专利名称：抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于口蹄疫防治技术领域，特别涉及一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及制备与应用。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouthdisease virus, FMDV)引起偶蹄类动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病感染率高，感染后发病率最高可达100%，易感动物多达70余种，其中重要的经济畜种如猪、牛、羊等均易感。鉴于FMD不仅降低动物生产性能，造成巨大的直接经济损失， 而且还影响动物及动物产品的国际贸易，因此所造成的间接损失更大，同时还会影响一个国家的国际形象，故素有“政治经济病”之称。各国学者对FMDV进行了广泛而又深入的研究。FMDV属小RNA病毒科 (Picornaviridae) 口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员。该病毒有7个血清型,分别为A型、 O型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型间无血清交叉反应和交叉免疫现象。各血清型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，其亚型间抗原也有很大的差
巳目前，FMD是严重威胁畜牧业发展的重要传染病，发达国家主要采取扑杀为主的防控措施，发展中国家主要采取疫苗接种和扑杀相结合的方法。但是疫苗接种后需要至少七天的时间才能产生保护作用，同时由于FMDV血清型多，各血清型之间几乎没有交叉保护性，所以现在应用的单血清型疫苗难以达到对不同血清型和亚型的变异毒株产生保护作用。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)现象的发现为疾病防控开启了希望之门。RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由功能性双链 RNA (double-strandedRNA, dsRNA)引发的序列特异性转录后同源靶基因沉默现象，是近几年迅速发展起来的一项用于抑制病毒复制的新技术。科研人员将RNAi技术应用于多种病毒性疾病的治疗研究，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技术也为抗FMDV 感染方面的研究提供了新的思路。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒。本发明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，为腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VPl线性化后，经过包装细胞包装得到；
所述的腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VPl的载体为pAdeno_X，重组基因片段为四个串联的、能分别独立转录的基因片段；所述的四个串联的、能分别独立转录的片段为U6启动子与SiRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与SiRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA_2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与SiRNA-VPl的转录模板融合基因片段；所述的重组基因片段优选为U6启动子与siRNA_3D的转录模板融合基因片段、U6 启动子与SiRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与SiRNA-VPl的转录模板融合基因片段依次串联得到；siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)GTTGATCTCCGTGGCAGGAttcaagaga atcctgccacggagatcaac反义链为(5，-3，)GTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa TCCTGCCACGGAGATCAACSiRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)ACACCGGAATCGGCACCGC
ttcaagaga GCGGTGCCGATTCCGGTGT反义链为(5，-3，)ACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa GCGGTGCCGATTCCGGTGTsiRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)CCAGATGCAGGAAGACATG ttcaagaga CATGTCTTCCTGCATCTGG C；反义链为(5，-3，)GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaa CATGTCTTCCTGCATCTGG ；siRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)GAGTCTGCGGACCCCGTGACT ttcaagaga AGTCACGGGGTCCGCAGACTC C 反义链为(5，-3，)GGAGTCTGCGGACCCCGTGACT tctcttgaa AGTCACGGGGTCCGCAGACTC ；以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补，以以上序列为模板， 转录得到的siRNA为具有loop结构的dsRNA ；所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，优选包含以下步骤(I)将如下所示的siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA_2B的转录模板和siRNA-VPl的转录模板分别克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒 pShuttle_3D、pShuttle-L、pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl ；siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)
6
