专利名称：特异性调节pokemon基因表达的反义寡核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸及其应用。
技术背景POKEMON是一种新发现的致癌基因，它能够导致其它致癌基因发作，最终促 使肿瘤形成。POKEMON可以使癌细胞获得抗老化和死亡的能力，因此被称为癌症 的"总开关"。非常重要的一点是细胞内Pokemon的缺失不会对细胞的正常生长造成 影响，这就为设计低副作用的特异性抗癌药物提供了可能。Izant和Weintraub于1984年首次提出反义技术，所谓反义技术就是根据核酸间 结合碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补的反义核酸或它们的化学修饰 物与细胞内的核酸相互作用以抑制或封闭其表达。恶性肿瘤的发生与细胞内某些癌基 因的激活或某些抑癌基因的失活或缺失有关。反义核酸能特异地阻断癌基因激活后的 过度表达而不影响其他基因的正常功能，目前利用反义技术设计出与有害基因、突变 基因、非正常表达基因及其mRNA互补的反义核酸，以封闭这些基因或抑制其表达。 而反义核酸治疗肿瘤的研究主要在肿瘤细胞株、荷瘤动物和肿瘤患者三个水平上进行 应用。目前ISIS3521、 ISIS5132、 ISIS2503、 G3139、 GEM231等已进入临床试验阶 段。天然寡核苷酸在血清中不能稳定存在，在几分钟内就会完全被降解，因此，天然 寡核苷酸不能作为反义治疗的药物。 发明内容本发明的目的是提供一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸及其 应用。本发明所提供的反义寡核苷酸是，其分子式为下述式I至式IV中之一 5， CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx3，(式I ); 5 ， CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx 3 ，(式II ); 5, GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx 3 ，(式III); 5 ， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3 ，(式IV ); 其中，式I至式IV中，x均指硫代磷酸酯核苷间键(硫代磷酸酯键)；y均指磷 酸二酯核苷间键(磷酸二酯键)；A均指2'-脱氧腺苷；T均指2'-胸苷； <:均指2'-脱氧胞苷；G均指2'-脱氧鸟苷。本发明所提供的上述反义寡核苷酸的应用，是其在制备对POKEMON基因表达 进行调节、调整或抑制的药物，特别是治疗POKEMON基因过表达所引起的疾病(如 恶性肿瘤)的药物中的应用。所述药物以上述反义寡核苷酸为有效成分。所述药物可通过经脉或皮下给药治疗；所述药物可通过局部给药治疗。 所述给药治疗可与放射疗法结合或与化学疗法结合治疗疾病。 所述给药治疗的用药剂量范围是50 nmol/L…100nmol/L。本发明的反义寡核苷酸可特异性抑制POKEMON基因的表达；本发明的反义寡 核苷酸进行了硫代磷酸酯键的修饰，其在血清和细胞那的稳定性都大大提高，并且毒 副作用很小。本发明的反义寡核苷酸可作为有效成分用于制备治疗POKEMON高表 达引起的疾病的的基因治疗药物。
具体实施方式
实施例1、特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸的获得1、 POKEMON基因二级结构的预测和反义寡核苷酸的设计 利用工作站(www.bioinfo.rpi.edu.cn/applications/mfold)对POKEMON基因(NM—015898)的mRNA的二级结构进行了预测。针对POKEMON基因的阅读框架， 结合其二级结构设计了四条含有18-mer的硫代反义寡核苷酸AS1 AS4 (下述式I -式IV)。并以与人任何基因都不具有同源性的18个核苷酸序列AS5作为对照。AS1: 5， CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx3，(式I );AS2: 5， CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx3'(式II);AS3: 5，GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx3，(式III);AS4: 5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx3，(式IV);AS5: 5， AxTxGxTxAyGyTyCyGyTyCyTyGyCyCxTxAxGx 3 ，(式V)其中，式I至式IV中，x均指硫代磷酸酯键；y均指3， 5磷酸二酯键；A均指2'-脱氧腺苷；T均指2，-胸苷；C均指2'-脱氧胞苷；G均指2'-脱氧鸟苷。