专利名称：抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及ー种抑制H)⑶4基因表达的siRNA及其在研究TOCD4基因功能中的应用。
背景技术：
程序性细胞死亡因子4(Programmed cell death4, F1DOM)是近年来发现的一种新的抑癌基因，研究报道其在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巣癌、神经胶质瘤和肝细胞癌等多种恶性肿瘤细胞中表达缺失或低表达。Chen等(Chen Y,Knosel T, KristiansenG. J Pathol, 2003, (5) :640-646.)通过研究124例不同亚型的原发性肺癌样本，结果显示，83%的肿瘤样本中H)⑶4蛋白表达缺失，相对于肺部正常组织中H)⑶4mRNA的表达，肺癌组 织中F1DOMmRNA的表达水平比正常肺部组织中显著降低。Afonja等(Afonja O, Juste D, DasS，et al. Oncogene, 2004, 23:8135.)在对乳腺癌细胞系的研究中发现，通过转染H)CD4到T-47D和MDA-MB-231乳腺癌细胞系，可以诱导细胞凋亡的发生。Zhang等(Zhang H, OzakiI, Mizuta T，et al. Oncogene, 2006, 25(45) :6101-6112.)发现 PDCD4 也可以诱导肝癌细胞系Huh7的凋亡。H)⑶4的表达产物可调节细胞的程序性死亡，也可通过抑制凋亡相关基因的转录或翻译从而抑制肿瘤的生成或肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞中TOCD4的表达水平与药物对细胞的敏感性之间存在一定的关系。通过转染反义TOCD4可以明显减弱肾癌细胞系U0-31对药物葛尔德霉素的敏感性，说明细胞中下调 F1DCDA 的表达会减弱药物的细胞毒性(Bohm, M. , Sawicka, K. , Siebrasse, J. P. , Brehmer-Fastnacht, A. , Peters, R. , & Klempnauer, K. H. (2003). Oncogene, 22 (31), 4905-4910.)。此外，通过转染全长I3D⑶4cDNA的质粒到人胃腺癌细胞系BGC-823中，增强I3D⑶4蛋白在细胞中的表达，发现其可相应的增强BGC-823细胞对药物羟基喜树碱(HCPT)的敏感性(王汉卿，孙震晓。世界华人消化杂志，2009，(7) :647-651. )。Jansen等(Jansen, A.P. , Camalier, C. E. , Stark, C., & Colburn, N. H. Mol Cancer Ther, 2004, 3(2)，103-110.)。研究发现rocD4的表达可提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，肿瘤细胞中rocD4的表达水平与细胞对抗肿瘤药物的敏感性正相关，上调TOCD4的表达会增加细胞对某些化疗药物的敏感性，反之，下调TOCD4的表达则会引起某些药物对细胞毒性的减弱。然而TOCD4在白血病中的功能研究较少，最近的研究发现，在急性髓性白血病(Acute myelogenous leukemia, AML)中，]3DOM的表达可促进维A酸诱导的粒细胞分化(Ozpolat B, Akar U, Steiner M, et al. Mol Cancer Res, 2007, 5:95.)。近期的报道表明，在白血病中H)⑶4基因直接被miRNA-21调控，抑制miRNA-21可以导致H)⑶4的表达水平显著升高，并展不出显著的抗白血病作用(①Yumin Li, Xujiao Zhu, et al. Cancer Science. 201O, 101(4):948-954;②Haiyan Hu, Yumin Li,Jingyi Gu, et al. Leuk Lymphoma. 2010, 51(4):694-701;③ Jingyi Gu, Xujiao Zhu, Yumin Li, et al. Med Oncol. 2011，28 (I):211-218.)，这提示抑癌基因H)CD4在白血病中也有重要作用。近年RNA干扰技术迅速发展，不仅广泛用于肿瘤基因治疗，而且也是研究基因功能的有用工具。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种抑制ro⑶4基因表达的siRNA。本发明的另一目的在于提供上述抑制ro⑶4基因表达的siRNA的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现一种抑制ro⑶4基因表达的siRNA，其序列为正义链5’-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3’，反义链5’-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3’；
