专利名称：一种新的基于腺病毒复制重组的肿瘤靶向基因治疗系统的制作方法
技术领域：
本发明与基因治疗领域相关，具体地讲，本发明涉及一套高效低毒的基因
转移载体；其是具有特定结构的重组和/或经修饰的腺病毒载体。作为靶向目的 细胞的基因转移的载体，并利用其在宿主细胞中的复制重组产生子代腺病毒， 表达所携带外源基因，达到基因治疗，特别是各种癌症的基因治疗的目的。
背景技术：
目前作为基因治疗的常见载体有逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺相关病 毒载体，其中作为肿瘤基因治疗较为常用的是腺病毒载体。
腺病毒是一种双链DNA病毒，其基因长度约为36kb，分为早期转录区和晚 期转录区，目前的研究发现，人腺病毒有47个血清型，分属A-F6个亚属，其 中C亚属的5型腺病毒是目前人们研究最为详细的一种。
将腺病毒删除El区和E3区所得到的腺病毒载体常被称为第一代腺病毒载 体，这种载体可以插入并表达长度约为8kb以内的外源基因，这种腺病毒载体 本身不能复制产生子代病毒，腺病毒载体DNA也不整合进入宿主基因组中。
对于恶性肿瘤的基因治疗，要求病毒载体可以高效靶向地进入肿瘤细胞， 表达治疗基因或靶向性地在肿瘤细胞内复制，进而杀死肿瘤细胞。腺病毒载体 能感染多种肿瘤细胞，包括静止期细胞，腺病毒载体可以较为容易的大规模培 养并获得高滴度的病毒纯品。这些特点使得腺病毒作为常用的肿瘤基因治疗载 体。腺病毒作为肿瘤基因治疗的载体，提高其对肿瘤细胞的感染效率和耙向性 是十分必要的。目前主要通过转导水平调控、转录水平调控、翻译水平调控等 途径来进行。
基于转导水平调控的肿瘤靶向腺病毒载体。多数肿瘤细胞表面腺病毒受体 (CAR)表达不足(Jee. YS， et. al. Anticancer Res. 2002， 22:2629-34)，因而 降低了 2型或5型腺病毒载体的转导效率。为了提高转导效率而改变腺病毒外 壳蛋白的结构(如鞭毛修饰型AdF35载体(ShayakhmetovDM. et. al. J. Virol. 2000, 74: 2567-83))，使得腺病毒通过结合肿瘤细胞表面高表达的受体，如CD46 膜蛋白(Gaggar A. et. al. Nat. Med. 2003,9:1408-12)进入细胞，改善其转导效率。
基于转录水平的调控主要应用外源的肿瘤特异性启动子重组腺病毒肿瘤靶
向复制表达(YeX. et. al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 2003， 307: 759—64)， 然而该方法虽然有较高的耙向性，但表达水平偏低，并且特异性启动子仅能应 用于一种肿瘤，随着其分化外源基因的表达水平会降低或消失。
通过成熟mRNA翻译水平的调控获得靶向性基因表达，对外源插入基因进行 适当的改造，使得其转录产生的mRNA的5'非编码区或3'非编码区增加一段 调节结构，通过基因翻译水平调节将会获得一种针对多种肿瘤细胞的靶向表达 系统。
复制溶瘤型靶向腺病毒载体，其部分病毒基因被完全或部分删除货部分突 变，现有产品应用。
腺病毒载体早期基因编码蛋白E1A(E1A-12S和Ela-13)和E1B (E1B — 55K 和E1B —19K)通过激活病毒基因表达和解除调控细胞周期来介导病毒复制。因 此用于基因治疗的第一代腺病毒载体(E1A区蛋白表达缺陷型腺病毒)被认为不 能在细胞中进行复制(Jones，N. et. al. PNAS. 1979， 76: 3665-9)。然而大量 研究表明，第一代腺病毒感染的肿瘤细胞中有病毒早晚期蛋白的表达 (Steinwaerder， DS. et. al. Hum. Gene. Ther. 2000， 11:1933—48; Jane SM. et. al. AnrMMed. 1998, 30: 413—5; Lieber ， A. et. al. J. Virol. 1996,70: 8944-60)，而正常肝脏细胞中没有检测导病毒DNA的复制和早晚期蛋白的表达 (Nelson JE. Et. al. J. Virol. 