专利名称：快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法
技术领域：
本发明涉及一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法。
背景技术：
原核生物(尤其是细菌)几乎生存于地表的所有区域，它们拥有巨大的潜在基因资源，等待被科学地开发和利用。已有文献表明，目前能够从环境中被分离和鉴定的细菌种类还不到地球所有细菌种属的1%。因此，如要对环境中的细菌基因进行挖掘，就必须避开细菌的不可培养性，直接从环境宏基因组中克隆相应的细菌基因。土壤是一类复杂的天然生境，是微生物尤其是细菌的大本营，含有十分丰富的细菌多样性。近十几年来，从土壤宏基因组中获取细菌的特异功能基因一直是全世界微生物学家的关注热点之一。目前从土壤中筛选特异功能基因的主要技术手段是通过大肠杆菌和克隆载体构建高覆盖率的宏基因组文库，然后用基于序列或基于功能的方法从文库中克隆特异的基因。此类方法尽管可以筛·选到新颖的功能基因，但由于高覆盖率文库构建的复杂性以及后期文库中阳性克隆筛选工作的高通量、低几率，给此法的推广应用前景带来一定的困难。对于生物体的生长发育而言，氮素的同化是十分重要的生理过程。无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase，GS)是GS-GOGAT氮同化路径上的关键酶，催化NH4+和谷氨酸同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺在生物体内含氮有机物的生物合成中作为氮供体，外界的无机氮元素也通过这个途径进入生物体内的整个氮素循环。因此，GS在生物体氮同化过程中起了十分重要的作用，从土壤等生物多样性很丰富的复杂环境中直接克隆GS基因具有十分重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法。基于上述目的，本发明以细菌中普遍存在的GS为目标基因，通过同源基因保守性分析设计种属特异性的兼并引物，以巢式PCR为获取基因的主要技术，克隆到了 5个谷氨酰合成酶基因，它们在大肠杆菌GS基因缺陷型菌株ET6017中均实现了对宿主菌GS功能的恢复，证明这5个基因都具有谷氨酰胺合成酶的活性，表明本发明方法用于克隆土壤中的GS基因是切实可行的。本发明是通过以下技术方案实现的
一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下
a.根据常见细菌类群的GS基因序列设计嵌套式兼并引物，引物序列如下a-Ι.扩增假单胞菌GS基因的引物
外引物 Ps4-elF: 5’ -GCATCACCCAAATTCAAGGG-3’
内弓 I 物上游引物 Ps4F: 5，-ATGTCGAAGTCGGTTCAACT-3，
内引物下游引物 Ps4R: 5’-TCAGCAGCTGTAGTAMAGCT-3’ ； a-2.扩增蜡样芽胞杆菌GS基因的引物
外引物 Bcl-elF: 5’ -ACTGATTCTGAAGGTGTTTA-3’内弓 I 物上游引物 Be IF: 5 ’ -ATGGCTAGGTACACAAAAGA-3 ’
内引物下游引物 BclR: 5’-TTAGTAHAGAGACATATATT-3’ ； a-3.扩增根瘤菌GS I基因的引物
外引物 Rzl-elF: 5’ -CGCAAAGTCCGWTACCGTCA-3’
内弓 I 物上游引物 Rz IF: 5 ’ -ATGGCGACCGCAAGCGAAAT-3，
内引物下游引物 RzlR: 5’-TCAGGCCGAATARTACATGT-3’ ； a-4.扩增根瘤菌GS II基因的引物
外引物 Rz2-elF: 5’ -CTCCGGRTTTGCTCACCTTC-3’
内弓I物上游引物 Rz2F: 5，-ATGACAAAATATAAGCTCGA-3，
内引物下游引物 Rz2R: 5’-TYARGCKGCAGCGGAAGCCG-3’ ；
b.使用嵌套引物中的外引物和内引物下游引物对所抽提的环境样品总DNA进行第一轮PCR扩增，扩增产物纯化后作为模版，用内引物上下游引物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮扩增产物；
c.对步骤b所得第二轮扩增产物进行纯化，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌ToplO，挑取正确的阳性克隆，即得到细菌谷氨酰胺合成酶基因。上述的所抽提的环境样品的总DNA是指从土壤、污泥或人畜胃肠道中抽提的样品的总DNA。上述的设计嵌套式兼并引物的具体步骤为先挑选一种细菌种属的所有GS基因序列中数量较多的一组相似序列群的读码框区域为模版，进行简并引物设计，得到内引物上游引物和内引物下游引物；同时针对细菌种属的GS基因读码框的起始密码上游约4(T65bp位置区段再设计一条引物，该引物即为外引物。上述的挑取正确的阳性克隆的方法为将第二轮扩增产物进行纯化后，连接PMD18-T载体，转化大肠杆菌ToplO菌株，获得一系列单克隆后，再用内引物PCR验证，挑取正确的阳性克隆。与现有的土壤文库筛选克隆技术相比，本发明所描述的方法具有快速简便的优点，尤其适用于克隆与已知基因有一定序列同源度的同类基因。本发明方法具有良好通用性，可以适用于克隆来自土壤，污泥，人畜胃肠道等各种复杂环境样品中的细菌谷氨酰胺合成酶基因。
