专利名称：整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种整合质粒pOPHI，以及一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。
背景技术：
分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物,有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能 抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。卡介苗(BCG)就是Calmette和Guerin 2人(1908)将牛结核分枝杆菌在含甘油、胆汁、马铃薯的培养基中经13年230次传代而获得的减毒活疫苗株，现广泛用于预防接种。根据菌落色素与生长速度可将非结核分枝杆菌分为4组。第IV组迅速生长菌。在25 45°C生长。生长快，培养5 7 d即可见到菌落，菌落粗糙，有的并能产色。耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)即是其中一种。结核分枝杆菌(Mtb)是引起结核病的病原菌,可侵犯全身各器官,但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病，全世界现在每年因结核病死亡约200万人。结核分枝杆菌生长缓慢，难于对其进行遗传操作，需要昂贵的带负压的3级生物安全实验室，长时间培养不仅占用空间而且容易污染等等使结核分枝杆菌的研究耗时耗财耗力。以抗Mtb药物的研发为例，抗Mtb药物的研发昂贵且周期长。近半个世纪以来尚无一种新作用机制的药物用于临床治疗。研究抗Mtb药物最核心的难题之一就是缺乏有效，快速和廉价的模型，特别是体内模型。目前最常见的抗Mtb药物体外筛选是利用表达荧光素酶[1]或绿色荧光蛋白(GFP:Green fluorescent protein) [2]的重组菌或利用染料阿尔玛蓝(alamar blue)可以区分活菌与死菌的特性[3]进行筛选。其中，表达细菌荧光素酶操纵子的重组菌因为不需要加入底物或进行诱导，自身即可实现发光，故称之为自主发光菌。之前构建的自主发光的Mtb并发现利用该菌可简单，快速，经济地进行大规模抗Mtb药物体外筛选和连续检测药物/疫苗在活体小鼠的效果。该发明可极大减少体外对药物筛选、评价及对药物和疫苗体内效果评价中所需的时间，精力，动物，花费等，特别是对抗Mtb药物的研发可能具有变革意义。现有技术构建的自主发光的Mtb是通过电转化人工构建的质粒，然后将自主发光元件框整合到Mtb基因组中从而使之发光。现有技术方案的实现方式现有技术方案主要是利用整合质粒PTYOKm。该质粒含有荧光素酶操纵子基因卡那霉素抗性基因、整合酶基因// 。:荧光素酶操纵子，该系列基因的表达使得宿主菌可以自主发光。整合酶基因可以表达出整合酶,将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。将此质粒电转化入Mtb菌中，使用卡那抗性筛选出阳性克隆，并检测到发光，即获得目标菌株。但该菌株由于含有卡那霉素抗性基因，在药物筛选/评价中，可能存在交叉抗性。由于对分枝杆菌进行遗传操作，仅有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因比较有效。因此，利用可自主发光分枝杆菌进行研究时，如果所用菌株具有抗性基因，这会对以后的遗传操作带来不便。例 如，基因敲除/遗传互补一般至少需2种抗性基因；重组工程技术也需要至少2种抗性基因等
发明内容
本发明的一个目的是提供一种整合质粒pOPHI。本发明的另一个目的是提供一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。本发明所采用的技术方案是
整合质粒pOPHI，其包括启动子，发光所需酶基因(ΖμΩΜΜ)，整合酶基因(7/ )和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列仿了/ 和Di/I，以及噬菌体整合位点{attP、和复制子。所述启动子为汉s/7仰启动子。所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因(场叉)，其序列如SEQ ID NO:9所示。所述仿YTP和仿YI的序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。所述复制子为大肠杆菌复制子ir印)。整合质粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示。整合质粒pOPHI的构建方法，包括如下步骤