1997， 71: 8902-7)。某些肿瘤细胞蛋白可能 代替E1区蛋白的功能，激活了病毒的复制(Jones，N. et. al. PNAS. 1979， 76: 3665_9 ; Stei腿erder， DS. et. al. Hum. Gene. Ther. 2000， 11:1933-48; Jane SM. et. al. Ann. Med. 1998， 30: 413-5)。腺病毒DNA的复制导致基因重组， 基因重组程度和复制频率成比例，直到感染周期的晚期，腺病毒的基因组都能 进行重组(Young CS. Et. al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1995， 199: 89-108)。
基于上述讨论，目前需要改进腺病毒使其能够高效的靶向一系列的细胞和 组织，同时保持能够高效、稳定的表达外源基因，并为提高基因治疗的安全性， 须使腺病毒载体在宿主中有最小的抗原性，特异性的在宿主细胞中表达外源基 因。
4我们曾申请了一种复制重组腺病毒系统，构建了具有位于外援基因两侧的 反向重复序列的重组腺病毒，改重组腺病毒载体在具有复制活性的宿主细胞内 泾复制重组激活所携带外援基因的表达，达到在宿主细胞中靶向表达的目的
(Stei腿erder DS. et. al. Nat Med. 2001， 7:240-3; Bernt K. et. al. J.Virol. 2002， 76: 10994-1002; Sova P. et. al. Mol. Ther. 2004， 9:496-509; Ye X, et. al. Int. J. Mol. Med. 2005， 16:1179-84)。但该病毒由于自身问题，难 以得到单一纯病毒，从而阻碍了该系统的进一步发展和应用。
发明内容
发明概述
本发明是一种基于腺病毒复制重组的肿瘤靶向基因治疗系统；应用外源插 入片段中存在同源序列的两个腺病毒，同时感染肿瘤细胞，在细胞内复制重组。 亲代腺病毒为第一代腺病毒载体，没有外源基因表达框，DNA重组后，子代腺病 毒获得外源基因表达框，表达报告基因(EGFP)、复制基因(Ela)和治疗基因 (IL-24)，通过腺病毒介导的复制溶瘤引发细胞坏死[20]，同时表达IL一24诱 导细胞凋亡，促进病毒分散(Mi J. et. al. Hum. Gene. Ther. 2001， 12(10) :1343-52)，加快病毒从感染细胞中的释放，进一步感染周围肿瘤细胞。 重组所采用内含子，内部翻译终止子，在mRNA成熟过程中被剪切除去。在正常 细胞内，亲代腺病毒没有复制，也不发生重组，不表达复制基因和IL-24基因。
本发明提供了经改造的重组腺病毒载体，在宿主细胞中进行特定的同源重 组以产生预设的基因组重排衍生物，达到改变遗传信息的作用。
对于肿瘤基因治疗的载体， 一方面要求其可以针对肿瘤细胞产生特异性； 另一方面，也希望具有抗肿瘤基因，特异性的在肿瘤细胞内表达，提高对肿瘤 细胞的杀伤效果。同时要求其在正常细胞中尽可能不复制，减低对正常细胞的 杀伤。为达到这两个目的，将A5型腺病毒Ela基因和人mda7/IL-24基因结合 入病毒基因组中会产生一个理想的结果。
5型腺病毒Ela基因位于病毒基因组左端，具有84%的保守性。Ela编码两 个主要蛋白， 一个有243个氨基酸(12S， 243R), —个有289个氨基酸(13S， 289R)。 Ela-12S和Ela_13S蛋白通过激活病毒基因的表达促使病毒复制 (Shenk，T。 1996。 Ade丽iridea， P。 2111—2148)。 Ela-12S和Ela-13S蛋白是腺病毒最初表达的两个蛋白，具有激活腺病毒其他基因，特别是E2区和E4区基因转录的功能，而这两个区的功能是有关腺病毒的复制。
Ela直接活化细胞基因，诱导细胞DNA复制，与细胞周期调控蛋白pRb， pRb相关蛋白(P107/pl30)或P300相互左右。