图I是实施例二的PCR产物电泳图。A图中I 6泳道是以引物Bcl-elF和BclR扩增6份土样的结果，7 12泳道是以引物Rzl-elF和RzlR扩增6份土样的结果，13 18泳道是以内引物BclF和BclR用6份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果，1扩24泳道是以内引物RzlF和RzlR用6份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果，M是100bp DNA Ladder。B图中I 6泳道是以引物Ps4_elF和Ps4R扩增6份土样的结果，7 12泳道是以内引物Ps4F和Ps4R用6份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果，M是100bp DNA Ladder。C图中I 6泳道是以引物Rz2_elF和Rz2R扩增6份土样的结果，7 12泳道是以内引物Rz2F和Rz2R用6份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果，M是100bp DNA Ladder。图中白箭头所指的是扩增出的GS基因特异条带。
图2是实施例三的5个GS基因重组质粒和空载PMD18-T的大肠杆菌ET6017转化子细胞在M9液体培养基中的生长情况监测图。
具体实施例方式本发明实施例以土壤为样品，说明土壤中常见细菌类群的目标基因一谷氨酰胺合成酶(GS)基因的克隆方法
实施例一
一、土壤中常见的细菌种类有腊样芽孢杆菌{Bacilluscereus)^根瘤菌属(TPAizoAiwffispp)、假单胞菌属(Aewt/offlmas spp)等。根据GenBank中收录的这些种属细菌的GS基因序列先设计了 4套引物(每套引物均为挑选该种属的所有GS基因序列中数量多的一组相似序列群的读码框区域为模版，进行简并引物设计)，作为巢氏PCR的内引物，该引物扩增的反应称为第二轮扩增，可获得基因的读码框全序列；同时针对读码框的起始密码上游约4(T65bp区段再设计一条对应的外引物，与相应的内引物下游引物组成一对新引·物，这对引物扩增的反应称为第一轮扩增。本实施例中所设计的引物如下
扩增假单胞菌GS基因的引物
外引物 Ps4-elF: 5’ -GCATCACCCAAATTCAAGGG-3’
内弓 I 物上游引物 Ps4F: 5，-ATGTCGAAGTCGGTTCAACT-3，
内引物下游引物 Ps4R: 5 ’ -TCAGCAGCTGTAGTAMAGCT-3 ’
扩增蜡样芽胞杆菌GS基因的引物
外引物 Bcl-elF: 5’ -ACTGATTCTGAAGGTGTTTA-3’
内弓 I 物上游引物 Be IF: 5 ’ -ATGGCTAGGTACACAAAAGA-3，
内引物下游引物 BclR: 5’ -TTAGTAHAGAGACATATATT-3’
扩增根瘤菌GS I基因的引物
外引物 Rzl-elF: 5’ -CGCAAAGTCCGWTACCGTCA-3’
内弓 I 物上游引物 Rz IF: 5 ’ -ATGGCGACCGCAAGCGAAAT-3，
内引物下游引物 RzlR: 5’ -TCAGGCCGAATARTACATGT-3’
扩增根瘤菌GS II基因的引物
外引物 Rz2-elF: 5’ -CTCCGGRTTTGCTCACCTTC-3’
内弓I物上游引物 Rz2F: 5，-ATGACAAAATATAAGCTCGA-3，
内引物下游引物 Rz2R: 5’ -TYARGCKGCAGCGGAAGCCG-3’
二、用设计的4套引物从土壤宏基因组中扩增GS基因
以6份土壤样品的宏基因组DNA为模板，用4套引物中的外引物和内引物下游引物组合进行第一轮PCR，扩增后的产物经过试剂盒液体回收纯化后，作为模板，再以4套引物中的内引物上下游引物进行第二轮PCR，结果部分土样的宏基因组中扩增出了明显的GS基因特异条带(见图1)，条带的大小与预期的大小一致。将获得的特异DNA条带经过割胶回收，连接pMD18-T载体，热激转化大肠杆菌ToplO感受态，挑取正确的阳性克隆，获得5个相应的细菌谷氨酰胺合成酶基因，其核苷酸序列已经递交到美国NCBI的GenBank数据库，序列登录号依次为JX017366 JX017370。实施例二经PCR验证正确的转化子抽提质粒，以M13引物对(正向引物5’ -CAGGAAACAGCTATGAC-3’，反向引物 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’)，用 MegaBACE 4500DNA测序仪(Amersham Biosciences)进行双向测序。所获得的5个GS基因序列与已知的同类基因进行序列分析后，结果如表I。表I本发明所克隆的来自土壤宏基因组的细菌谷氨酰胺合成酶基因同源性分析
