专利名称：一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，涉及复制缺陷型腺病毒，具体涉及一种使复制缺陷型腺 病毒选择性复制的方法，尤其涉及一种用于肿瘤基因治疗的复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位 选择性复制的方法和应用。
背景技术：
恶性肿瘤是危害人类健康的最主要的疾病。传统的手术、化疗和放疗等方法目前 仍然无法明显改善人们对这类疾病相对无奈的局面。基因治疗经过二十年的发展，作为一 种新的治疗肿瘤的手段越来越受到人们的关注，截止2009年1月，全球已实施的1472项基 因治疗临床试验方案中，用于肿瘤治疗的有960项，占65. 2%。腺病毒(Adenovirus，Ad)是 目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。据报道，在已实施的基因治疗 临床试验方案中，使用腺病毒作为载体的有360项，占24. 5%，居首位。2004年1月及2005 年10月我国SFDA在国际上率先批准了二个以腺病毒作为载体的治疗恶性肿瘤的工类新 药。腺病毒的有效性和安全性问题一直是制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应 用的瓶颈。现有技术公开了腺病毒载体用于基因治疗有许多优点如可插入较大的外源基 因片断(8. 5kb)、容易制备且病毒滴度较高、宿主范围广、可介导外源基因短时高水平表达、 基因转移效率不受细胞增殖状态影响、其基因组通常不会整合入宿主细胞染色体，故不易 发生插入突变，较安全等。但腺病毒载体在应用特别是体内应用时仍存在一些问题①腺病 毒载体介导外源基因表达时间短。由于腺病毒载体的免疫原性较高，进入体内的病毒很快 被机体清除，一般仅持续7-10天。②外源基因表达水平仍然不够理想。虽然腺病毒载体可 介导外源基因短时高水平表达，但由于目前治疗基因都不够有效，并且用于基因治疗的腺 病毒载体多数是复制缺陷型载体，在体内不能复制，而用药剂量过大会导致急性毒性反应， 所以对于肿瘤基因治疗来讲外源基因表达水平显得仍然不够理想，而通过加大用药剂量提 高外源基因表达水平的空间几乎为零。③非特异性分布及病毒泄漏导致的毒副作用。由于 腺病毒的宿主范围较广，在感染靶组织的同时也感染其他正常组织，体内应用时存在明显 的组织细胞非特异性分布，特别是易在肝脏内聚集，产生毒副作用，且该问题随着腺病毒在 临床实践中的应用而日见突出，因此，临床应用时大都直接或通过介入方式将腺病毒注射 到肿瘤内。然而，实践表明，即使是肿瘤内给药，大量的腺病毒仍然会泄漏到循环血液中，并 感染其他正常组织特别是肝细胞，其中，在使用复制型腺病毒时更为严重。以上问题已成为 制约腺病毒在基因治疗临床实践中广泛应用的瓶颈。故，基因治疗的有效性和安全性问题 一直是基因治疗研究和临床试验的一大热点和难点问题。研究人员认为，解决上述腺病毒有效性的策略之一是采用“增殖型腺病毒系统”也 称“溶瘤病毒”，但安全性会降低。由于增殖型腺病毒存在潜在的安全性问题，目前已实施 的基因治疗临床试验方案中大多数使用的仍然是复制缺陷型腺病毒载体，此类病毒基因组 中不含腺病毒复制必须的El区基因，El区是腺病毒基因组进入细胞核后立早表达的基因，对后续其他基因的表达以及病毒复制起到至关重要的作用。有研究在一些细胞系的基因组 中整合了腺病毒基因组左端一段包括El区基因的序列，构建了所谓腺病毒包装细胞系(如 293、911以及PERC6等)，这些细胞系可以反式提供El区的功能，使El区缺失的腺病毒载体 增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。此类腺病毒在体内不能复制，比较安全，但限于客观情况， 目前基因治疗效果仍不理想。增殖型腺病毒系统又称为肿瘤特异性增殖型腺病毒，该载体利用肿瘤与正常组织 及细胞间结构或代谢途径上的差异，使病毒可以特异性地靶向肿瘤细胞内复制、增殖，大量 表达目的基因并最终裂解肿瘤细胞。增殖型腺病毒与传统的复制缺陷型腺病毒载体比较有 以下几个优点①病毒的大量增殖可以直接杀死感染的肿瘤细胞，并扩散到邻近肿瘤细胞； ②腺病毒溶解肿瘤细胞能释放肿瘤抗原，提呈给树突状细胞和T细胞识别，起到"瘤苗" 的作用，产生抗肿瘤免疫反应；③除了自身的溶瘤能力，增殖型腺病毒载体在大量复制增殖 的同时还可使所携带的外源基因大量表达，通过多种途径杀灭肿瘤，即病毒-基因疗法。如 果治疗基因和增殖病毒的优势都能充分发挥的话，增殖病毒携带治疗基因的药物很可能将 是临床最成功的基因治疗药物。但大量的腺病毒泄漏到循环血液中，直接感染其他正常组 织以及由于免疫反应而导致急性毒性反应，这一安全性问题在使用复制型腺病毒时显得更 为突出。解决上述复制型腺病毒安全性的策略之一是采用肿瘤组织特异性启动子调控腺 病毒复制的必需元件El基因，但有效性会降低。对于增殖型腺病毒载体来说，最重要的莫 过于安全性的问题，也就是如何使其识别何者为肿瘤细胞，何者为正常细胞，目前常用的策 略之一是采用肿瘤组织特异性启动子如缺氧启动子、端粒酶启动子等调控腺病毒复制的必 需元件El基因，使其特异地在肿瘤细胞中复制。但仍存在下述缺陷①大多数肿瘤组织 特异性启动子活性较低，在安全性提高的同时基因治疗的有效性则会降低；②肿瘤组织特 异性启动子的严紧性是相对的，如果大量的腺病毒泄漏到循环血液中仍然会带来潜在的危 险；③构建过程比较繁琐，并且需要一病毒一构建。