(mmTTGATCTCCGTGGCAGGA^rn^TCCTGCCACGGAGATCAA rcmTmoM}反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa TCCTGCCAC GGAGATCAAC CGSiRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)omACACCGGAATCGGCACCGC^mGCGGTGCCGATTCCGGTGTCTTTTTTTCTAGAG反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa GCGGTGC CGATTCCGGTGT CGsiRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)(MD3GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttoTO^GrC^CGGGGrCCGC^ GArTrmmnm-.反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACT tctcttgaaAGTCAC GGGGTCCGCAGACTC CGsiRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)OWCCAGATGCAGGAAGACATGt^mmCATGTCTTCCTGCATCTGG cmjmmm·.反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATG tctcttgaaCATGTCTT CCTGCATCTGG CG正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的 5’端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；(2)以重组质粒 pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle_2B和 pShuttle-VPl 为模板， 通过PCR分别得到U6启动子+3D融合片段、U6启动子+L融合片段、U6启动子+2B融合片段、U6启动子+VPl融合片段，再将这四个融合片段分别克隆入克隆载体上，得到串联结构、 能分别独立转录的重组质粒PUC-3D-L-2B-VP1 ；(3)通过体外连接法将PI-Sce I/1-Ceu I双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B_VPl得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒 pAdeno-3D-L-2B-VPl ；(4)重组质粒pAdeno-3D-L-2B_VPl线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒 rAdeno-3D-L-2B_VPl ；步骤(I)中所述的克隆的具体步骤优选为首先通过BamHI和EcoRI双酶切pSIREN-shuttle穿梭载体；其次将上述的转录模板分别进行处理，将正义链和反义链按摩尔比I : I混合，变性处理，接着自然降温，得到有突出末端的双链；接着将有突出末端的双链与双酶切后的PSIREN-shuttle穿梭载体连接，再转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到目的重组质粒；步骤⑵中所述的克隆载体优选为pUC57载体；步骤⑷中所述的线性化优选为通过PacI酶切线性化；步骤(4)中所述的包装细胞优选为人胚肾细胞株HEK293。一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，由上述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒制备得到。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果本发明提供的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，能有效抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。通过实验证实，重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VPl的防治效果优于重组腺病毒rAdeno-2B-VPl应用的效果。
图I是筛选重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B_VPl进行的质粒PCR鉴定电泳图；其中，泳道I 8为被筛选的质粒；泳道9为阴性对照；泳道M为DNAMarker DL2000。图2是重组腺病毒质粒pAdeno-3D-L-2B_VPl的PacI酶切鉴定电泳图；其中，泳道 M为DNA Marker DL15000 ;泳道N为DNA Marker DL2000 ;泳道I和泳道2为重组腺病毒质粒 pAdeno-3D-L-2B-VPl PacI 酶切产物。图3是不同时间点上清中FMDV滴度的测定图。图4是预防和治疗方式结合下不同重组腺病毒对感染FMDV豚鼠的保护率。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例I本发明是以不同年代和地区分离的O型FMDV为基础，选择FMDV 3D、L、2B、VPl 基因高度保守序列设计合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭载体，构建重组质粒 pShuttle-3D、pShuttle-L、pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl,具体过程如下(以下构建过程连接反应按照T4 DNA连接酶说明书操作，阳性克隆筛选按照分子克隆实验指南操作，其中所用的感受态细胞为大肠杆菌DH5a (宝生物工程公司)(I)将siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA_2B的转录模板和 siRNA-VPl的转录模板分别用去离子水稀释成相同的浓度(5pmol/yL)，分别把互补的两段寡核苷酸(各5yL混合)混匀后放在PCR扩增仪上，95°C2min，然后自然降到常温进行处理。将处理后形成的双链siRNA寡核苷酸片段分别与经BamHI和EcoRI双酶切处理后的 pSIREN-Shuttle (Clontech 公司)连接，得到 pShuttle_3D (siRNA_3D 的转录模板位于 U6 启动子下游)>pShuttle-L (siRNA-L的转录模板位于U6启动子下游)、pShuttle_2B (siRNA_2B 的转录模板位于U6启动子下游)和pShuttle-VPl (siRNA-VPl的转录模板位于U6启动子下游)。siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)wm^TTGXTCTCCGTGGCAGGA^m^TCCTGCCACGGAGATCAA rcmTmoM}反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa TCCTGCCAC GGAGATCAAC CG。SiRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)omACACCGGAATCGGCACCGOimmGCGGTGCCGATTCCGGTGT mmimG·.反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCt ct cttgaa GCGGTGC CGATTCCGGTGT CG。siRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)(ffiEGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttoro^GrC^CGGGGrCCGC^ GArTrmmnm-.反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACT tctcttgaaAGTCAC GGGGTCCGCAGACTC CG。siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为(5，-3，)(mGCCAGATGCAGGAAGACATG^mwCATGTCTTCCTGCATCTGG ammjMi·.反义链为(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATG tctcttgaaCATGTCTT CCTGCATCTGG CG。(2)①设计引物P3D-F/P3D_K，以pShuttle-3D为模板，用PCR方法扩增U6启动子与 siRNA-3D融合片段(理论扩增片段长为420bp)、融合片段连入pUC57 (宝生物工程公司，按照说明书操作)的EcoRV位点，得到pUC57-3D。引物序列如下(5’ -3’)P3D_F gactaggtaccACCTGACGTAACTATAACGGTCCTAAGG ；P3D_E gtgtaCTGCAGTTCCTCGAGCTCCGCACCCGACATAGATGAATTCo反应程序94°C5min,94°C 45s，54°C 30s,72°C lmin，30 个循环；最后 72°C 延伸 IOmin0②设计引物PhAVk，引物序列如下PL_F gacatctcgaggggcaggaagagggcctatttccPL_E GTGATCTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTCCGCAC
以pShuttle-L为模板，用PCR方法扩增U6启动子与siRNA-L融合片段(理论扩 增片段长为390bp)、融合片段连入pUC57-3D的Xhol/PstI位点，构建重组质粒pUC_3D_L。反应程序94°C5min，94°C 45s，52°C 45s, 72 °C lmin，30 个循环；最后 72°C 延伸 IOmin0③分别设计2对引物Pvp1_f/Pvp1_k与P2B-F/P2B-K，模板分别为PShuttle-VPl和 pShuttle-2B,用PCR方法分别扩增U6启动子与siRNA_VPl融合片段(理论扩增片段长 为329bp)、U6启动子与siRNA-2B融合片段(理论扩增片段长为325bp)，引物序列如下 (5， -3，)Pm_F CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA ；PVP1_K AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC ；P2B_F ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG ；P2B_E :AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。PCR体系按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用说明进行，反应程序94°C 5min， 94°C 30s, 60°C 15s，72。。45s, 30 个循环，最后 72°C延伸 3min。将U6启动子与SiRNA-VPl融合片段、U6启动子与siRNA_2B融合片段分别克隆入 pMD19-T simple载体(宝生物工程公司，按照说明书操作)中，得到的连接产物转化感受 态细胞大肠杆菌DH5ci (宝生物工程公司)后，筛选得到质粒Tvpi和质粒T2B。用限制性内切 酶Pst I、Xho I进行双酶切质粒Tvpi，回收和纯化大小约为350bp的片段，用限制性内切酶 Pst I、Xho I进行双酶切质粒T2b，回收载体。酶切体系如下表所示
权利要求
1.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，其特征在于为腺病毒重组质粒 pAdeno-3D-L-2B-VPl线性化后，经过包装细胞包装得到；所述的腺病毒重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VPl的载体为pAdeno-X，重组基因片段为四个串联的、能分别独立转录的基因片段；所述的四个串联的、能分别独立转录的片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与SiRNA-L的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA_2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与SiRNA-VPl的转录模板融合基因片段； siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为5，- GTTGATCTCCGTGGCAGGAttcaagaga ATCCTGCCACGGAGATCAAC-3，反义链为5’ -GTTGATCTCCGTGGCAGGAT tctcttgaa TCCTGCCACGGAGATCAAC _3’ SiRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为5’ ACACCGGAATCGGCACCGC ttcaagagaGCGGTGCCGATTCCGGTGT-3’反义链为5’ -ACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa GCGGTGCCGATTCCGGTGT _3’ siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为5J CCAGATGCAGGAAGACATG ttcaagaga CATGTCTTCCTGCATCTGG C-3，；反义链为5’ -GCCAGATGCAGGAAGACATG tctcttgaa CATGTCTTCCTGCATCTGG-3 ；SiRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为5’ GAGTCTGCGGACCCCGTGACT ttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC-3’ ； 反义链为5，-GGAGTCTGCGGACCCCGTGACT tctcttgaa AGTCACGGGGTCCGCAGACTC-3 ；以上序列的小写部分为茎环结构，粗体部分和斜体部分互补。