1)构建质粒pP:起始质粒pbluelnt用限制性内切酶AiI消化后，回收3. 6 kb片段，加入连接酶使其自身环化，得到3. 6 kb的质粒pP ；
2)构建质粒pOP:用限制性内切酶Kpnl和通ol消化质粒pP，得到3. 6 kb功能片段；用限制性内切酶Kpnl和ZAoI消化质粒pluxOK ;回收6. 3kb的功能片段Kpn I-Hsp60~luxCDABE-Xho I ;将上述2种功能片段进行连接，得到9. 9 kb的质粒pOP ；
3)构建质粒pU⑶is用限制性内切酶治7/ 1和历'fldIII消化质粒pUC19，回收2. 6 kb的功能片段，将其与DifL (SEQ ID N0:2)、DifR (SEQ ID NO:3)进行三片段连接，得到2. 7kb的质粒ptXDis ；
4)构建质粒PU⑶I:将质粒pU⑶is用ZhI和Cleil消化，得到2. 7kb的功能片段A ；以质粒 pbluelnt 为模板，用引物 Int-f (SEQ ID NO:4)与引物 Int-rl (SEQ ID N0:5)扩增出I. 3kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int经酶切C al和Clal切)后与功能片段A进行连接，得到4. O kb的质粒pUCDI ；
5)构建质粒PU⑶IH:质粒pU⑶I用油al消化，连入油al消化的 片段(SEQ IDNO:9)，得到 5. I kb 的质粒 pUCDIH ；
6)构建质粒pOPHI 用限制性内切酶通ο I消化质粒pOP，回收9. 8 kb的功能片段，用限制性内切酶通ol消化质粒pU⑶IH，得到2. 5 kb的功能片段将上述2个功能片段进行连接，得到12. 3 kb的质粒pOPHI。一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，由以下方法制备得到
O电转化法将权利要求I 6任一项所述的整合质粒pOPHI转入分枝杆菌中，获得自主发光分枝杆菌；
2)将获得的自主发光分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌(Mycobac teri um. smegma tis),结核分枝杆 舊(Mycobacterium, iMercWo1Si1S),卡介苗(Mycobacterium, bovis海分枝杆菌{Mycobac teri um. aari/ 應),或布鲁 _坏死分枝杆菌(IcoAacieritta ulcerans )等。步骤2)的具体操作为将步骤I)得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37°C培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含潮霉素(Hyg)的7H11板上，37°C培养，挑取在Hyg板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Hyg板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆。本发明的有益效果在于
1)本发明制备得到的质粒pOPHI可转入各种分枝杆菌中，从而得到可自主发光的分枝杆菌，可通过细菌的发光与否来判断其死活，可用于多种实验检测，能快速得到可信的实验数据；
2)本发明的无抗性筛选标记自主发光分枝杆菌可用于体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，1-3天便可以看出抑菌和杀菌活性，灵敏度高，重复性强。利用本发明的自主发光分枝杆菌，可以连续对感染的小鼠进行活体、动态、无创体内药物检测和评价，不仅利用动物少，而且更具有统计学意义。该方法还具有简便易行可以进行大规模体内筛选等优点，检测一只小鼠仅需3秒时间，一个人一天可以麻醉并检测500只以上的小鼠。如果对所用检测仪进行改进，甚至无需麻醉小鼠即可进行活体检测。我们用该菌株对作用机制不同的7种抗Mtb药进行体内活性检测，发现给药后I到2天即可判断其有无体内药物活性，3到4天即可以判断该药是具有抑菌还是杀菌活性。所需化合物量少；
3)相对于现有的具有抗性标记的自主发光分枝杆菌，本发明的自主发光分枝杆菌因为没有抗性基因，所以更加更加适用于大规模操作(抗性基因的表达可能对菌的生长，对药物的敏感性等有一定的影响)。
图I质粒pP、pOP的构建流程 图2质粒pU⑶IH构建流程 图3质粒pOPHI构建流程 图4质粒pNBVl酶切图谱；