优选为，所述的抑制ro⑶4基因表达的siRNA序列(包括正义链和反义链)的3’端垂悬有dTdT，dTdT结构有利于保护RNA免受酶解；所述的抑制F1D⑶4基因表达的siRNA以GenBank基因库中F1D⑶4已知序列(GeneID :27250, NM_145341, NM_014456)为基础，按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具siCatch siRNA Design针对编码区的siRNA靶点位置设计。上述的抑制ro⑶4基因表达的siRNA在研究ro⑶4基因功能中的应用，特别是用于进行TOCD4基因与白血病细胞对抗白血病化疗药物敏感性的相关性研究。本发明具有如下的优点(I)本发明提供的抑制ro⑶4基因表达的siRNA能有效沉默ro⑶4基因，下调PDCD4基因的表达量，为研究TOCD4基因的功能提供了新的技术方案。(2)通过研究白血病K562细胞中⑶4对抗白血病化疗药物敏感性的影响，发现在白血病细胞中下调H)CD4的表达可以降低抗白血病化疗药物对白血病细胞的敏感性，减弱细胞毒性，从而恢复白血病细胞生长。这为进一步研究roCD4在白血病中的功能及关系提供理论依据。
图I是Real-time PCR检测K562细胞内H)CD4 mRNA的相对表达水平图，*P< 0. 05。图2是Western bloting检测K562细胞内F1DCD^:和P-actin蛋白的表达水平图。图3是Western bloting检测K562细胞内F1DQM蛋白相对内参P -actin的相对表达水平图，*P < 0. 05。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。使用的材料白血病K562细胞购自中国科学院上海细胞所；新生牛血清购自杭州四季青生物工程科技有限公司；1640培养基购自GIBCO公司；Lipof ectamine 2000购自Invitrogen公司；MTT及二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；Trizol试剂购自天根生物公司；Real-time PCR相关试剂购自Takara公司，引物由上海生工合成；细胞裂解液(RIPA)和Bradford蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所，PVDF膜购自Millipore公司，0-actin—抗购自武汉博士德公司，F1DOM—抗购自Cell SignalingTechnology公司，二抗分别购自北京博奥森公司和Asbio Technology公司；三氧化二砷购自北京双鹭药业股份有限公司，小檗碱(Bererine, BB)购自Sigma公司，阿糖胞苷(Arabinosy I cytosine, Ara-C)购自赛德萨公司。统计学处理SPSS 13. 0统计软件处理数据，数据以均数土标准差(i±S)表示，采用完全随机设计的单因素方差分析法(one-way AN0VA)分析各组数据间差异的显著性。以P < 0. 05为
有显著性差异。金正均Q值法判断I3D⑶4 siRNA与药物联合使用后的效果Q = Ea+b/(Ea+Eb-EaXEb)，Ea和Eb分别为单用H)CD4 siRNA和单用药物的抑制率，Ea+b为两者联合用药的抑制率。式中分子代表“实测合并效应”，分母代表“期望合并效应”，Q值为两者之 比，Q〈0. 85为拮抗作用，0. 85 ( Q〈l. 15为相加作用，Q彡I. 15为协同作用。