与本发明相关的现有技术有如下参考文献1. http://www. wiley. co. uk/genmed2. Hartl B, Zeller T，Blanchette P，et al. Adenovirus type 5 early region IB 55-kDaoncoprotein can promote cell transformation by a mechanism independent from blockingp53-activated transcription. Oncogene.2008 ；27 (26) :3673_84·3. Danielsson AiDzojic HiNilsson B, et al. Increased therapeutic efficacy of theprostate-specific oncolytic adenovirus Ad[I/PPT-E1A]by reduction of the insulator sizeand introduction of the full-length E3 region. Cancer Gene Ther. 2008 ； 15 (4) :203_13·4. Nevels Μ. Dobner Τ.Determination of the transforming activities of adenovirusoncogenes. Methods Mol Med. 2007 ；131 187-95.5.李惠明，王丰，韦芳等.利用腺病毒提高腺相关病毒对肿瘤细胞的转导效率.中 华医学杂志.2007,87(28) 1987-19906. Huang X, Yang Y. Innate Immune Recognition of Viruses and Viral Vectors. Hum GeneTher. 2009 ；5
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发明内容
本发明的目的是为克服现有技术的缺陷，提供一种使复制缺陷型腺病毒选择性复 制的方法。具体而言，本发明以真核表达载体或重组腺相关病毒(rAAV)为载体，根据不同类 型肿瘤的遗传特点，选择肿瘤细胞或状态或组织特异性的启动子调控腺病毒复制必需元件 ElA基因，在肿瘤局部反式提供腺病毒复制必须的El区的功能，使腺病毒在肿瘤细胞内特 异性地复制而在正常细胞内不复制。本发明所述复制缺陷型腺病毒，其复制必需元件ElA基因受肿瘤细胞或肿瘤组织 特异性启动子调控，由真核表达质粒或重组腺相关病毒载体携带，在肿瘤局部反式提供。腺 病毒能够通过本身的溶瘤作用、携带的治疗基因的作用以及ElA的抑癌作用三种作用协同 有效杀伤肿瘤细胞而对正常的组织或细胞基本无害。本发明中，所述腺病毒复制必需的早期基因的启动子，被人肿瘤细胞或肿瘤组织 的启动子所取代。所述的腺病毒早期基因包括ElA，ElAElB，ElAElB19k ；所述的启动子包括 肿瘤细胞或微环境特异性的启动子或肿瘤组织特异性启动子，其中，肿瘤细胞或微环境特 异性的启动子可以是低氧诱导性基因的启动子，E2F1基因启动子，Midikin基因启动子，端 粒酶(TERT)基因启动子或热休克蛋白基因启动子；所述的肿瘤组织特异性启动子可以是 前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUCl基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α -甲 胎蛋白(AFP)基因启动子，erbB2基因启动子，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase基因 的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子或癌胚抗原蛋白(CEA)基 因启动子。本发明中，所述的重组腺相关病毒载体可以是本领域技术人员知悉的所有血清型 重组腺相关病毒载体。本发明中，所述的真核表达质粒导入肿瘤局部的方法包括与脂质体混合注入、与 超声微泡共孵育超声导入、电击导入等。本发明中，所述腺病毒DNA的El或E3区域嵌入抗癌基因。所述抗癌基因包括细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因，细菌毒 素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子和放射线增敏基因及其反义基因或干扰RNA片段。所述的抗癌基因的启动子包括强效启动子(如CMV)、肿瘤细胞或微环境特异性的 启动子和肿瘤组织特异性启动子。本发明的另一目的是提供所述使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法的医用用 途。尤其涉及所述使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法在用于制备肿瘤基因治疗药物中 的新用途。本发明中，所述的复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制。本发明方法可以方便、快捷地在肿瘤局部赋予任何一个的复制缺陷型腺病毒以选择性增殖、复制及用于肿瘤基因治疗。