图5质粒pOPHI的酶切图谱；图6发光菌形态 图7将转化后所获得的发光菌进行传代的示意 图8将传代后的发光菌分别涂布含Hyg平板和无抗生素平板示意 图9进一步验证筛选获得的发光菌株抗性已丢失。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J, Russell Dff, Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002,北京科学出版社)。 以下实施例中PCR反应所用的pfu酶、dNTP以及相关试剂均购买自上海生工生物有限公司；抗生素潮霉素购自罗氏公司；大肠杆菌感受态DH5a购买于广州东盛生物科技有限公司，货号为C1042 ;DNA连接反应均采用Takara宝生物公司的T4 DNA连接试剂盒，型号D6020A ;质粒DNA提取试剂盒(BSCOIMl )、DNA回收试剂盒(BSC02M1)、PCR纯化试剂盒(BSC03M1)购自博日生物公司。实施例I
构建整合质粒pOPHI，构建流程见图I 3，质粒pOPHI的图谱见图5。如图5所示，质粒pOPHI含有分枝杆菌强启动子0 / 仰)，发光所需酶基因UuxCDABE、，整合酶基因ilnt)和潮霉素抗性基因(Myg)的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DiH菌体整合位点(^的，以及氨苄青霉素抗性基因(如/ττ)和复制子(Tfe/7)。各元件的功能如下
Z&/7份？ 一种分枝杆菌强启动子，可以启动后续基因的强表达。LuxCDABE :发光所需酶基因，该基因的表达使得宿主菌可以自主发光[5]。整合酶基因:可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。整合酶的作用是可逆的，即它既可以将含有的序列的质粒整合到基因组立点，也可以再将其解离下来。因此，在最终的目标菌中如不含有该基因，不会起到解离作用，则构建的菌株可能更稳定。潮霉素抗性基因(Myg)潮霉素抗性基因(Myg、是一种选择标记，用于筛选获得目的菌株。潮霉素抗性基因(Myg)在分枝杆菌和大肠杆菌中表达后，可使宿主获得对潮霉素(hygromycin,缩写为Hyg)的抗性，即可在含有Hyg的培养基中生长。潮霉素是一种常用的抗性筛选药物，用于分枝杆菌的Hyg浓度为50ug/mL,用于大肠杆菌的Hyg浓度为200ug/
mLo同向重复序列 /i/:该序列可以被分枝杆菌自身的一种解离酶识别，并高效切除，因而可以在后续操作中去掉潮霉素抗性基因和整合酶基因。噬菌体整合位点{attP、:整合酶获得表达后，可通过结合此位点将整个质粒整合进分枝杆菌的基因组中的位点。即此位点的主要作用是被整合酶结合，起整合到基因组的作用。氨苄青霉素抗性基因(办 /TT):是一种筛选标记，但只在大肠杆菌等细菌中起作用，在分枝杆菌中无作用，因为分枝杆菌对氨苄青霉素天然耐药。复制子0 ):负责质粒在大肠杆菌中复制的元件。质粒pOPHI的具体构建方法如下
I、质粒PP的构建
起始质粒pbluelnt(由美国约翰霍普金斯大学,Eric Nuermberger教授惠赠,其质粒图谱见图1，具体构建方法见参考文献4 )用限制性内切酶AiI消化后，去掉功能片段hi，使之成为残存的无功能的Int，,回收3. 6 kb的片段，加入连接酶使其自身环化，得到3. 6kb的质粒pP (见图1)，转化大肠杆菌感受态DH5ci，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用限制性内切酶AiI酶切鉴定质粒pP，正确的质粒卩？可切下3.6 kb左右的单一条带。2、质粒pOP的构建
用限制性内切酶和通Ol消化质粒pP，凝胶回收试剂盒回收3. 6kb的功能片段；用限制性内切酶治和％01消化质粒pluxOK(由美国约翰霍普金斯大学,Eric Nuermberger教授惠赠，其质粒图谱见图1，具体构建方法见参考文献4 )，回收6.3 kb的功能片段Kpn I -Hsp60~l uxCDABE-Xho I ;将上述2种功能片段进行连接，得到9. 9 kb的质粒pOP(见图1)，转化大肠杆菌感受态DH5ci，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用限制性内切酶廣ZAoI酶切鉴定质粒pOP,正确的质粒pOP可切下3. 6kb和6. 3 kb两个条带。3、质粒ptXDis的构建
1)用限制性内切酶治和历‘/7(1111消化质粒PUC19，回收2.6kb的功能片段；
2)由上海捷瑞生物工程有限公司合成觅/1(SEQ ID NO: 2)和仿YTP (SEQ ID NO: 3)片段，合成的两端带有HindIII和XbaI酶切位点，仿YTP两端带有XbaI和KpnI酶切位占.