Ela与pRb家族蛋白分子的结合，释放出E2F家族的转录因子，造成宿主细胞中一些有关腦A合成的基因被正向调控，使静止期细胞进入S期。这些和一些其它在S期激活的细胞因子，产生了一个适合病毒DNA合成的环境。在正常细胞中，Ela诱导细胞周期负调控，造成P53蛋白的积累，刺激P53介导G1期细胞停滞(el-Deiry， W. S. et. al. , 1993， Cell, 75: 817-25;Xiong， Y. et. Al.1993. Nature, 366:701-4)或进入西巴凋亡途径。另外，Ela诱导的凋亡也能通过不依赖P53途径发生(Teodoro， J。 G。 et。 al。 1995。 0ncogene。 11: 467 —74)。
Ela基因过去被曾认为使一个癌基因，可使动物胚胎细胞发生永生化，并可与其它病毒或细胞的癌基因相互作用。
在动物试验中，Ela并不能单独诱发癌变，而需与Elb等其他基因共同起作用。5型腺病毒本身没有致癌性，其它型有致癌性的腺病毒与其单独的Ela基因没有必然的联系。近十年来，许多实验证实，5型腺病毒Ela基因不但对人体细胞没有致癌性，而且实际上可以有抑制肿瘤生长的作用。Ela的肿瘤抑制作用可能与Ela对多种基因的调控有关。主要表现在以下几个方面
neu基因过度表达与人体恶性肿瘤特别是头颈口腔鳞癌密切相关，也与肿瘤的预后及耐药性相关。而有证据显示，Ela基因在转录水平可以特异性的抑制neu基因的表达，可以抑制如粘附、侵袭等与肿瘤转移相关的特性，Ela基因也能抑制癌基因诱导的包括细胞多形性等在内的癌变特性，也可提高表达neu基因的乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性(Yu， DH， et。 al。 Molecular basis ofoncology. 1995:131-162; Ueno， NT. et. al. Proc AACR， 1998,39:360)。
Ela通过提高细胞P53水平诱导细胞凋亡，产生抗肿瘤作用。Ela可以提高细胞对5-氟尿嘧啶、顺铂等化疗药及辐射所诱导的细胞凋亡的敏感性。
Ela可以在宿主细胞表面表达，提高机体对细胞表达Ela基因的细胞杀伤、清除，达到抗肿瘤效果。
6黑色素瘤分化相关基因(mda-7)，又称为白介素24(IL-24)，首先是在被IFN- e和MEZ处理的HO-1人类黑色素瘤细胞中发现的，随后在许多免疫细胞和经诱导剂处理的肿瘤细胞中也相继发现了稳定的mda-7/IL-24表达，其作用主要包括以下几点
直接抑瘤作用将mda-7转染细胞后能抑制多种肿瘤细胞的增殖和集落形成并使肿瘤细胞丧失肿瘤原性，包括黑素瘤、胶质母细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌和前列腺癌等；但将mda-7/IL-24转染正常细胞并不影响细胞的生长[Madireddi MT et al. Adv Exp Med Biol 2000 465，239 - 261; Pataer A et al. Cancer Res. 2002， 62: 2239-43;Fisher PB etal.Cancer Biol Ther 2003，2:S23-S37]。
诱发肿瘤细胞凋亡肿瘤细胞内表达的MDA-7/IL-24蛋白，通过上调促凋亡因子Bax与抑制凋亡因子Bcl-2的比例及激活caspase-3和增加表达量等方式达到选择性的使肿瘤细胞发生凋亡；但MDA-7蛋白不引起正常细胞发生凋亡[Su ZZ et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998， 95: 144002-5， LebedevaIV et.al. Oncogene 2002， 21: 708-18]。