AS 1 AS4可以与POKEMON基因的mRNA形成DNA/RNA杂化双链，其可以 被RNaseH酶识别、降解，从而抑制POKEMON基因的表达。2、 固相合成POKEMON基因硫代反义寡核苷酸根据上述反义寡核苷酸AS1、 AS2、 AS3、 AS4、 AS5的分子式,用ABI391DNA 自动合成仪，按照通常的硫代寡核苷酸合成方法合成了硫代反义寡核苷酸AS1 AS5，将上述制备得到的硫代反义寡核苷酸AS1 AS5，经HPLC纯化，经紫外分光光度计定量，具体方法为用贝克曼库尔特(Beckmancoulter)公司的DU800紫外分光光 度计精确测定寡核苷酸的浓度，光径10mm的比色杯中,单链寡核苷酸在260rnn处的 消光系数是2(^ig/ml/10D.在光径10mm的100pl微量比色杯，加入98^1纯净水，在 260nm和280nm两个波长处的定零,然后加入2^1寡核苷酸并混匀，在260nm和280nm 两个波长处测溶液的光吸收，纯的寡核苷酸的A260/A280的比值在1.8至2.0之间，此 时在260nm所测的OD值就是寡核苷酸的浓度0ig411)。上述硫代反义寡核苷酸 AS1 AS5可向上海生工生物工程技术服务有限公司订做按照上述AS1、 AS2、 AS3、 AS4、 AS5的分子式，由上海生工生物工程技术服务有限公司以a位带硫代磷酸酯键 的dNTP作为原料,用标准的DNA自动合成仪合成硫代反义寡核苷酸AS1 AS5。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测寡核苷酸的纯度，实验采用的条件是缓冲溶液 为Tris(三羟甲基氨基甲烷)-硼酸一EDTA，及凝胶浓度30%的变性聚丙酰胺凝胶,通 过分子筛效应电泳分离合成的寡核苷酸及其合成失败的序列,采用银染色法显色呈现 分离的图谱,该电泳分离方法可以分离仅有一个核苷酸差异的寡核苷酸序列,加上灵敏 的银染色法显色技术,能够有效地检测到合成失败的序列.结果显色图谱上仅有一条 显色条带，表明纯化后的反义寡核苷酸纯度均高于99%。实施例2、反义寡核苷酸对POKEMON-pEGFP融合蛋白的抑制效果实验1、 POKEMON与pEGFP的融合质粒的构建从人宫颈癌HeLa细胞(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC)中克隆得到 POKEMON的阅读框架片断，将其亚克隆到pEGFP-N2报告质粒中，使其可以在哺乳 动物细胞中可以表达POKEMON-EGFP融合蛋白。1)细胞培养人子宫癌(Hela)细胞(购自美国典型培养物保藏中心,ATCC number: CCL-2) 用含体积分数为10%的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素及0.2 %NaHC03 的DMEM培养液，在37°C、体积分数为5 %的C02条件下常规培养。DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液非常适合于许多哺乳动物细 胞培养，是由无机盐组分、氨基酸组分、维生素组分等组成，其具体配方为每L培 养基中含有200.00 mg CaCl2， 0.10 mg Fe(N03)3-9H20， 400.00 mgKCl， 97.67 mg MgS04， 6400.00 mg NaCl， 3700.00 mg NaHC03， 125.00 mg NaH2P04-H20,4500mg 葡 萄糖，15.00 mg酚红(Phenol red) ， llOmg丙酮酸钠(SodiumPyruvate) ， 84.00 mg L-精氨酸盐酸盐(L-Arginine-HCl) ， 63.00 mg L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine 2HC1)， 584.00 mg L-谷氨酰胺(L-Glutamine) ， 30.00 mg甘氨酸(Glycine) ， 42.00 mg L-半胱氨酸盐酸盐水合物(L-Histidine HC1-H20)，105.00 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) ， 105.00 mg L-亮氨酸(L-Leucine) ， 146.00 mg 赖氨酸盐酸盐(L-Lysine-HCl) ， 30.00 mgL-蛋氨酸(L-Methionine) ， 95.00 mgL-苏氨酸(L-Threonine) ， 16.00 mgL隱色氨酸(L-Tryptophan) ， 104.00 mg L-Tyrosine 2Na 2H20， 94.00 mg L曙缬氨酸(L隱Valine) ， 4.00mg D-泛酸钙(D-Ca pantothenate)， 4.00mg氯化胆碱(Choline Chloride) ， 4.00mg叶酸(Folic Acid) ， 7.20mg肌醇(i-Inositol)，4.00mg烟酰胺(Niacinamide)，4.00mg维生素B6(盐酸吡多辛，Pyridoxine HC1)， 0.40mg维生素B2(核黄素，0,40)， 4.00mg盐酸硫胺(Thiamine HC1) ， pH 值7.2-7.4。