、125、250、500μg/ml剂量组。继续培养72小时后每孔加入100μl MTT(1mg/ml，以DMEM培养液溶解)，37℃培养2小时，弃去各孔内液体后加入150μl酸化异丙醇，避光放置30min，DG3022A型酶联免疫检测仪测定各孔570nm处吸光度，计算受试物对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制率，结果为蝇蛆干粉对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制率为1.3％、3.3％、5.8％、26.8％、95.1％，其提取物的增殖抑制率为3.5％、1.0％、15.0％、97.0％、99.2％生物显微镜下观察，给药后24h蝇蛆干粉500μg/ml剂量组和提取物250μg/ml剂量组细胞即发生明显的形态变化，与对照组细胞相比细胞体积变小，变圆，细胞内出现空泡，细胞折光性变弱；随着药物处理时间延长，形态变化进一步加剧，部分细胞肿胀、边缘模糊，甚至细胞膜破裂，呈坏死状。
权利要求
1.从外源物质诱导的蝇蛆中提取分离具有抗肿瘤作用的有效组份不饱和脂肪酸，其特征在于有效组份的成分为十六碳一烯酸，十六碳二烯酸，十六碳三烯酸，十七碳一烯酸，十八碳一烯酸，十八碳二烯酸，二十碳二烯酸，二十碳三烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸及二十二碳六烯酸。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤作用的不饱和脂肪酸，其特征在于结构为十六碳一烯酸(C16:1)，十六碳二烯酸(C16:2)，十六碳三烯酸(C16:3)，十七碳一烯酸(C17:1)，十八碳一烯酸(C18:1)，十八碳二烯酸(C18:2)，二十碳二烯酸(C20:2)，二十碳三烯酸(C20:3)，二十碳四烯酸(C20:4)，二十碳五烯酸(C20:5)及二十二碳六烯酸(C22:6)。
3.根据权利要求1所述的抗肿瘤作用的不饱和脂肪酸，其特征在于具有抑制人原髓细胞白血病HL-60和人肺腺癌A549细胞增殖生长的作用。
全文摘要
本发明涉及一类抗肿瘤化合物，特别适用于抑制人癌肿瘤细胞的增殖生长。该组份从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得，具有抑制人原髓细胞白血病HL－60和人肺腺癌A549细胞增殖生长的作用，当受试物浓度为250μg/ml时，外源物质诱导的蝇蛆干粉及其不饱和脂肪酸体外抑制人原髓细胞白血病HL－60增殖生长的效果分别为25.5％与96.2％，抑制人肺腺癌A549细胞增殖生长的效果分别为26.8％与97.0％。结果证实，从外源物质诱导的蝇蛆中提取、分离获得的不饱和脂肪酸抑制人原髓细胞白血病HL－60和人肺腺癌A549细胞增殖生长比未提取的外源物质诱导的蝇蛆干粉有显著提高。该组份经动物急性毒性试验，结果为无毒。
文档编号A61K31/202GK101032525SQ20071006795
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月10日 优先权日2007年4月10日
发明者周淡宜, 郑晓亮, 徐水祥, 陈青青 申请人:浙江省医学科学院