抗血管生成MDA-7具有显著的抗肿瘤血管生成作用，主要通过抑制血管内皮细胞生长因子(V-EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管内皮细胞在体外的分化和迁移，和抑制血管平滑肌细胞的生长和迁移而发挥作用[Saeki T et al. Oncogene 2002, 21: 4558—66 Nishikawa， T et al. Molec Ther2004,9， 818 - 928]
旁观者抗瘤效应细胞内表达的MDA-7以自分泌和旁分泌两种形式进入机体抑制远端肿瘤生长[Su ZZ et al. Oncogene 2005, 24: 7552-6628]。
刺激免疫反应MDA-7蛋白能够活化免疫细胞，能够刺激PBMC分泌高水平的白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)和干扰素(IFN)，同时能够抑制白介素1(IL-1 )、白介素12(IL-12)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的活性，作为一种免疫刺激剂发挥抗瘤作用[SarkarDetal. Proc. Natl. Acad。 Sci,USA, 2005， 102: 14034-9 ; Caudell EG et al, J. Immunol. ,2002， 168: 6041-6]
增加放化疗的敏感性:MDA-7蛋白能够增加肿瘤细胞对放射疗法和化学疗法的敏感性，可以作为放化疗增敏剂发挥作用[Su ZZ et al. Oncogene ， 2003， 22:1164-80; Chada S et al. Cancer Gene Ther. 2006 ，13:490-502 ]。作为肿瘤基因治疗，现有问题是提高基因特异性地在肿瘤细胞中的表达，
本发明中的腺病毒载体具有这一特征，而Ela基因作为抗肿瘤基因近年来已应 用于临床试验中。本发明人经过研究实验，将5型腺病毒E1区启动子删除，代 之以非特异性的强启动子CMV，并在CMV后面连接外源性的内含子Intron，构建 出新的肿瘤基因治疗腺病毒载体系统中病毒载体MOOl，将5型腺病毒E1区启动 子删除，在相应位置放入外源性的内含子Intron，后面连接绿色荧光蛋白基因 EGFP，在EGFP基因的后面再连接腺病毒Ela基因，构建出另一病毒载体M002。为 进行实际应用，将M002病毒载体中的绿色荧光蛋白基因去除，代之以黑色素瘤 分化相关基因mda7/IL-24，形成病毒载体M003，目的是提供一种腺病毒载体系 统，可以特异性的在肿瘤细胞中复制重组，产生子代腺病毒，形成相应的表达 框，表达EGFP基因或mda7/IL-24基因，从而特异高效的杀死肿瘤细胞。具体 原理见图2。
本发明还提供了含有此肿瘤特异载体病毒及可药用载体的药物组合物。 本发明还提供了此肿瘤特异性载体在制备用于治疗肿瘤药物组合物中的用途。
发明详述 定义
除非另有不同定义，在此使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属 领域中一般技术人员通常所理解的一样。尽管任何与在此描述的相似或相同的 任何方法和材料可用于本发明的实施或试验。在此仅对优选的方法和材料予以 描述。为本发明现就以下术语予以定义。
在此使用的"外源基因"这一术语插入本发明中所用腺病毒载体中的编码 任何感兴趣的蛋白的DNA序列。插入外源基因长度的上限取决于腺病毒载体的 包装限度。插入的外源基因可编码任何研究所需的蛋白，可以具有药用或其它 特征。外源基因可用常规方法制备得来，如合成，及由天然来源提取、克隆等 得来。
本发明主要包括如下几个方面 1.本发明提供一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其含有 强启动子CMV序列；
内含子Intron序列，连接于所述CMV启动子序列的后面。2. 本发明还提供一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其含有
内含子Intron序列；
外源DNA序列，连接于所述内含子Intron序列的后面。