本发明使复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制的方法能用于治疗肿瘤药物 的制备。尤其是用于制备治疗人类原位或转移肿瘤的药物。本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统可单独用于肿瘤的治疗。携 带ElA基因的真核表达质粒可于复制缺陷型腺病毒治疗前导入肿瘤局部；携带ElA基因的 rAAV可同时或先后与复制缺陷型腺病毒注射入肿瘤局部。本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤的放射线治疗 (radiation therapy)相结合，对肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带ElA基因的rAAV或真 核表达质粒可以在放射治疗前，放射治疗期间，或放射治疗后直接注射入肿瘤中。本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤化学治疗结合，对 肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带ElA基因的rAAV或真核表达质粒可以在化学治疗前，化 学治疗期间，或化学治疗后直接注射入肿瘤中。本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤的光动力学治疗 (photodynamic therapy)结合，对肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带ElA基因的rAAV或真 核表达质粒可以在光动力学治疗前，光动力学治疗期间，或光动力学治疗后直接注射入肿 瘤中。本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤温热治疗结合，对 肿瘤进行综合治疗。腺病毒与携带ElA基因的rAAV或真核表达质粒可以在温热治疗前，温 热治疗期间，或温热治疗后直接注射入肿瘤中。本发明所述的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制系统，可与肿瘤的免疫基因、 细胞凋亡诱导基因、抗新生血管形成基因、细菌毒素基因、肿瘤抑制基因、免疫调节 因子和放射线增敏基因及其反义基因或干扰RNA片段、自杀基因化学治疗(suicide genechemotherapy)及其它治疗基因治疗相结合，对肿瘤进行综合治疗。其中，免疫 基因包括白介素(IL)，各种集落刺激因子(CSF)，肿瘤坏死因子(TNFa)，各种细胞 粘附分子等；自杀基因包括细菌或及酵母的cytosine deaminase (CD)基因；疱疹病 毒的thymidine kinase (TK)基因；以及p450基因。与它们相关的化疗药物分别是 5-fluorocytidine(5-FC), gancyclovir,cyclophosphamide.本发明的技术方案通过下述方法和步骤实现1、通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤或组织特异性启动子；2、构建携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件ElA基因的真核 表达载体和rAAV载体；3、包装、扩增、纯化重组腺相关病毒(rAAV)，并进行测序及功能鉴定；4.构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体；5.包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；6.活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位增殖、复制；7.活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位复制对肿瘤生长的抑制。本发明的有益效果在于，本发明只要将携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件ElA基因 的真核表达载体或rAAV与任何一个已有的复制缺陷型腺病毒同时或先后导入肿瘤局部，
6即可方便、快捷地在肿瘤局部赋予任何一个复制缺陷型腺病毒以增殖、复制的能力，解决增 殖型腺病毒一病毒一构建带来的麻烦。本发明协同了“病毒溶瘤作用、ElA抑癌作用、治疗基因作用”三大作用，特别是使 用rAAV系统，会将上述协同作用进一步放大，基因治疗效果进一步提高，最终将有望降低 腺病毒用量。本发明所使用的病毒即使外漏，也仅为复制缺陷型病毒，克服了增殖型腺病毒外 漏带来的潜在安全性问题。本发明只要根据不同类型肿瘤的遗传特点，选择合适的肿瘤细胞或状态或组织特 异性的启动子，适用于不同组织来源的肿瘤及疾病的治疗，具有广阔的应用前景。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明的进行详细地描述。需 要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本 文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入 本发明的范围内。
