专利名称：：用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一对用于PCR的引物。特别涉及一对用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物。
背景技术：
：在过去的二十年中，微生物多样性研究的方法有了飞速的发展。这些手段主要依赖于聚合酶链式反应(PCR)对目的基因的扩增。16SrRNA基因是这类研究中使用最有效最普遍的分子标记。这些分子生物学方法的进展使我们能对未能培养的微生物进行一定的研究，有助于我们对来自各种环境中的未知微生物群落进行分类学和生态学层面上的研究。微生物多样性的研究主要依赖于对16SrRNA基因这类研究中使用最有效最普遍的分子标记的分析。而这种分析通常需要使用PCR技术。引物是PCR的关键，直接影响到能否全面反映微生物多样性。目前，尽管有多种真细菌的16SrRNA引物在研究中被用到，但缺乏适合于单方向测序可读取长度的的此类引物。
发明内容本发明的目的在于提供一对用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物，该引物的碱基序列为f,:5，-GCCTAACACATGCAAGT-3';r:5，-ATGCTCCACCTCTTGT陽3，。本发日月搜集了57w'ge〃a6qydz7,5ac/〃2^cmf/wvac^'C7astn'c//iw7"cWoZw/^"cw附,丄a"o6flfcz7/iAyac/tfop/z/Ztw,A/eso/7/asffjflf_/7orwm，爿c/tfo6a"en'a6a"er/ww，■Esc/zen.c/j/aco//的全长16SrRNA基因，运用MEGA4.0软件进行序列排列，挖掘其保守区段的序列。随后运用引物设计软件PrimerPremier5.0进行引物设计。考虑到后续测序能力，每条序列单方向测序的有效读取长度一般小于1000个碱基，所以设计出扩增片段长度约900个碱基对的引物f,(5'-GCCTAACACATGCAAGT隱3，)；r,(5，-ATGCTCCACCTCTTGT-3，)本发明提供的用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物具有很好的通用性和实用性，能良好反映实验对象中真细菌的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。图l是本发明实施例一中，PCR电泳图，S为PCR产物图2本发明是实施例二中，根据所构建的16SrDNA克隆文库的测序结果所建立的系统发育进化树的一个小分支。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一使用本发明引物进行对环境微生物基因组DNA样品的扩增取来源于沼气池桨中微生物基因组DNA样品，进行PCR扩增。PCR的反应体系为50n1:10Xbuffer:5iU，10mMdNTP:1w1，10mMprimerf:2.5P1，lOmMprimerr:2.5iU，Taq酶(2U/ul):lul，DNA:0.5iU，ddH20:37.5u1。PCR参数设计如下起始变性5分钟，95°C;30个循环(变性30秒，95°C;退火30秒，55°C;延伸50秒，72°C);最后延伸7分钟，72°C。琼脂糖凝胶电泳所用琼脂糖浓度为1%的凝胶，含0.5Pg/mL溴化乙锭，所用DNA分子量标记(Marker)为北京天为时代科技有限公司的lOObpladder。电泳结果见图1。实施例二由本发明扩增得到的PCR产物构建16SrDNA克隆文库，并建立系统发育进化树使用实施例1中的方法得到PCR产物。将PCR产物经BODAPCRPurificationKitColumns纯化，并与T载体连接，经电击转化构建16SrDNA克隆文库。从每个样品中随机挑选出克隆进行96孔板扩增培养，使用碱法板抽转化子质粒。获得的质粒使用DYEnamicETDynamicTerminatorSequencingReagent(AppliedAmersham)和2pm的测序引物M13R(5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3')做测序反应，然后使用MegaBACE4500DNA测序仪(AppliedAmersham)进行单向测序。对获得的序列剔除属于载体的序列和质量值低于20的序列，保留可读长度约700个碱基的序列做进一步的系统分类分析。序列经MEGA4.0排列。依据测序图谱，对每条序列进行人工编辑，只保留测序碱基位点明确的序列做后续分析，引物的序列被去除。对所获得序列使用MEGA4.0建系统发育进化树。图2所示为进化树中的一个分支，表明除序列002C12和已知菌种S;/Wra;^omomw^.rB-6—致外，其余都是未知的菌种，根据系统发育树显示的进化关系说明它们属于真细菌，而部分序列和NCBI(http://www.ncbi.nlrn.nih.gov/)上序列相一致，均为未能培养的细菌。说明通过使用这对引物，不仅能检测已知的真细菌，而且能反映出样品中所含真细菌的多样性。实施例三对由本发明扩增得到的PCR产物构建16SrDNA克隆文库进行多样性评价对由实施例2得到的PCR-16SrDNA克隆文库进行多样性评价。使用软件DOTUR(Distance-basedOTUsandRichness)计算产生评价多样性的Shannon指数。所有文库中的序列经MEGA4.0整合的ClustalW程序进行了排列，然后使用程序Philip计算出距离矩阵。将距离矩阵作为输入文件导入DOTUR程序进行运算，得到Shannon指数。如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>序列差异度的取值直接影响到Shannon指数的值，由表所示当序列差异度取值为0.05时，Shannon指数是3.41，说明此文库内所含真细菌具有非常高的遗传多样性。因此表明本发明引物能很好地来探测真细菌的多样性。序列表<110>上海大学<120>用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物<160>2<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>1GCCTAACACATGCAAGT17<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>2ATGCTCCACCTCTTGT1权利要求1.一种用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物，其特征在于该引物的碱基序列为f，5’-GCCTAACACATGCAAGT-3’；r5’-ATGCTCCACCTCTTGT-3’。全文摘要本发明涉及一对用于古细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物。该引物的碱基序列为f5’-GCCTAACACATGCAAGT-3’；r5’-ATGCTCCACCTCTTGT-3’。本发明提供的用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物具有很好的通用性和实用性，能良好反映实验对象中真细菌的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。文档编号C12N15/11GK101368215SQ20081020028公开日2009年2月18日申请日期2008年9月24日优先权日2008年9月24日发明者孙振华,宋任涛,张荫雷,佳濮,袁轶伟,许政暟,马中良申请人:上海大学