专利名称：一种基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统及其制备方法
技术领域：
本发明属生物医药和纳米医学技术领域，涉及一种基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳 米前药系统及其制备方法和应用。
背景技术：
恶性肿瘤是威胁人类健康的严重疾病。根据世界卫生组织的报告，全球每年新增 癌症患者1000万人，癌症死亡人数达740万(约占所有死亡人数的13% )，超过70%的癌 症死亡发生在低收入和中等收入国家。到2010年，癌症将超过心脏病，成为世界上第一号 杀手。尽管在过去几十年中，人类在肿瘤的诊断和治疗方面取得了显著的进步，但仍滞后于 疾病的恶化。目前，临床所用的抗肿瘤药物一般为小分子药物，小分子药物在应用时存在着 一些严重的缺陷，如缺乏选择性，在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也有较大的毒副作用； 代谢快，体内消除快，导致在体循环中的半衰期短；长期使用后肿瘤细胞产生抗药性。Matsumura 和 Maeda 于 1986 年研究并报道的 EPR 效应(Enhanced permeability and retention effect)是肿瘤靶向治疗史上重要的里程碑。大多数实体瘤的病理生理特 征与正常组织器官有显著不同，表现为肿瘤血管生长迅速，外膜细胞缺乏，基底膜变形以及 淋巴管道回流系统缺损。这些生理性变化导致了肿瘤血管渗透性的增加，使大分子药物、药 物载体如纳米粒，脂质体等可以穿透肿瘤缺损的血管内皮细胞进入肿瘤组织，并由于清除 障碍而高浓度长时间蓄积在肿瘤组织中可长达100h，即为EI5R效应。因此，采用高分子聚合 物作为药物载体，利用Era效应被动富集于肿瘤组织，其中树枝状聚合物(Dendrimer)由于 其结构的精确性和可调控性，良好的水溶性，表面基团的可修饰性引起了广泛的关注。为进一步提高抗肿瘤药物的疗效，近年来将配体连接到载药微粒表面，通过配 体-受体介导的主动靶向药物传递系统已经成为癌症治疗研究的热点。整合素是一种由 α和β两个亚基以非共价键形式结合，能介导细胞内外双向信息传递的异二聚体跨膜糖 蛋白。其中整合素ν3在多种恶性肿瘤细胞(骨肉瘤、成神经细胞瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺 癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤及浸润性黑色素瘤)表面有高水平的表达，而且在恶性肿瘤组织 的新生血管内皮细胞膜高表达，而在成熟血管内皮细胞和绝大多数的正常器官系统则无表 达或几乎不能被探及。整合素v3的天然配体包括纤维连接蛋白，玻璃连接蛋白，层粘蛋白 等，这些配体的共同特征是在其结构中含有精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD) 序列，而且通过RGD序列与整合素ν 3结合。研究表明，外源性RGD多肽竞争性与肿瘤细胞 表面整和素特异性结合后，不仅表现出抑制肿瘤的作用，且具有靶向性标记肿瘤和输送抗 肿瘤药物的潜在价值。线性的RGD多肽体内易被酶解，半衰期短，从而限制了其应用，而环 肽具有更强的结构稳定性和受体亲和力，从而表现出更高的临床应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统，尤其是基于树枝状聚合物的多功能抗肿瘤纳米前药系统及其制备方法和应用。