3)将pUC19酶切后的2. 6kb功能片段和片段进行三片段连接，得到2. 7kb的质粒PUCDis (见图2)，然后转化大肠杆菌感受态DH5 α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，用限制性内切酶&0RI酶切鉴定质粒pUCDis，正确的质粒可切下
2.7kb左右的单一条带。4、构建质粒 ptXDI
1)将质粒PU⑶is用ZhI和Cleil消化，得到2.7kb的功能片段；
2)以质粒pbluelnt 为模板，用引物 Int-f (SEQ ID N0:4)与引物 Int-rl (SEQ IDNO: 5)扩增出 I. 3kb 的 (SEQ ID NO:6)片段；
3)片段Int经油al和Clal酶切后与pTCDis酶切后得到的2.7kb功能片段进行连接反应，得到4. Okb的质粒pUCDI (见图2)。转化大肠杆菌感受态DH5 α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，用限制性内切酶油al和CZaI酶切鉴定质粒pUCDI，正确的质粒pU⑶I可切下2. 7kb和I. 3kb两个条带。5、构建质粒 pUCDIH
I)以质粒pNBVl (由美国约翰霍普金斯大学William Bishai实验室惠赠，质粒图谱见图4，具体构建方法见参考文献6)为模板，以引物hyg-f (SEQ ID NO: 7)和hyg_r (SEQ IDNO:8)扩增获得 片段，将该 片段送上海捷瑞生物工程有限公司进行突变，将片段中仅有的一个酶切位点(GGTACC)突变为GGTACA ;将片段中仅有的I个&0RI酶切位点(GAATTC)突变为GAATTA，从而去掉了内部的命/71和及位点，最后序列见SEQ ID N0:9,序列首尾均为及《1酶切位点。2)质粒pUCDI用油al消化，回收约4. O kb的片段， 片段(SEQ ID N0:9)用油al消化，回收约I. I kb的片段，将上述两个片段进行连接，得到5. Ikb的质粒pU⑶IH(见图2)，转化大肠杆菌感受态DH5ci，利用含Hyg抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，扩大培养，提取质粒，用限制性内切酶油a I酶切鉴定质粒PU⑶IH，正确的质粒pU⑶IH可切下
4.Okb和I. Ikb两个条带。6、质粒pOPHI的构建
1)用限制性内切酶通ol消化质粒pOP，回收约9.8 kb的载体片段；2)用限制性内切酶沿ol消化质粒pUCDIH，回收2.5 kb的片段DifL-Int-Hyg-DifR ；
3)将上述两个片段进行连接，得到12.3kb的质粒pOPHI (见图3)，转化大肠杆菌感受态DH5 α，利用含Hyg抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，酶切鉴定出正确的克隆即为质粒pOPHI。用限制性内切酶通ο 酶切鉴定质粒pOPHI，正确的质粒pOPHI可切下9. 8 kb和2. 5kb两个条带。实施例2
一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌的制备方法
本实施例涉及的7H9培养基、7H11培养基、吐温80均购自广州华奇盛生物公司。Biorad 电转化仪(Biorad GenePulser Xcell)以及电转杯购自 Biorad 公司。I.需要准备的材料
I)耻垢分枝杆菌(Mycobacterium.),可从中国普通微生物菌种保藏管理中
心获得，编号为I. 2621。2) 10% 甘油+0.05% Tween 80 [20ml 甘油+180 毫升水+IOOul Tween 80，并用0.2Mm滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过I周。3)灭菌的玻璃珠,50ml离心管，Biorad的O. 2cm的电转杯,25 ml移液管。4)50ml长好的对数期的菌液[菌液的OD值，达到O. 6-1. 3]。带滤芯的Iml枪尖。2.电转化
I)将待转菌(耻垢分枝杆菌,妙〃0如<^6 /^應.接种至含有50 mL 7H9 (含O. 1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37°C摇菌扩增。冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml离心管复壮，待长起之后，需取>2ml，接种到含有50 mL 7H9 (含O. 1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；
菌落需刮取上百个菌落加入含有50 mL 7H9(含O. 1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；
普通生长的或在4°C保存的菌，接种时可以取I至5ml加入含有50 mL 7H9 (含0. 1%tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。2)检测菌液的OD值，若达到0.6-1. 3，则可进行电转化。3)将40ml菌液转至50 mL离心管中，加入1(Γ13颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后[目的是将菌团块打散]，于4°C离心机中6000 rpm离心8分钟。4)加入40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于4°C离心机中6000 rpm离心8分钟。5)重复步骤4) 2次后，留约I mL上清，用带滤芯的枪尖，吹吸充分混匀后于冰上放置。6)于标记好的O. 2cm的电转杯中，分别加入10 μ 浓缩后的质粒pOPHI和200 μ 分枝杆菌感受态细胞。轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置10分钟，加入电转仪前擦尽电转杯上的水分。7)用Biorad电转化仪进行电转化，以电压2. 5KV、电阻1000 Ω、电容25PF脉冲波进行电转化。未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于If 21秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸。8)迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2 mL 7H9(含吐温80)培养基(先用I mL转移电转液，再用I mL洗漆电转杯)，转移至50mL离心管中。