3. 本发明提供一种获得子代的重组腺病毒载体的方法，包括在适合的环境条 件下，将至少两个以上第一和二项所述的亲本重组腺病毒载体导入一个复制活 性细胞中，这样两个载体在转导的复制活性细胞中可以发生同源重组，进而生 成子代的重组腺病毒载体。本发明还提供通过该方法产生的子代的重组腺病毒 载体。其中，所述复制活性细胞是肿瘤细胞。所述的子代的重组腺病毒载体优 选是被包装的载体。
本发明优点
复制重组肿瘤靶向表达系统具有原创性和新颖性，其主要优点如下
1. 可制备出纯化病毒，而复制重组仅发生在肿瘤细胞内；
2. 它应用了强启动子，可以在肿瘤细胞内获得外源基因的相对高表达；
3. 它突破了只能针对某种特定肿瘤的限制，针对多数肿瘤获得靶向表达；
4. 同时应用了复制基因和治疗基因，在肿瘤靶向性复制溶瘤的基础上表达治疗 基因，诱导肿瘤细胞发生凋亡和坏死，达到治疗恶性肿瘤的目的。
5. 治疗基因mda-7的过表达，在诱导肿瘤细胞凋亡的同时，可抑制内皮细胞血 管形成和肿瘤细胞的迁移扩散，还能激活免疫反应，从而通过多种途径阻滞肿 瘤细胞的生长。
图l构建的重组腺病毒基因图谱
图2重组腺病毒载体在肿瘤细胞特异性复制原理
图3重组腺病毒载体在肿瘤细胞内特异性比表达报告基因
图4 Ela增强带有治疗基因mda7的重组腺病毒载体对肿瘤细胞的杀伤
具体实施例方式
实施例-一 用于同源重组的第一代腺病毒的构建
以下描述了MOOl， M002, M003重组腺病毒的构建。除非另外说明，本发明 所采用的技术，均是本领域常规技术，如分子克隆技术，微生物学技术，细胞 生物学技术，这些技术在文献中均有充分解释。
1. M001病毒的构建
以 pGEM. Intron 为模板，PCR得到 Intron 片段(引物为 5， CTAGCAGCTGAGCTAGGACTCT3' ， 5' GGGAAGCTTGAATTCTTTGCCAA3， )， Sail 和HindI工I双酶切后，回收大片段；用Sail和HindIII切割质粒pShuttle. CMV， 回收大片段，与Intron片段相连接构成质粒pSh. CMV. Intron。将此质粒与 PAdeasyl共同电转化BJ5183感受态细胞，挑取菌斑，酶切鉴定获得质粒 pAd. CMV. Intron，将此质粒用脂质体转染293细胞，将细胞表面铺0. 75%的琼脂， 内含l XDMEM， 7%胎牛血清，置于37。C 5% C02培养箱中培养，约9天后培养 皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA，进行 DNA酶切分析，确定正确的重组腺病毒毒株。
2. M002病毒的构建
用HindlII和Xbal切割质粒pEGFP-Nl，回收含有EGFP基因的片段.用Sail 和HindIII双酶切Intron的PCR片段，回收大片段.质粒pIRES-Ela-blunt Af III酶切后，Klenow大片断补平，再用Nhel酶切，回收含有Ela基因的片段. 将质粒pShuttle用Munl酶切后补平，再用Sail切割，回收大片段，分别将 Intron片段和EGFP基因及Ela基因与该片断连接，构成质粒 shuttle. Intron. EGFP/Ela.将此质粒与PAdeasyl共同电转化BJ5183感受态细 胞，挑取菌斑，酶切鉴定获得质粒pAd. Intron. EGFP/Ela，将此质粒用脂质体转 染293细胞，将细胞表面铺0. 75%的琼脂，内含1 XDMEM， 7%胎牛血清，置于 37 °C 5。/。C02培养箱中培养，约9天后培养皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬 斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA，进行DNA酶切分析，确定正确的重组腺病
毒毒株o3.M003病毒的构建