本发明提供的基于树枝状聚合物的多功能抗肿瘤纳米前药系统由下述四个功能 部分组成⑴最外层的含有RGD序列的主动靶向头基；(2)连接靶向头基和树枝状聚合物 的聚乙二醇(PEG)亲水链段；(3)通过酸敏感化学键连接到树枝状聚合物表面的抗肿瘤模 型药物阿霉素(DOX) ； (4)表面为氨基的树枝状聚合物内核。其通式为RGD-PEG-Dendrimer-DOX 其中RGD为RGDyC，RGDyK, RGDfC, RGDfK等含有RGD序列的环状多肽，其结构中含 有游离巯基或者游离氨基；PEG为分子量为lOOO-lOOOODa的双功能聚乙二醇，其一端含有 马来酰亚胺基，另一端含有羟基琥珀酰亚胺活化酯；Dendrimer为表面带氨基的树枝状聚 合物，如整数代的聚酰胺-胺树枝状聚合物(PAMAM)，聚丙烯亚胺树枝状聚合物(PPI)和树 枝状聚赖氨酸(PLL)等；DOX为阿霉素。本发明利用亲水性材料聚乙二醇(PEG)对树枝状聚合物载体修饰能进一步提高 载体系统的分子量，增强Era效应，增强载体系统的亲水性，有利于躲避巨噬细胞的识别， 延长在体内的循环时间，从而有利于药物在肿瘤部位的蓄积。现有技术表明肿瘤部位的组织间隙液的PH偏酸性，内涵体和溶酶体等细胞器的 PH进一步下降，最低可达到4. 5，本发明利用此pH的差异，在小分子抗肿瘤药物和聚合物载 体之间引入在中性条件下稳定，而对酸性条件敏感的化学键，使得纳米前药系统经静脉注 射后在体循环中维持稳定，不释放活性药物，从而降低对正常组织的毒副作用；而当纳米前 药系统经被动靶向和主动靶向的双重作用达到肿瘤部位，并以胞饮的方式进入内涵体/溶 酶体时，由于PH降低引起化学键断裂，从而释放活性药物，发挥其抗肿瘤作用。本发明提供的基于树枝状聚合物的多功能抗肿瘤纳米前药系统的制备方法，其包 括下述步骤1)通过下述合成路线，以阿霉素(DOX)的糖氨基与顺式乌头酸酐(CA)经氨解反应 生成阿霉素_顺式乌头酸酐衍生物(CAD-1和CAD-2)。
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DOXCACAD-ICAD-2其中，向DOX的水溶液中滴加CA的二氧六环溶液，维持反应体系的PH为弱碱性， 反应结束后调节体系pH至弱酸性，以乙酸乙酯萃取，有机层经干燥，减压蒸馏后得到CAD ；2)通过下述合成路线，以RGD环肽的巯基与双功能聚乙二醇(MAL-PEG-NHS)的马 来酰亚胺基反应生成RGD多肽修饰的聚乙二醇羟基琥珀酰亚胺活化酯(RGD-PEG-NHS)，并 与Dendrimer的表面氨基反应生成RGD-PEG修饰的树枝状聚合物(RGD-PEG-Dendrimer)， 3)通过下述合成路线，CAD经EDC活化后与RGD-PEG-Dendrimer反应制备得到最 终产物 RGD-PEG-Dendrimer-DOX。 本发明的有益效果在于，本发明的多功能抗肿瘤纳米前药系统的显著优点在于(1)以高分子树枝状聚合物为药物载体，利用EPR效应被动靶向于肿瘤组织；(2)利用亲水性的聚乙二醇(PEG)对纳米系统进行修饰，提高了载体系统的亲水 性，进一步提高了药物的溶解度，增大了载体系统的分子量，增强了 Era效应，有利于被动 靶向于肿瘤组织，PEG链的亲水性和柔韧性有利于载体系统躲避网状内皮系统的摄取，从而 延长在血液循环中的时间；(3)通过改变PEG分子的连接个数和分子量，以及树枝状聚合物的代数，实现对载 药量和分子量大小和纳米系统表面电荷的控制，进一步优化纳米系统的体内行为；
(4)含有RGD序列的靶向头基可以将纳米载药系统特异性地运送到肿瘤组织，减 少非靶组织的摄取，从而降低毒副作用，而且可以通过受体和配体的特异性相互作用增加 新生血管内皮细胞和肿瘤细胞对纳米载药系统的摄取；(5)药物分子与载体之间的酸敏感化学键在血液循环中性pH条件下稳定不释放 药物，从而减小了对正常组织的毒性，一旦纳米载药系统经胞饮作用进入细胞内的酸性细 胞器，如内涵体和溶酶体等，由于内涵体和溶酶体中PH显酸性，药物分子与载体之间的化 学键可以发生分子内的自身催化而发生断裂释放出游离药物，游离药物在以扩散的方式透 过溶酶体膜，并最终进入细胞核，发挥其细胞毒性作用。