实施例I(一)PDCD4 siRNA 的设计与合成根据GenBank基因库中PDCD4 已知序列(Gene ID :27250, NM_145341,NM_014456),按照siRNA设计原则，结合Ambion公司提供的在线设计工具siCatch siRNA Design针对编码区不同的siRNA靶点位置设计了以下三条序列F>DCD4 siRNA 序列一正义链5’ -CACCAAUCAUACAGGAAUA-3’，反义链5’-UAUUCCUGUAUGAUUGGUG-3’；F>DCD4 siRNA 序列二 正义链5’-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3’，反义链5’-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3’；PDCD4 siRNA 序列三正义链5’-GGUGGAAAGCGUAAAGAUA-3’，反义链5’-UAUCUUUACGCUUUCCACC-3’；上述的各siRNA序列的3’端垂悬有dTdT ；随机对照采用siRNA通用对照(siRNA通用对照BLAST后与NCBI上所有已知的哺乳动物都有至少5个碱基的差异);HXD4 siRNA由广州锐博生物技术有限公司合成，siRNA通用对照购自广州锐博生物技术有限公司(产品编号为siN05815122147-l-2)。(二)白血病K562细胞的培养将白血病K562细胞接种于含体积分数10%的新生牛血清、无抗生素的1640培养基中，置于37°C、体积分数为5%的CO2培养箱，饱和湿度下培养，每2天换液传代，选用对数生长期、0. 2%台盼蓝拒染率>95%的细胞进行实验。(三)Real-timePCR 法筛选 PDCD4 siRNA 有效序列(I)实验分 PDCD4 siRNA 序列一组、H)CD4 siRNA 序列二组、H)CD4siRNA 序列三和随机对照组(Negative Control, NC);将设计合成的三个F1DOMsiRNA序列及随机对照分别以100nmol/L的终浓度转染到K562细胞(转染方法参照Invitrogen公司Lipofectamine 2000说明书)；(2)转染后的K562细胞培养48h后，提取各组细胞总RNA (提取细胞总RNA的方法参照Trizol试剂说明书)，提取的总RNA用微量核酸测定仪进行定量，测得A26(l/A28(l及其浓度；(3)利用 SYBR Green I Real-time PCR 以 GAPDH 为内参检测 K562 细胞内 ⑶4mRNA的表达水平将步骤2)提取的总RNA进行逆转录PCR和Real_timePCR，逆转录
PCR 条件70°C持续 5min，42°C持续 60min ；Real-time PCR 条件① 94°C持续 5min，② 94°C持续30s，③H)CD4 60°C、GAPDH 57. 5°C持续30s，④72°C持续30s，⑤读板，⑥步骤② ⑤循环39次，⑦融解曲线分析，从55°C 到95 °C，每TC读一次板，停留2秒，⑶4 mRNA的相对表达水平用A Ct和2_AACT计算；其中PCR引物由上海生工合成，⑶4上游引物5’ -GITGGCAGTATCCTTAGCAT-3’，下游引物5’ -CATCTCCTTCGCTTACAAA-3’ ；GAPDH 上游引物5’ -CAACGGATTTGGTCGTATT-3’，下游引物5’ -CACAGTCTTCTGGGTGGC-3'。Real-time PCR检测结果如图I所示，其中TOOMsiRNA序列二(即本发明提供的抑制ro⑶4基因表达的SiRNA)组的ro⑶4mRNA表达水平与随机对照组相比显著下降(P〈0. 05)，而其余两个序列组与随机对照组的⑶4 mRNA表达水平无明显变化，表明本发明提供的H)CD4 siRNA能有效抑制roCD4mRNA的表达。(四)Westernbloting 检测 PDCD4 siRNA (抑制 PDCD4 基因表达的 siRNA)对细胞内TOCD4蛋白表达水平的影响(I)实验分为三组，空白对照组(Blank),随机对照组(Negative control, NC),ro⑶4 SiRNA组；将ro⑶4 SiRNA组和随机对照组分别以IOOnmo I/L的终浓度按Lipofectamine 2000说明书的方法转染到K562细胞；(2)经过转染的K562细胞培养48h后收集细胞，按细胞裂解液(RIPA)说明书的方法提取细胞蛋白并用Bradford蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，根据定量结果对各蛋白质样本进行校正，加入loading buffer,置沸水中煮IOmin ；(3)将步骤(2)处理过的蛋白质样本进行不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳(10%聚丙烯酰胺分离胶和5%聚丙烯酰胺浓缩胶)，电压80V，待样本进入分离胶后电压改为120V，电泳 50min ；(4)将凝胶上的蛋白条带转到PVDF膜上，电压10V半干转膜25min ；TBST洗膜5min ;用质量百分比5%的脱脂奶粉封闭缓冲液将膜室温封闭Ih ；TBST洗膜3次，每次5min ;4°C过夜孵育一抗；TBST洗膜3次，每次5min ;室温孵育二抗Ih ；TBST洗膜3次，每次5min ;ECL化学发光,成像系统拍照；Image J图像分析软件分析F1D⑶4和P-actin的灰度，以3 -actin作为内参照计算I3D⑶4蛋白的相对表达水平；其中，10XTBS缓冲液lmol/LTris *HCl(pH7. 