M003病毒的构建方法是用质粒pORFmda7中的mda7基因片段代替M002病毒 构建中的EGFP基因片段，形成质粒pshuttle.Intron.mda7/Ela.将此质粒与 PAdeasyl共同电转化BJ5183感受态细胞，挑取菌斑，酶切鉴定获得质粒 pAd. Intron. EGFP/Ela，将此质粒用脂质体转染293细胞，将细胞表面铺0. 75% 的琼脂，内含l XDMEM， 7%胎牛血清，置于37 °C 5% C02培养箱中培养，约9 天后培养皿琼脂层下细胞出现噬斑，挑取噬斑，进行扩增，提取重组腺病毒DNA， 进行DNA酶切分析，确定正确的重组腺病毒毒株。
重组病毒的基因结构图见图1。
实施例二第二代腺病毒的生成
将MOOl病毒和M002病毒(或M003病毒)以3:7的比例感染肿瘤细胞，约24 小时后，可形成具有完整外源基因表达框的子代腺病毒，从而表达外源基因。
实施例三子代病毒在肿瘤细胞中的特异性复制与表达 将M001病毒和M002病毒以3:7的比例和感染系数100感染Hela细胞(人 宫颈癌细胞)，A549细胞(人肺癌细胞)，PLC/PRF/5细胞(人肝癌细胞)，H印3B细胞 (人肝癌细胞)，LTEP-a-2细胞(人肺癌细胞)，H印al-6细胞(小鼠肝癌细胞).Tc-l 细胞(小鼠肺癌细胞).MRC-5细胞(人胚肺细胞)，TE353.sk细胞(人正常皮肤细 胞)，RF/6A (猴正常眼细胞).以上细胞分别培养于96孔板中，培养条件是DMEM培 养基，10%胎牛血清，37 。C 5% C02培养箱中培养，72小时后，用高内涵药物分析 系统检测EGFP的表达量，结果见图3，从图中可看出EGFP在人的肿瘤细胞中有 很高的表达，而在正常细胞中几乎没有表达。
实施例四Mda7对肿瘤细胞的特异性杀伤
将M001病毒和M002病毒或M003病毒以3:7的比例和感染系数100感 染，A549细胞(人肺癌细胞)，BEL7404细胞(人肝癌细胞)，H印3B细胞(人肝癌细 胞)，NCI-H460细胞(人肺癌细胞)，huh7细胞(人肝癌细胞).MRC-5细胞(人胚肺细胞)，.以上细胞分别培养于96孔板中，培养条件是DMEM培养基，10%胎牛血清，37 °C 5% C02培养箱中培养，72小时后用cck8试剂检测细胞活力，结果见图4，从 图中可见mda7基因的表达可有效的杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞没有影响。
权利要求
1.一种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其含有强启动子CMV序列；内含子Intron序列，连接于所述CMV启动子序列的后面。
2. —种至少缺少E1和/或者E3基因的重组腺病毒载体，其含有内含子Intron 序列；外源DNA序列，连接于所述内含子Intron序列的后面。
3. —种获得子代的重组腺病毒载体的方法，包括在适合的环境条件下，将 至少两个以上第一和二项所述的亲本重组腺病毒载体导入一个复制活性 细胞中，这样两个载体在转导的复制活性细胞中可以发生同源重组，进而 生成子代的重组腺病毒载体。
4. 通过该方法产生的子代的重组腺病毒载体。其中，所述复制活性细胞是肿 瘤细胞。所述的子代的重组腺病毒载体优选是被包装的载体。
5. 权利要求二种所述外源基因是mda7基因。
6. 权利要求一和权利要求二所说的重组腺病毒载体，制备用于治疗恶性肿瘤 的药物的用途。
全文摘要
本发明描述了一套高效低毒的基因转移载体系统的构建过程及应用构建了具有强启动子和内含子的重组腺病毒载体和含有同样内含子及mda7/IL-24基因、腺病毒复制基因E1a的腺病毒载体，使其能够靶向我们选定的目的细胞，尤其是复制活性细胞；本发明的重组腺病毒载体在宿主细胞中经复制重组，产生子代腺病毒，具有外源基因的表达框，表达外源基因，达到在宿主细胞中特异性表达的目的。本发明的重组腺病毒可作为基因治疗的有效工具，达到基因治疗，特别是各种癌症的基因治疗的目的。
文档编号C12N7/01GK101684477SQ20081020051
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者旻 梁, 琴 陆 申请人:上海三维生物技术有限公司