2.根据权利要求I所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒，其特征在于所述的重组基因片段为U6启动子与siRNA-3D的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA_L 的转录模板融合基因片段、U6启动子与siRNA-2B的转录模板融合基因片段和U6启动子与 SiRNA-VPl的转录模板融合基因片段依次串联得到。
3.权利要求I或2所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于包含以下步骤(I)将如下所示的siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA_2B的转录模板和SiRNA-VPl的转录模板分别克隆入pSIREN-shuttle穿梭载体，位于U6启动子的下游，得到重组质粒 pShuttle_3D、pShuttle-L、pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl ； siRNA-3D的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为^^KMLGTTGXTCTCCGTGGCAGGAtta^ATCCTGCCACGGAGATCA A CCmTTTTCTAGAG-3，反义链为5’ -AATTCTCTAGAAAAAAGTTGATCTCCGTGGCAGGATtctcttgaa TCCTGCCA CGGAGATCAAC CG 3，SiRNA-L的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为S^TOGACACCGGAATCGGCACCGCttcaiw GCGGrGCCG^rrCCGGr GTQminiPrAGAG-3，反义链为5’ -AATTCTCTAGAAAAAAAGACACCGGAATCGGCACCGCtctcttgaa GCGGTG CCGATTCCGGTGT CG 3，SiRNA-VPl的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为S^TOOSGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaiWylGrC^CGGGGrCCGC AG AC TC αΤΠΤΠ ΓΑ·3，；反义链为5’ -AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACT tctcttgaaAGTC ACGGGGTCCGCAGACTC CG 3，siRNA-2B的转录模板的核苷酸序列如下所示正义链为^^KmiCCAGATGCAGGAAGACATGttcaam^CATGTCTTCCTGCATCTG r7CmTTTTCTAGAG-3，；反义链为5’ -AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATG tctcttgaaCATGTC TTCCTGCATCTGG CG 3 ^ ；正义链寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位点粘性末端，反义链寡核苷酸的5’ 端突出部分是EcoRI酶切位点粘性末端，加粗部分为siRNA正义链，斜体部分为siRNA的反向互补链，小写字体为loop环序列，下划线部分为7个连续T终止信号及其互补序列；(2)以重组质粒pShuttle_3D、pShuttle-L、pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl 为模板，通过PCR分别得到U6启动子+3D融合片段、U6启动子+L融合片段、U6启动子+2B融合片段、 U6启动子+VPl融合片段，再将这四个融合片段分别克隆入克隆载体上，得到串联结构、能分别独立转录的重组质粒PUC-3D-L-2B-VP1 ；(3)通过体外连接法将PI-SceI/1-Ceu I双酶切重组质粒pUC-3D-L-2B_VPl得到的目的片段与人复制缺陷型5型腺病毒质粒载体pAdeno-X载体骨架连接，得到重组质粒 pAdeno-3D-L-2B-VPl ；(4)重组质粒pAdeno-3D-L-2B-VPl线性化后，通过包装细胞包装，得到重组腺病毒 rAdeno-3D-L-2B-VPlο
4.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的克隆的具体步骤为首先通过BamHI和EcoRI双酶切pSIREN-shuttle 穿梭载体；其次将权利要求2中所述的转录模板分别进行处理，将正义链和反义链按摩尔比I : I混合，变性处理，接着自然降温，得到有突出末端的双链；接着将有突出末端的双链与双酶切后的PSIREN-shuttle穿梭载体连接，再转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到目的重组质粒。
5.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的制备方法，其特征在于步骤⑵所述的克隆载体为PUC57载体。
6.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的应用，其特征在于步骤(4)中所述的线性化为通过PacI酶切线性化。
7.根据权利要求3所述的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒的应用，其特征在于步骤(4)中所述的包装细胞为人胚肾细胞株HEK293。
8.一种抗口蹄疫病毒复制与感染的生物制剂，其特征在于由权利要求I或2所述的的抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒质粒制备得到。
全文摘要
本发明公开一种抗口蹄疫病毒复制与感染的重组腺病毒及其制备与应用。本发明通过将siRNA-3D的转录模板、siRNA-L的转录模板、siRNA-2B的转录模板与siRNA-VP1的转录模板分别与U6启动子连接，克隆入载体pAdeno-X，得到能分别转录、串联结构的质粒，再将该质粒线性化后通过包装细胞包装，得到重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1。该重组腺病毒rAdeno-3D-L-2B-VP1的防治效果优于重组腺病毒rAdeno-2B-VP1应用的效果。可见，本发明提供的重组质粒能有效抑制口蹄疫病毒复制和抗口蹄疫病感染。
文档编号C12N15/861GK102586198SQ201210016518
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月17日 优先权日2012年1月6日
发明者代曼曼, 刘文俊, 徐艳芳, 李银光, 赵明秋, 陈金顶 申请人:华南农业大学