2) 细胞总RNA的提取取出步骤l)培养得到的人子宫癌(Hela)细胞，吸去培养液(悬浮细胞需要离 心)，用适量PBS洗涤，加入lmlTRizol液，混匀，室温放置5min，吸出培养瓶内 的液体转移到1.5ml无Rase酶EP管内，每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，混匀， 室温放置2-3min。在12， 000g (2-8°C)离心15min。吸取水相于另一只1.5ml的EP 管内，加入等体积的异丙醇，室温放置lmin。在12， 000g (2-8°C)离心10min，此 时有RNA沉淀产生，弃去上清，加200-50011170%乙醇洗涤后，在7500g(4。C)离 心5 min.吸掉乙醇，用小Tip吸干液体。沉淀自然干燥5-10分钟，DEPC处理水20-30ul 加入，用枪打匀，55-6(TC水浴10分钟让总RNA完全溶解，测OD值得到人子宫癌 (Hela)细胞总RNA。3) RT-PCR克隆Pokemon以步骤2)得到的人子宫癌(Hela)细胞总RNA进行反转录，反应体系20ul， 包括Oligo(dt)l ul,人子宫癌(Hela)细胞总RNA 1 ug, DEPC水，置于7(TC5min， 然后置于冰上5min,加入DEPC水，5x缓冲液4 ul， 25mM MgCL24 ul，加入10mM dNTPl ul， RNA酶抑制剂20U和反转录酶1 ul,25。C5min,42X:60min，于70。C15min终 止反应，得到cDNA。结束后以cDNA作为模版进行PCR。Pokemon基因上游引物5 '-CTTAAGCTTGCCACCATGGCCGGCGGCGTGG-3'， 下游引物5'-CATGATATCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTTAC-3'。 PCR反应体系 为Pokemon上、下游引物各10umol/L,5X缓冲溶液10ul， 2mM dNTP 5 ul,甜菜碱和 DMSO各5 ul， 1 ul cDNA， 2.5U/LPrimer star聚合酶1 ul，总体系50 ul。
PCR循环 条件98。C变性10s， 70。C复性10s， 72。C延伸lmin， 40个循环。把所得PCR产物在70v，进行琼脂糖电泳，30min后，胶置于紫外灯下照射，小 心把DNA片段切下转入到1.5mlEP管内，称重EP管，近似确定体积。假设胶的密 度为lg/ml，于是凝胶的体积可通过如下方法的得到如凝胶薄片质量为0.2g，则体积为0.2ml，然后加入等体积的NJ缓冲液，把混合物置于55-65'C水浴中10min.,至胶 完全溶解混合均匀。将胶溶解后转移到胶回收柱内，8000g离心lmin，用SPW缓冲 液重复洗涤2次，最后加入DNA洗脱液将PCR产物洗下，10， OOOg离心lmin。 DNA产量计算把抽提样品稀释20倍，在260nm和280nm下测OD值。DNA浓度 =八26()><50><稀释倍数。4) POKEMON与pEGFP的融合质粒的构建将步骤3)得到的PCR产物用&oi V和/Z/"^III双酶切，克隆进pEGFP-N2质粒 的///"^m和I酶切位点，得到pEGFP-N2- POKEMON融合质粒；具体方法如下 所示① 将步骤3)得到的PCR产物的酶切PCR产物的酶切为45ul体系，回收DNA 25pl(0.4吗)，4.5 ul 10xbuffer K,(U5 ul Hindlll (15U/ pl)， 0.15 ul EcoRV(15U/ p1),15.2 ul H20， 37'C酶切3小时。② pEGFP-N2质粒酶切和产物纯化回收取12plpEGFP-N2质粒，6 pllOxbuffer M， 6nlHin亂5plNaAc (3mMPH5.2) ， 150ul乙醇于-20。C10min， 10, OOOg离 心5min,弃上清，沉淀加入55plTE溶解。结束后再加入55 pl TE溶解液，8^1 10xbuffer T， 8 pl BSA， 6Sma I ， 1 pl磷酸酶(CIAP) ， 37。C酶切3小时酶切。 