图1. AAV2-EGFP联合应用不同滴度的非复制型腺病毒感染NCI-H460肿瘤细胞7d 时荧光显微镜记录结果(X400)，其中，随着非复制型腺病毒用量增加，受感染的阳性细胞明显增加，GFP表达明显 增强，显示小剂量非复制型腺病毒即能提高AAV携带基因的表达水平，呈明显量效关系，A AAV2-EGFP组；B-F :AAV2-EGFP+Ad_null 组，Achnull 剂量分别为 0. 001/0. 01/0. 1/1/10M0I。图2. AAV2-EGFP联合应用不同滴度的非复制型腺病毒感染NCI-H460肿瘤细胞，其中，随着非复制型腺病毒用量增加，流式细胞仪检测被感染的肿瘤细胞EGFP阳 性率逐渐增强，显示小剂量非复制型腺病毒即能提高AAV的转导效率，呈明显量效关系。图3. NCI-H460转质粒24h后加病毒AdGFP (IOmoi)，48h时荧光显微镜记录结果 (X 50)，其中，显示ElA基因能明显提高腺病毒所携带报告基因GFP的表达水平。图4. ElA基因对腺病毒增殖、复制的影响，其中，腺病毒(IOmoi)感染A549细胞，4h后用PBS系3遍，换新鲜培养基，72h后 收取细胞和上清测病毒滴度，显示腺病毒只要有ElA即可复制，对ElB的依赖性不大，A AdGFP ；B :Ad-hTERT-ElA ；C :Ad-hTERT-ElA_ElB ；D :DL309。图5.活体肿瘤原位复制缺陷型腺病毒Ad-CMV_IL2的增殖、复制，其中，将纯化后的质粒pcDNA3. I-TERTp-EIA和非复制型病毒Ad-CMV_IL2先后导 入人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，病毒注射后72h取肿瘤，将肿瘤勻浆进行 腺病毒滴度测定，结果表明，pcDNA3. Ι-TERTp-ElA联合Ad-CMV_IL2组腺病毒滴度明显高于 对照质粒pcDNA3. 1联合Ad-CMV-IL2组(未进入细胞的病毒背景量)。图6.活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒携带治疗基因IL2的表达测定，其中，将纯化后的质粒pcDNA3. I-TERTp-EIA和非复制型病毒Ad-CMV_IL2先后导 入人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，病毒注射后72h取肿瘤，将肿瘤勻浆进行 IL2表达水平测定，结果表明，pcDNA3. I-TERTp-EIA联合Ad-CMV_IL2组IL2表达水平明显 高于对照质粒pcDNA3. 1联合Ad-CMV-IL2组。
具体实施例方式实施例1通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤特异性启动子A.端粒酶5’端调控顺序在自然的DNA复制过程中，染色体的末端将随着每一次细胞分裂而缩短。染色体 末端端粒的完整对染色体的稳定性至关重要。而端粒的完整是靠端粒酶来维持的。端粒酶 在超过99%的正常细胞里没有活性，而在超过90%的肿瘤细胞里被重新激活。实验证明， 端粒酶活性是由它的启动子控制的。端粒酶(TERT)的启动子在绝大多数的肿瘤里有活性， 而在正常细胞里没有活性。由此，TERT的启动子成为肿瘤选择性活化的启动子。为了分离 端粒酶启动子，本发明采用PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增启动子(序列一)，将其 插入质粒pEGFP-Ι (购自Clontech公司)中，驱动GFP基因表达，构建pTERT_EGFP表达质 粒，然后，用脂质体将pTERT-EGFP转入各种细胞中，实验显示，EGFP仅在肿瘤细胞中表达， 而在正常细胞中则没有EGFP表达。B.E2F1基因启动子在绝大多数的肿瘤细胞中，抑癌基因Rb及其相关的信号通路上的其他基因都被 失活。这些变化使转录因子E2F1得以激活。因此，E2F1基因的启动子在大多数的肿瘤中 高度活化，而在大多数的正常细胞中则没有活性。本发明通过E2F1基因的启动子来控制腺 病毒复制所必须的ElA基因的表达，能使腺病毒选择性地在肿瘤细胞中复制。本发明通过 PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出启动子(序列二)，将该段顺序插入质粒pEGFP-1 中，以E2F1基因启动子驱动EGFP表达，获得表达质粒pE2Fl-EGFP。之后的脂质体辅助的转 导实验结果显示，GFP在肿瘤细胞中高水平表达，而在正常成纤维细胞中表达量很低。表明 该启动子的活性在正常与肿瘤细胞之间的区别很大，可用于调控腺病毒选择性地在肿瘤内 复制。C.缺氧诱导性启动子氧气的分压降低已被确定为各种实体肿瘤的共同特征。其产生的主要原因是由 于肿瘤细胞快速生长，而新生血管的生长速度跟不上新长出来的肿瘤组织。组织内的各种 营养成分，如氧气、葡萄糖等都处于长期或间歇性的短缺状态。处于这种微环境状况下的 肿瘤细胞会激活一系列的基因。而这些基因的激活，均由缺氧诱导因子(HIF-Ia)的转录 因子调控。所述因子本身的激活机制则主要是通过其下游的5’调控顺序中的所谓缺氧反 应单元(HRE)。针对上述特点，本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离缺 氧诱导性的启动子(序列三)，所述启动子是血管生长因子/血管通透性因子(VEGF)的5’ 端的启动子，其已被多种实验证明，是能被缺氧微环境所诱导的最强烈的基因。