图1为CAD的HPLC色谱图，图中色谱峰1，2，3分别为反应产物CAD-1，CAD-2以及少量的未反应的原料DOX ； 其中，反应产物CAD是两个同分异构体组成，两者均含有在能弱酸性条件下发生分子内自 身催化的双键顺式位的羧基。图2为RGD-PEG-G4PAMAM的核磁共振图谱，图中显示，在2. 2-2. 65ppm处出现G4PAMAM的特征峰，在3. 4-3. 6ppm处出现PEG 的特征峰，在6. 6-7. Oppm处出现RGD的特征峰。图3为多功能纳米前药系统的体外释放曲线，其中，RPPCD12是指一个G4PAMAM分子表面共价连接12个RGD-PEG5000分子和14 个DOX分子的多功能纳米前药系统； RPPCD20是指一个G4PAMAM分子表面共价连接20个RGD-PEG5000分子和14个DOX 分子的多功能纳米前药系统；图中显示纳米前药系统在中性条件下不释药，在弱酸性条件下释放活性药物D0X， 而且RPP⑶20的释放百分数比RPP⑶12更大。图4为多功能纳米前药系统的细胞毒性，图中显示，两种纳米前药系统的毒性都小于原药DOX，RPPCD20的细胞毒性大于 RPPCD12 ο图5为多功能纳米前药系统的细胞摄取，图中显示，RPP⑶20的细胞摄取大于RPP⑶12，两者均能被过量的RGD所抑制。图6为荷瘤小鼠的生存曲线，图中显示，相对于生理盐水组和DOX原药组，RPP⑶20和RPP⑶12均能显著延长荷 瘤小鼠的生存期，且RPP⑶20优于RPP⑶12。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明加以进一步的说明，但是不限制本发明的内容。实施例1 1，CAD 的合成称取27mgCA(173. lmol)，溶于Iml 二氧六环，在室温条件下逐滴加至 30mgD0X(51.7mol)的IOml水溶液中，用0. 5N的氢氧化钠溶液维持整个过程的pH在8. 5-8. 7之间，继续反应IOmin，调节pH值至7. 4左右，置冰箱冷至4°C，用4°C的IN HCl调节 PH至2. 5-3，用乙酸乙酯萃取(50ml X 2)，收集有机层，用饱和氯化钠，无水硫酸钠除水，减 压蒸馏得到鲜红色粉末状固体。HPLC分析产物的纯度(Hypersil ODS C18柱(4. 6 X 250mm， 5m)，柱温为30°C，流动相为3%碳酸铵水溶液(w/w) /甲醇=1/2 (ν/ν)，进样体积201，流速 为 1. Oml/min)。2，RGDyC-PEG-G4PAMAM 的合成 称取10. 5mgRGDyC(17. 6mol)，溶于2. Iml醋酸钠缓冲液(ρΗ6. 0)，称溶液A ；称取4 代聚酰胺_胺树枝状聚合物(G4PAMAM) 14. 2mg (Imol)，，溶于5ml硼砂缓冲液(pH9. 3)，称溶 液B。称取82. 4mg NHS-PEG-MAL(平均分子量5kDa) (16mol)于室温下以固体形式加至溶液 A中，涡旋30s，后将反应液全部加至溶液B中，继续于室温反应12h。然后转移至截留分子 量为50kDa的超滤管，于4000rpm，30min超滤5-6次去除未反应的PEG-RGD和RGD，收集上 层液体冷冻干燥得到白色疏松状固体。3，RGDyC-PEG-G4PAMAM-D0X 的合成称取5mgCAD (7. Imo 1)，溶于2. 9ml 0. 2M磷酸缓冲液(ρΗ6· 0)，称溶液C ；称取 114mgRGDyC-PEG-G4PAMAM(0. 15m。l)，溶于 5ml 水，称溶液 D。称取 13. 