酶切结束后，加入等体积NJ缓冲液，8000g， lmin,再加入SPW液8000g,lmin重复 一次，最后加入DNA洗脱液，10， OOOg,lmin.最后得酶切纯化产物。③ 酶切纯化PCR产物和质粒pEGFP-N2的连接连接体系为40ul，2 pl pEGFP-N2 (Hindlll, Smal) ， 34plPCR纯化产物(HindIII， EcoRV)，置于56。C水浴4min,冰上5min.再加入2 T4连接缓冲液，1 pl 50mM ATP， 0.5 pl T4连接酶，16。C连结 过夜。④ 感受态细胞的制备及连接产物的转化取过夜JM109菌液800ul， 3000g离心 5min,弃上清，加入50nl新鲜LB培养基，用枪吹打均匀，然后加入2^1质粒液(lUg^il)和2pl的CaCl2，冰上放置30min， 42。C水浴热休克60-120s，结束后，放 置于冰上2-3min，加入lmlLB液，然后再摇床上摇45min,结束后，在3000g离心 5min，除去部分上清液，剩余大约100pl左右液体，加入12nlAMP，滴加平板上进 行涂布，正向平板放置30min,然后倒置平板7-8小时。⑤ 挑克隆并小提阳性克隆细胞在20个LB平板底部标上1， 2， 3， 4....20。取 20只中型离心管，每管加入1.5ML含有(60jig/mL)卡那霉素的LB培养基，用已 经灭菌的牙签分别挑取上述连接产物转化后长出的不同菌落在标有数字的平板上划 线(必须一一对应)，划线后的牙签放置于中型的离心管内(也必须是管号和平样板上的数字一一对应)，划线后的培养皿37'C过夜或放置10小时，中型离心管摇床上 过夜(37°C)或者把摇床上培养过夜的液体转移到新的小离心管内，在3000g离心 6min，弃上清液体，沉淀提取质粒，用5amHI酶切鉴定，筛选连接正确的质粒。将 5amH I酶切鉴定正确的质粒进行测序结果表明，我们己经克隆得到POKEMON阅读 框架序列,并正确地装进pEGFP-N2质粒中，将测序表明正确的含有POKEMON片段的 重组质粒命名为pEGFP-N2-POKEMON。 pEGFP-N2-POKEMON在细胞中，可表达 Pokemon-GFP融合蛋白。2、反义寡核苷酸AS1、 AS2、 AS3、 AS4对POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效果以脂质体Lipofectamine2000 (Invitrogen)作为转染试剂,将反义寡核苷酸AS1 (式I ) 、 AS2 (式n) 、 AS3 (式in) 、 AS4 (式IV)和对照寡核苷酸 AS5( ATGTAGTCGTCTGCCTAG )(浓度均为40nmol/L)与融合质粒pEGFP--N2-POKEMON共转染猴肾成纤维COS-7细胞(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC number: CRL-1651) ， 24h检测荧光强度。具体方法如下所述1) pEGFP-NrPOKEMON质粒和反义核苷酸共转染取指数生长期的COS-7细胞，于37t:,包含有10%胎牛血清，青霉素100mg/ml 和链霉素100mg/ml的DMEM培养基，5% C02的培养箱中培养。细胞转染前一天， 细胞用胰酶消化并用无抗生素的培养基悬浮，以每孔"105个COS-7细胞的密度铺 入24孔板内继续培养24小时。培养24小时后，将实施例1制备的反义核苷酸AS1、 AS2、 AS3、 AS4禾P AS5 分别以终浓度均为40nmol/L加入50^1无双抗的优化培养基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司产品)中混匀静止5min得到浓度均为 40nmol/L的AS1、AS2、AS3、AS4和AS5溶液,同时取2.5|xl脂质体Lipofectamine-2000 加入另外一个含有48.5|il无双抗的优化培养基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司产品)中混匀静止5min，结束后将上述配制的稀释后的 脂质体分别与反义苷酸AS1、 AS2、 AS3、 AS4或AS5溶液等体积混合，分别同时补 加0.4昭的pEGFP-N2-POKEMON质粒，然后分别将混和液按照100^1 /孔的量加入到 上述铺入COS-7细胞的24孔板内，以AS5与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染细 胞做对照组，检测上述实验组和对照组培养24h后的荧光强度。上述步骤l)的处理和步骤2)的处理的实验结果如图l所示，其中，