而它的启 动子也被证实在肿瘤中选择性的活化。本发明将所述启动子插入到质粒PEGFP-I中，得到 pHRP-EGFP-Ι。实验证明，上述启动子在缺氧的肿瘤细胞中被选择性激活，而在正常氧气分 压下它的活性很低。D. α-胚胎蛋白(AFP)基因启动子α-胚胎蛋白(a-fetoprotein)是一种在人类胚胎发育期高水平表达的蛋白。 在成年人中它几乎没有表达。但是，在肝癌患者的血液中其水平明显增加。这一表达已被证实是通过增加其启动子的活性引起。鉴于它在正常细胞中的表达活性非常低，α-胚胎 蛋白基因启动子是能区分肝癌和正常肝组织的启动子。本发明通过PCR技术，以人类细胞 DNA为模板，扩增出α-胚胎蛋白基因启动子(序列四)，将其克隆到质粒pEGFP-Ι中，得到 pAFP-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果显示，只有在肝癌细胞中才观察到有高水平的GFP 报告基因表达，而在正常细胞和没有α -胚胎蛋白表达的肿瘤细胞中均没有GFP表达。Ε.癌胚抗原(CEA)基因启动子癌胚抗原基因(CEA)在结直肠癌细胞中重新激活，而在正常组织中不表达或表达 很低。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出CEA启动子(序列五)，将其克 隆到质粒pEGFP-Ι中，得到pCEA-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果显示，在CEA阳性的直 肠癌细胞Lovo和SW620中观察到有高水平的GFP报告基因表达，而在正常细胞和无CEA表 达的肿瘤细胞(如ChangLiver和Hela细胞)中均没有GFP表达。F.热休克蛋白(HSP)基因启动子热休克蛋白(HSP)由至少5个不同分子质量和生物功能各异的分子伴侣组成，其 诱导表达是细胞中转录因子——热休克因子l(heat shock factor 1，HSF1)与HSP基因5， 端启动子区的热休克元件(heat shock element, HSE)相互作用的结果。现有技术公开了 在几乎所有HSP基因5’端的启动子区，都含有HSE。在正常状态下，HSFl以无活性的单体 形式存在于细胞浆中，并与某些HSP结合在一起。在各种应激原作用下，胞浆中的变性蛋白 质增多，HSP与受损伤蛋白质结合后释放出HSFl单体，HSFl单体再聚合成具有转录活性的 的三聚体迅速和各种HSP的启动子区HSE结合并激活转录，HSP启动子活性在热休克(41 45°C)后显著增强。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增出HSP启动子(序 列六)，将其克隆到质粒pEGFP-Ι中，得到pHSP-EGFP。将所得质粒导入细胞中，结果显示， 上述启动子在加热的肿瘤细胞中被选择性激活，而在正常情况下它的活性很低。G. MUC-I基因启动子MUC-I基因是在乳腺癌和其他几种癌症如卵巢癌，结肠癌或胃癌中激活的一种基 因。本发明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离MUC-I基因启动子(序列七)， 将其顺序插入质粒pEGFP-Ι中，得到pMUCl-EGFP。细胞转染实验证明，GFP仅在MUCl基因 高水平表达的肿瘤细胞中特异性表达，而在没有MUCl基因表达的细胞中则基本不表达。F. c-ertB2 启动子erbB2通常只在胎盘、胚胎上皮组织表达，成年以后正常组织中为阴性或微量表 达。然而在多种人类肿瘤中却过度表达，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、原发性肾细胞癌等。本发 明通过PCR技术，以人类细胞DNA为模板，扩增分离erbB2基因启动子(序列八)，将其顺序 插入质粒pEGFP-Ι中，得到perbB2-EGFP。细胞转染实验证明，GFP仅在erbB2基因高水平 表达的肿瘤细胞(如乳腺癌细胞株SKBR-3)中特异性表达，而在没有erbB2基因表达的细 胞中则基本不表达。实施例2构建携带肿瘤特异性启动子调控腺病毒复制必需元件ElA基因的真核表达载体。将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子(TSP)通过遗传工程的方法嵌入真核 表达载体，用其控制腺病毒复制必需的早期基因ElA的表达。所述质粒的特点是其携带的 腺病毒复制必需元件ElA基因被肿瘤组织特异性的启动子所调控。下本发明采用的真核表达载体结构示意为Plasmid-TSP-ElA，其中，Plasmid为任何一个真核表达质粒(比如 pcDNA3. 1) ；TSP为实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子及其它未提及的肿瘤特异性启动子。实施例3构建携带肿瘤特异性启动子调控腺病毒复制必需元件ElA基因的腺相关病毒 (rAAV)载体。将实施例1中所分离出的肿瘤特异性启动子(TSP)通过遗传工程的方法嵌入腺相 关病毒的穿梭质粒中，用其控制腺病毒复制必需的早期基因ElA的表达。所述质粒和病毒 的特点是其携带的腺病毒复制必需元件ElA基因被肿瘤组织特异性的启动子所调控。本发 明采用的腺相关病毒的穿梭质粒结构示意为pSNAV-TSP-ElA，其中，pSNAV为包装不同血清 型AAV通用的穿梭质粒，可用于包装任一血清型的腺相关病毒；TSP为实施例1中所分离出 的肿瘤特异性启动子及其它未提及的肿瘤特异性启动子。