7mgl-乙基-3-(3-二 甲胺基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC) (71mol)，加至溶液C中，并于室温暗处反应30min， 然后将反应液全部加至溶液D中，调节pH至8.0，继续于室温暗处反应12h。然后用 SephadexG25fine分离产物得到RGDyC-PEG-G4PAMAM_D0X，透析脱盐并浓缩后冻干，得到浅 红色疏松状固体。配制冻干产物一定浓度的水溶液，于IN HC1，50°C孵育1. 5h后HPLC分 析，同时配置一系列浓度的DOX溶液，相同条件下孵育后HPLC分析制备标准曲线，并计算含 药量(Hypersil ODS C18柱(4. 6 X 250mm，5m)，柱温为30°C，流动相为0. OlM磷酸二氢钾水 溶液/甲醇/冰醋酸=30/70/0. 3 (ν/ν/ν)，进样体积201，流速为1. Oml/min)。实施例2 同实施例1的试验方法，固定G4PAMAM和MAL-PEG-NHS的分子量(5000Da)，改变 PEG/PAMAM的投料比，制备得到不同PEG修饰程度的纳米载药系统。实施例3 同实施例1的试验方法，固定G4PAMAM，改变MAL-PEG-NHS的分子量为lOOODa， 2000Da, 3400kDa，lOOOODa，制备得到不同分子量的PEG修饰的纳米载药系统。实施例4:同实施例1的试验方法，固定MAL-PEG-NHS的分子量为5000Da，改变PAMAM的代数 为5代，6代和7代，制备得到不同代数树枝状聚合物载体内核的纳米载药系统。实施例5 同实施例1的试验方法，固定MAL-PEG-NHS的分子量为5000Da，改变PAMAM为聚丙 烯亚胺树枝状聚合物(PPI)和树枝状聚赖氨酸(PLL)，制备得到不同载体内核的纳米载药 系统。实施例6 多功能抗肿瘤纳米前药系统的体外释放研究称取含有一定量DOX的载药制剂，用水溶解后置于截留分子量为3500Da的透析袋 中，然后分别置于一定体积的pH为4. 5和7. 4的缓冲液中，于37°C和IOOrpm的条件下孵 育，定时从外液取样，HPLC测定DOX的浓度，计算释放百分数。
实施例7 多功能抗肿瘤纳米前药系统的细胞毒性实验以小鼠黑色素瘤细胞系B16为模型，每孔细胞数为5000个，分别与不同浓度的药 物孵育48h，然后加入MTT试剂(3- (4，5- 二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐)，再孵 育3h，去除培养液，加入0. lml 二甲亚砜(DMS0)，37°C振荡15min，于570nm测定各个空孔吸光度。实施例8 多功能抗肿瘤纳米前药系统的细胞摄取实验将培养的B16细胞消化，离心并用培养液重悬成12. 5万cell/ml，每个35mm2的培 养皿中加2ml细胞悬液，37°C，5% C02培养24h ；24h后吸去培养液，加入一定浓度的药液， 孵育lh ；lh后结束孵育，先用lml 4度的PBS洗一遍，再用0. 5ml含0. 05% EDTA-2Na的 0. 25%胰酶于37°C消化约4min，加入0. 5ml培养液结束消化，吹打使成单细胞悬液，并转移 至1.5ml的EP管；于3000rpm，5min离心，吸去上清，0. 3ml 2%多聚甲醛重悬，流式细胞仪 测定荧光强度。实施例9 多功能抗肿瘤纳米前药系统的药效学实验取含有100万个B16细胞的悬液注射到6周左右的C57雄性小鼠右侧腋下，分别 于0，7，14，21天经尾静脉注射给予相当于5mg/kg剂量D0X的载药制剂，记录肿瘤体积和生 存时间。
权利要求