图1中A为对 照(AS5)与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染结果，B为ASl与pEGFP-N2-POKEMON 质粒共转染结果，C为AS2与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染结果，D为AS3与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染结果，E为AS4与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染 结果。结果表明，在COS-7细胞内，共转染pEGFP-N2-POKEMON和ASl、 AS2、 AS3 或AS4反义核苷酸。通过荧光显微镜观察，发现四种的反义核苷酸对Pokemon的抑制 存在显著差异。从图1中可看到AS2 (图1中C)和AS4 (图1中E)荧光强度弱于AS1 (图1中B)和AS3 (图1中D)的荧光强度，这说明AS2和AS4抑制效率比AS1和AS3 的抑制效率高。使用Image-proplusv5.02对荧光强度进行分析计算，AS2和AS4对 pEGFP-N2-POKEMON表达的POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效率分别是74%和 78%，同样说明，AS2和AS4对POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效率比ASl和AS3的 抑制效率高，并且AS4抑制效率最高，结果表明AS4可以作为治疗Pokemon表达引发 的疾病的药物，如癌症等。
权利要求
1、一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸，其分子式为下述式I至式IV中之一5’CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx 3’(式I)；5’CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx 3’(式II)；5’GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx 3’(式III)；5’TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3’(式IV)；其中，式I至式IV中，x均指硫代磷酸酯核苷间键；y均指磷酸二酯核苷间键；A均指2’-脱氧腺苷；T均指胸苷；C均指2’-脱氧胞苷；G均指2’-脱氧鸟苷。
2、 权利要求l所述的反义寡核苷酸在制备对POKEMON基因表达进行调节、调整 或抑制药物中的应用。
3、 权利要求1所述的反义寡核苷酸在制备治疗POKEMON基因过表达所引起的疾 病的药物中的的应用。
4、 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述药物是以权利要求l所 述的反义寡核苷酸为有效成分。
5、 根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物通过经脉或皮下给药治疗。
6、 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述药物通过局部给药治疗。
7、 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述给药治疗与放射疗法结合。
8、 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述给药治疗与化学疗法结合。
全文摘要
本发明公开了一种特异性调节POKEMON基因表达的反义寡核苷酸及其应用。该反义寡核苷酸，为下述化学式所示物质之一CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx；CxGxCxTxGxAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx；GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx；TxTxCxAxGxGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx；TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx。x指硫代磷酸酯核苷间键。本发明的反义寡核苷酸可作为用于制备治疗POKEMON高表达引起的疾病的的基因治疗药物。
文档编号A61K48/00GK101275135SQ20081008905
公开日2008年10月1日 申请日期2008年4月15日 优先权日2007年4月20日
发明者楠 张, 蒋宇扬, 谢振华 申请人:清华大学深圳研究生院