实施例4包装、扩增、纯化rAAV，并进行功能鉴定按本领域常规方法包装下述AAV，纯化病毒，感染肿瘤细胞并进行功能鉴定。①·包装纯化AAV-TERTp-ElA②·包装纯化AAV-E2Fp_ElA③.包装纯化AAV-AFPp-E IA④.包装纯化AAV-CEAp-E IA⑤.包装纯化AAV-HSP70p_ElA⑥·包装纯化AAV-HRPp-E IA⑦·包装纯化AAV-MUClp-ElA⑧.包装纯化AAV-erbB2p_ElA1). AAV-TERTp-ElA感染下述肿瘤细胞，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结 肠癌、肺癌等细胞，经Western检测证明ElA蛋白表达；而在成纤维细胞中则未检测到ElA 蛋白表达。2).AAV-E2Fp_ElA感染所有检验过的肿瘤细胞，经Western检测证明ElA蛋白表 达；而在成纤维细胞中则未检测到ElA蛋白表达。3). AAV-AFPp-EIA感染人类肝癌细胞，包括!fepG2、H印3B等，经Western检测证明 ElA蛋白表达；而在其他肿瘤细胞中则未检测到ElA蛋白表达。4). AAV-CEAp-ElA感染人类结肠癌细胞，经Western检测证明ElA蛋白表达；而在 其他肿瘤细胞中则未检测到ElA蛋白表达。5). AAV-HSP70p-ElA感染各种肿瘤细胞，在正常生长情况下ElA蛋白几乎不表达， 而在加热情况下ElA蛋白表达量迅速增加。6). AAV-HRPp-EIA感染各种肿瘤细胞，在正常生长情况下ElA蛋白表达很低，而在 缺氧的情况下ElA蛋白表达量迅速增加。7).AAV-MUC1p-E1A感染有MUCl基因表达的乳腺癌细胞，如MCF-7，检测证明ElA 蛋白表达；感染没有MUCl基因表达的乳腺癌细胞，如MDA-MB-231细胞，则未检测到ElA蛋
白表达。
8).AAV-erbB2p-ElA感染有erbB2基因表达的乳腺癌细胞，如SKBR-3，检测证明 ElA蛋白表达；感染没有MUCl基因表达的乳腺癌细胞，则未检测到ElA蛋白表达。实施例5构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体按本领域常规方法构建下述携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体， 包装、扩增、纯化病毒，并进行功能鉴定。①.携带报告基因EGFP编码基因=Ad-CMV-EGFP②.携带具有刺激机体免疫能力的IL2编码基因Ad-CMV_IL2③.携带具有刺激机体免疫能力的GM-CSF编码基因Ad-CMV-GM-CSF④.携带肿瘤坏死因子TNF α编码基因Ad-CMV-TNF α采用人胚肾293细胞对上述构建病毒进行包装，经过噬菌斑 (plaquepurification)筛选后再进行扩增，采用氯化铯密度梯度离心及透析纯化病毒。纯 化的病毒滴度均可达3-5 X liTpfu/ml。将上述病毒感染肿瘤细胞测定报告基因EGFP及治疗基因的表达。结果证明，荧光 显微镜下观察上述Ad-CMV-EGFP感染的肿瘤细胞，表达绿色荧光蛋白；ELISA检测治疗基因 的表达水平，IL2，GM-CSF和TNF α的表达量都较高。实施例6由质粒反式提供腺病毒复制所必需的ElA的功能，复制缺陷型腺病毒在活体肿瘤 内原位增殖、复制将纯化后的质粒pcDNA3. I-TERTp-EIA和非复制型病毒Ad-CMV-EGFP先后注射到 人非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，由pcDNA3. l_TERTp_ElA在肿瘤原位反式提 供腺病毒复制所必需的ElA的功能，然后对肿瘤原位复制缺陷型腺病毒Ad-CMV-EGFP的增 殖、复制进行检测。将3X106NCI_H460细胞接种到裸鼠皮下，7_10天后肿瘤生长至5_10毫米 直径大小。此时将20ug的pcDNA3. I-TERTp-E IA通过高频电击导入肿瘤内，24h后将 2 X IO8Ad-CMV-EGFP注射到肿瘤内，病毒注射后72h取肿瘤，将肿瘤勻浆进行腺病毒滴度测 定。结果表明，pcDNA3. Ι-TERTp-ElA联合Ad-CMV-EGFP组腺病毒滴度明显高于单独注射 Ad-CMV-EGFP组(未进入细胞的病毒背景量)。实施例7由AAV反式提供腺病毒复制所必需的ElA的功能，复制缺陷型腺病毒在活体肿瘤 内原位增殖、复制将纯化后的AAV-TERTp-ElA和非复制型病毒Ad-CMV-EGFP同时或先后注射到人非 小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，由AAV-TERTp-ElA在肿瘤原位提供腺病毒复制所 必需的ElA的功能，然后对肿瘤原位复制缺陷型腺病毒Ad-CMV-EGFP的增殖、复制进行检 测。将3X106NCI_H460细胞接种到裸鼠皮下，7_10天后肿瘤生长至5_10毫米直径大 小。此时，将2 X 101QAAV-TERTp-E IA和2 X IO8Ad-CMV-EGFP同时或先后注射到肿瘤内，72h 取肿瘤，将肿瘤勻浆后进行腺病毒滴度测定。结果表明，AAV-TERTp-EIA联合Ad-CMV-EGFP 组腺病毒滴度明显高于单独注射Ad-CMV-EGFP组(未进入细胞的病毒背景量)；两病毒先