权利要求
1.ー种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下 a.根据常见细菌类群的GS基因序列设计嵌套式兼并引物，引物序列如下a-1.扩增假单胞菌GS基因的引物外引物 Ps4-elF: 5’ -GCATCACCCAAAITCAAGGG-3’ 内弓I物上游引物 Ps4F: 5，-ATGTCGAAGTCGGTTCAACT-3， 内引物下游引物 Ps4R: 5’-TCAGCAGCTGTAGTAMAGCT-3’ ； a-2.扩增蜡样芽胞杆菌GS基因的引物外引物 Bcl-elF: 5’ -ACTGATTCTGAAGGTGTTTA-3 内弓 I 物上游引物 Be IF: 5 ’ -ATGGCTAGGTACACAAAAGA-3， 内引物下游引物 BclR: 5’-TTAGTAHAGAGACATATAIT-3’ ； a-3.扩增根瘤菌GS I基因的引物 外引物 Rzl-elF: 5’ -CGCMAGTCCGWTACCGTCA-3’内弓 I 物上游引物 Rz IF: 5 ’ -ATGGCGACCGCAAGCGAAAT-3， 内引物下游引物 RzlR: 5’-TCAGGCCGAATARTACATGT-3’ ； a-4.扩增根瘤菌GS II基因的引物外引物 Rz2-elF: 5’ -CTCCGGRTTTGCTCACCTTC-3’ 内弓I物上游引物 Rz2F: 5，-ATGACAAAATATAAGCTCGA-3， 内引物下游引物 Rz2R: 5’-TYARGCKGCAGCGGAAGCCG-3’ ； b.使用嵌套引物中的外引物和内引物下游引物对所抽提的环境样品总DNA进行第一轮PCR扩增，扩增产物纯化后作为模版，用内引物上下游引物进行第二轮PCR扩增，得到第ニ轮扩增产物； c.对步骤b所得第二轮扩增产物进行纯化，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌ToplO，挑取正确的阳性克隆，即得到细菌谷氨酰胺合成酶基因。
2.根据权利要求I所述的快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于所述的所抽提的环境样品的总DNA是指从土壌、污泥或人畜胃肠道中抽提的样品的总DNA。
3.根据权利要求I或2所述的快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于设计嵌套式兼并引物的具体步骤为先挑选ー种细菌种属的所有GS基因序列中数量较多的ー组相似序列群的读码框区域为模版，进行简并引物设计，得到内引物上游引物和内引物下游引物；同时针对细菌种属的GS基因读码框的起始密码上游约4(T65bp位置区段再设计一条引物，该引物即为外引物。
4.根据权利要求I或2所述的快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于所述的挑取正确的阳性克隆的方法为将第二轮扩增产物进行纯化后，连接PMD18-T载体，转化大肠杆菌ToplO菌株，获得一系列单克隆后，再用内引物PCR验证，挑取正确的阳性克隆。
全文摘要
本发明涉及一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶(GS)基因的方法。该方法的主要内容包括(1)针对细菌类群的GS基因序列设计嵌套式兼并引物；(2)使用嵌套引物中的外引物和内引物下游引物对土壤DNA进行第一轮扩增，扩增产物纯化后作为模版，用内引物上下游引物进行第二轮PCR扩增；(3)对第二轮扩增后的特异片段进行纯化，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌Top10，挑取正确的阳性克隆；(4)对阳性克隆的插入片段进行测序和序列分析，确定基因的正确性；(5)用大肠杆菌GS缺陷型ET6017的功能互补实验来验证所克隆基因的功能。本发明所描述的基因克隆方法具有很高的成功率和较好的准确性。
文档编号C12N15/52GK102787127SQ20121018412
公开日2012年11月21日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者唐远平, 宋任涛, 朱晨光, 沈春磊, 王佩佩, 许政暟 申请人:上海大学