一种基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统，其特征在于，由含有RGD序列的主动靶向头基，聚乙二醇亲水链段，连接到树枝状聚合物表面的抗肿瘤模型药物和树枝状聚合物内核组成；其结构通式为RGD-PEG-Dendrimer-DOX其中，RGD为含有RGD序列的环状多肽；PEG为双功能聚乙二醇，分子量为1000-10000Da，其一端含有马来酰亚胺基，另一端含有羟基琥珀酰亚胺活化酯；Dendrimer为表面带氨基的树枝状聚合物；DOX为阿霉素。
2.按权利要求1所述的基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统，其特征在于，所述 的环状多肽其结构中含有游离巯基或者游离氨基；所述的表面带氨基的树枝状聚合物为整数代的聚酰胺_胺树枝状聚合物，聚丙烯亚胺 树枝状聚合物或树枝状聚赖氨酸。
3.按权利要求1所述的基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统，其特征在于，所述 的含有RGD序列的环状多肽是RGDyC，RGDyK, RGDfC,或RGDfK。
4.如权利要求1所述的基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统的制备方法，其特征 在于包括下述步骤1)通过下述合成路线，以阿霉素的糖氨基与顺式乌头酸酐经氨解反应生成阿霉素_顺 式乌头酸酐衍生物，2)通过下述合成路线，以R⑶环肽的巯基与双功能聚乙二醇的马来酰亚胺基反应生 成RGD多肽修饰的聚乙二醇羟基琥珀酰亚胺活化酯，并与Dendrimer的表面氨基反应生成 RGD-PEG修饰的树枝状聚合物， 3)通过下述合成路线，CAD经EDC活化后与RGD-PEG-Dendrimer反应制备得到最终产 物 RGD-PEG-Dendrimer-DOX，
5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中，向DOX的水溶液中滴加 CA的二氧六环溶液，维持反应体系的pH为弱碱性，反应结束后调节体系pH至弱酸性，以乙 酸乙酯萃取，有机层经干燥，减压蒸馏后得到CAD。
6.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中，含有巯基或经巯基化的 RGD环肽在弱酸性条件下与MAL-PEG-NHS反应，与Dendrimer在弱碱性的缓冲液中反应，纯 化，冻干制得 RGD-PEG-Dendrimer。
7.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中，CAD在弱酸性条 件下经EDC活化，与RGD-PEG-Dendrimer在弱碱性的缓冲液中反应，纯化，冻干制得 RGD-PEG-Dendrimer-DOX0
8.权利要求1所述的基于树枝状聚合物的抗肿瘤纳米前药系统在制备肿瘤靶向治疗 药物中的用途。
全文摘要
本发明属生物医药技术和纳米医学技术领域，涉及一种基于树枝状聚合物的多功能纳米前药系统，该纳米系统由(1)最外层RGD环肽作为主动靶向头基；(2)连接靶向头基和树枝状聚合物的聚乙二醇亲水链段；(3)通过酸敏感化学键与树枝状聚合物连接的抗肿瘤药物；(4)树枝状聚合物内核四个功能部分组成。其通式为RGD-PEG-Dendrimer-DOX。其中聚合物载体的高分子属性使载体系统能通过EPR效应被动靶向肿瘤组织；RGD环肽通过配体-受体相互作用将载体系统主动靶向肿瘤组织，并促进其内吞；酸敏感连接键保证载药系统在体循环中稳定，而到达肿瘤部位进入酸性细胞器后释放活性药物，发挥细胞毒性作用。
文档编号A61K31/704GK101879313SQ20091005094
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者姜嫣嫣, 朱赛杰, 洪鸣凰, 裴元英 申请人:复旦大学