11后注射(先给AAV-TERTp-ElA，48h后再给Ad-CMV-EGFP)组腺病毒滴度比两病毒同时注射
组更高。实施例8由质粒反式提供腺病毒复制所必需的ElA的功能，活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒 原位复制对肿瘤生长的抑制将纯化后的质粒pcDNA3. l_TERTp_ElA和非复制型病毒Ad-CMV_IL2先后注射到人 非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，由pcDNA3. Ι-TERTp-ElA在肿瘤原位反式提供 腺病毒复制所必需的ElA的功能，然后对肿瘤的生长进行跟踪。由于在肿瘤局部反式提供 了 ElA功能，复制缺陷型腺病毒可在肿瘤局部增殖并产生成熟的腺病毒颗粒，产生溶瘤作 用；同时与ElA基因的抑癌作用以及我们前期发现的ElA提高腺病毒携带治疗基因表达水 平的作用相协同，势必会大大提高基因治疗的效果。就安全性而言，即使病毒外漏，也仅为 复制缺陷型腺病毒。将3X 106NCI_H460细胞接种到裸鼠皮下，7-10天后肿瘤生长至5_10毫米 直径大小。此时将20ug的pcDNA3. I-TERTp-E IA通过高频电击导入肿瘤内，24h后将 2X108Ad-CMV-IL2注射到肿瘤内，对照组注射2X IO8Adnull,每2_3天测量肿瘤大小一次， 跟踪观察肿瘤生长情况。结果表明，Ad-CMV-IL2、pcDNA3.I-TERTp-EIA 单独应用以及 pcDNA3. I-TERTp-EIA 和Adnull联合应用本身就具有一定抑制肿瘤生长的能力；当pcDNA3. l_TERTp_ElA和携带 了治疗基因IL2的腺病毒联合应用时，所取得的抗癌效果明显增强，将近一半的肿瘤在观 察末期仍然处于消失状态。显示了携带治疗基因的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制在肿瘤 治疗中的优越性。这种方案的单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提 高肿瘤治疗效果并减少副作用。实施例9由AAV反式提供腺病毒复制所必需的ElA的功能，活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒 原位复制对肿瘤生长的抑制。将纯化后的AAV-TERTp-ElA和非复制型病毒Ad-CMV_IL2同时或先后注射到人非 小细胞肺癌NCI-H460裸鼠皮下移植瘤内，然后对肿瘤的生长进行跟踪。由于rAAV可以介导 ElA基因长时间表达，所以一方面复制缺陷型可在肿瘤局部不断地增殖，同时其携带的治疗 基因维持高表达水平；另一方面腺病毒反过来又会提高rAAV携带的ElA基因的表达，二者 形成正反馈。这势必会将上述三种作用(病毒溶瘤作用、ElA抑癌作用、治疗基因的作用) 的协同作用进一步放大，基因治疗效果进一步提高。就安全性而言，即使病毒外漏，也仍为 复制缺陷型腺病毒。将3X 106NCI_H460细胞接种到裸鼠皮下，7_10天后肿瘤生长至5_10毫米直径大 小。此时,将 2 X 1010AAV-TERTp-ElA 和 2 X 108Ad-CMV_IL2 以及对照 2 X 1010AAV-TERTp-ElA 和2 X IO8Adnull同时或先后注射到肿瘤内，每2_3天测量肿瘤大小一次，跟踪观察肿瘤生 长情况。结果表明，Ad-CMV-IL2、AAV-TERTp-ElA单独应用以及 AAV_TERTp_ElA 和 Adnul 1 联 合应用本身就具有一定抑制肿瘤生长的能力；当AAV-TERTp-ElA和携带了治疗基因IL2的 腺病毒联合应用时，所取得的抗癌效果明显增强，超过一半的肿瘤在观察末期仍然处于消失状态。显示了携带治疗基因的复制缺陷型腺病毒肿瘤原位复制在肿瘤治疗中的优越性。 这种方案的单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，能够显著地提高肿瘤治疗效果并 减少副作用。本发明所涉及的启动子序列及质粒做如下说明序列一GenBank :AF097365Homo sapiens telomerase reverse transcriptase (TERT) gene, promoter and partialcds.序列二GenBank :U47675Human transcription factor E2F1(E2F1)gene, promoter and exon 1.序列三GenBank :AH006957Homo sapiens hypoxia-inducible factor 1 alpha subunit(HIFlA) gene, completecds序列四GenBank :L34019Homo sapiens(clone Ch-HAF3)alpha-fetoprotein(AFP)gene, promoter region序列五GenBank :Z21818H. sapiens carcinoembryonic antigen gene序列六GenBank :X13229Human hsp70B gene 5， -region序列七GenBank :M35093Homo sapiens tumor mucin antigen (MUCl) gene, complete cds.序列八GenBank :M16892Human c-erbB-2proto-oncogene. promoter region质粒1. M pcDNA3. 1 为 Invitrogen life technologies f nnn, Catalog nos. V790-20,2.质粒 pEGFP-Nl 为 CL0NTECH L aboratories, Inc.产品，GenBank Accession#U557623.质粒pSNAV为北京本元正阳基因技术有限公司产品。