5)10mL、NaCl 8. 8g 加蒸馏水至 lOOOmL，TBST 缓冲液20% Tween201. 65mL、TBS 700mL,混匀后即可使用，最好现用现配。转染终浓度为100nmol/L的PDCD4 siRNA于K562细胞48h后，结果如图2和图3所示ro⑶4的蛋白表达明显下调。其中转染ro⑶4 SiRNA组，ro⑶4蛋白的表达水平相对于随机对照组显著下降(P〈0. 05);而转染随机对照组的ro⑶4蛋白的表达水平与空白对照组相比无明显变化，表明本发明提供的ro⑶4 SiRNA能有效抑制ro⑶4蛋白的表达。(五)抑制PD⑶4基因表达的siRNA(PD⑶4 siRNA)对药物敏感性的影响
(I)实验分空白对照组、随机对照组、ro⑶4 siRNA组、药物组、随机对照+药物组和ro⑶4 SiRNA+药物组，ro⑶4 SiRNA和随机对照的转染终浓度为100nmol/L ；其中，所述的药物分别为三氧化二砷(AT0)、阿糖胞苷(Ara-c)或小檗碱(BB)；(2)取对数生长期K562细胞，各组细胞以I X 105/mL的密度接种于96孔板，每孔50 ii L，按Lipofectamine 2000说明书的方法转染H)CD4 siRNA或随机对照，空白对照组和药物组用无血清Opti-MEM培养基替代siRNA，转染终体积100 u L (含细胞液50 y L);(3)转染6h后，加入IOOii L含体积百分比20%的新生牛血清以及相应浓度的药物(药物浓度分别为2 ii M AT0,2 u M Ara-c和120 u M BB)的1640培养基(药物组、随机对照+药物组和I3D⑶4 siRNA+药物组加入100 u L含药物和体积百分比20%的新生牛血清的1640培养基，其余组加入100 u L含体积百分比20%的新生牛血清的1640培养基)，终体积200 u L，继续培养72h后每孔加入5mg/mL的MTT液20 u L，于培养箱中培养4h后，37°C、1000rpm/min离心IOmin,弃上清，每孔加入150 u L 二甲基亚砜(DMSO)；(4)震荡使结晶充分溶解，在多功能酶标仪上测定吸光度A57tol，以A63tlnm作为参照，可间接反映细胞存活率；实验重复三次，计算增殖抑制率，增殖抑制率=[1_ (Aot/Am
组)]X100%。TOCD4 siRNA对As2O3 (ATO)作用K562细胞敏感性的影响如表I所示表I :各组K562细胞增殖抑制率的比较(5=±s n >3)
权利要求
1.ー种抑制ro⑶4基因表达的siRNA，其序列为 正义链5’ -GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3’， 反义链5’ -UUCUUCUACAAACCGCUCC-3’。
2.根据权利I所述的抑制TOCD4基因表达的siRNA，其特征在于所述的抑制TOCD4基因表达的siRNA序列的3’端垂悬有dTdT。
3.权利要求I或2所述的抑制H)⑶4基因表达的SiRNA在研究H)⑶4基因功能中的应用，其特征在于所述的抑制TOCD4基因表达的SiRNA用于进行TOCD4基因与白血病细胞对抗白血病化疗药物敏感性的研究。
全文摘要
本发明公开了一种抑制PDCD4基因表达的siRNA及其应用，所述的siRNA的正义链序列为5'-GGAGCGGUUUGUAGAAGAA-3'，反义链序列为5'-UUCUUCUACAAACCGCUCC-3'。本发明抑制PDCD4基因表达的siRNA为研究PDCD4基因的功能提供了新的技术方案，用该siRNA沉默PDCD4后可显著降低白血病细胞对化疗药物的敏感性。
文档编号C12Q1/02GK102719435SQ20121018375
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者朱雪娇, 李育敏, 谷景义, 费嘉, 骆小闯 申请人:暨南大学