权利要求
一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是腺病毒复制必需的早期基因的启动子，被肿瘤细胞或肿瘤组织特异性的启动子所取代，由真核表达质粒或重组腺相关病毒载体携带，在肿瘤局部反式提供，使复制缺陷型腺病毒特在肿瘤细胞中复制，在正常细胞或组织中不复制，包括下述步骤1)通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤或组织特异性启动子；2)构建携带肿瘤或组织特异性启动子调控腺病毒复制必需元件E1A基因的真核表达载体和复制缺陷型腺病载体；3)包装、扩增、纯化重组腺相关病毒(rAAV)，并进行测序及功能鉴定；4)构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的复制缺陷型腺病毒载体；5)包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；6)活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位增殖、复制；7)活体肿瘤内复制缺陷型腺病毒原位复制对肿瘤生长的抑制。
2.根据权利要求1所述的使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是所述的腺 病毒复制必需基因是腺病毒早期基因E1A，ElAElB或ElAElB19k。
3.根据权利要求1所述的使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是所述的肿 瘤细胞或肿瘤组织特异性的启动子选自肿瘤细胞或微环境特异性的启动子或肿瘤组织特 异性启动子。
4.根据权利要求3所述的使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是所述的肿 瘤细胞或微环境特异性的启动子选自低氧诱导性基因的启动子，E2F1基因启动子，Midikin 基因启动子，端粒酶基因启动子或热休克蛋白基因启动子。
5.根据权利要求3所述的使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是所述的肿 瘤组织特异性启动子选自前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUCl基因启动子，肺细胞表 面蛋白基因启动子，α-甲胎蛋白基因启动子，erbB2基因启动子，甲状腺球蛋白基因启动 子，Tyrosinase基因的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子或癌胚 抗原蛋白基因启动子。
6.根据权利要求1所述的使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是所述的重 组腺相关病毒载体为血清型重组腺相关病毒载体。
7.根据权利要求1所述的使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法，其特征是所述腺病 毒DNA的El或E3区域嵌入抗癌基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是所述抗癌基因选自细胞凋亡诱导基因，抗新 生血管形成基因，自杀基因，细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子或放射线增敏基 因及其反义基因或干扰RNA片段。
9.权利要求1的方法在制备使复制缺陷型腺病毒在肿瘤原位选择性复制的药物中的 用途。
10.根据权利要求9的用途，其中所述的肿瘤是人类原位或转移肿瘤。
11.权利要求1的方法在用于肿瘤治疗中的用途。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述的肿瘤治疗是将真核表达质粒导入肿瘤局 部的方法，选自与脂质体混合注入、与超声微泡共孵育超声导入或电击导入。
全文摘要
本发明属生物医学领域，涉及一种使复制缺陷型腺病毒选择性复制的方法和用途。本发明所述复制缺陷型腺病毒，其复制必需元件E1A基因受肿瘤细胞或肿瘤组织特异性启动子调控，由真核表达质粒或重组腺相关病毒载体携带，在肿瘤局部反式提供。腺病毒能够通过本身的溶瘤作用、携带的治疗基因的作用以及E1A的抑癌作用三种作用协同有效杀伤肿瘤细胞而对正常的组织或细胞基本无害。本发明可以方便、快捷地在肿瘤局部赋予任何一个用于肿瘤基因治疗的复制缺陷型腺病毒以选择性增殖、复制能力。能单独使用或与现有的肿瘤治疗方法结合使用，显著提高肿瘤治疗效果并减少副作用。
文档编号A61K48/00GK101880688SQ200910050700
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者王慧萍, 韦芳 申请人:上海市第一人民医院