·
9)于37度孵箱中孵育4 12小时，充分复活细菌并使其抗性表达。10)用带滤芯的枪尖吹吸混勻后，lml/1. 5ml tube分装,10000 rpm离心I分钟沉淀转化菌，弃上清，用O. 6 mL 7H9培养基重悬后，以500 PL/板铺于含抗生素[50ug/mlHyg]的7H11培养板中。同时稀释一百倍后，500 PL/板铺Hyg板。11)避光于37°C孵箱培养。备注待转菌为耻垢分枝杆菌时，所用到的试剂及耗材均需于4°C预冷，电转全过程需冰浴中完成。培养耻垢分枝杆菌的7H9 /7H11可以加放线菌酮，羧苄青霉素，浓度均为 50ug/mL。上述操作中的待转菌除了可用耻垢分枝杆菌(Mycobacterium, smegma tis)夕卜，还可选用其它的分枝杆菌如结核分枝杆菌(Mycobac teri um. tuberculosi s ),卡介苗(Mycobac teri um. bovis 皮7( ),海分枝杆菌布鲁 _ 坏死分枝杆菌(.Mycobac teri um. ulcerans )等等。3、检测平板上生长出的单克隆菌落发光值的大小
I)将Hyg板上生长的单个菌，挑取到含有IOOuL 7H9培养基的I. 5mL离心管中，混匀后，将离心管放入发光检测仪器(普洛麦格公司的GL0MAX2020)，检测发光值大小。根据经验，一般发光值在100以下的可认定为不发光，发光值在IO5或更高的可认定为发光很强。2)对于发光很强的单个菌落，在暗室中，凭肉眼可以看到明显的蓝色荧光(见图6)。4、选取发光值在IO5或更高的单克隆进行传代，筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为目标菌株。具体筛选方法如下(图7 9):
I)连续传代摇菌培养
从平板上，挑取发光值在IO5或更高的单克隆接种到5mL7H9培养基中，摇床振荡培养约2天。将培养所得的菌液适当稀释后，进行铺板，以每个平板上长出5 50个菌落为宜。平板37°C培养3天后观察，挑取100-200个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含50ug/mL Hyg的7H11板，并对应编号；
放置37°C培养箱培养3天左右，可观察在Hyg板上是否有未长出的克隆，而在相应的无抗板上长出，挑取相应的克隆到5mL 7H9培养基中培养约2天，取500微升培养物铺于Hyg板(50ug/mL)，培养2 3天，若平板上无单克长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆，即丢失潮霉素抗性基因(办^)和整合酶基因的克隆(图8、图9)。利用上述制备得到的菌株进行体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，1-3天便可以看出抑菌和杀菌活性，灵敏度高，重复性强。利用自主发光分枝杆菌，可以连续对感染的小鼠进行活体、动态、无创体内药物检测和评价，不仅利用动物少，而且更具有统计学意义。该方法还具有简便易行可以进行大规模体内筛选等优点，检测一只小鼠仅需3秒时间，一个人一天可以麻醉并检测500只以上的小鼠。如果对所用检测仪进行改进，甚至无需麻醉小鼠即可进行活体检测。我们用该菌株对作用机制不同的7种抗Mtb药进行体内活性检测，发现给药后I到2天即可判断其有无体内药物活性，3到4天即可以判断该药是具有抑菌还是杀菌活性。所需化合物量少。
参考文献
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[6]Howard NS，Gomez JEj Ko C，Bishai WR. Color selection with ahygromycin-resistance-based escherichia coli-mycobacterial shuttle vector.Gene 1995:166:181-182。
权利要求
1.整合质粒pOPHI，其包括启动子，发光所需酶基因(ΖμΩΜΜ)，整合酶基因(Τ/7 )和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列仿了/ 和Di/I，以及噬菌体整合位点{attP、和复制子。
2.根据权利要求I所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述启动子为/&/7抑启动子。
3.根据权利要求I所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述抗性筛选基因为潮霉素抗性基因(场叉)，其序列如SEQ ID N0:9所示。
4.根据权利要求I所述的整合质粒pOPHI,其特征在于,所述/7//7P和Di/I的序列如SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3 所示。
5.根据权利要求I所述的整合质粒pOPHI，其特征在于，所述复制子为大肠杆菌复制子(.rep) ο
6.根据权利要求I所述的整合质粒pOPHI，其核苷酸序列如SEQID NO: I所示。
7.整合质粒pOPHI的构建方法，包括如下步骤 1)构建质粒pP:起始质粒pbluelnt用限制性内切酶I消化后，回收3.6 kb片段，加入连接酶使其自身环化，得到3. 6 kb的质粒pP ； 2)构建质粒pOP:用限制性内切酶Kpnl和通ol消化质粒pP，得到3. 6 kb功能片段；用限制性内切酶Kpnl和ZAoI消化质粒pluxOK ;回收6. 3kb的功能片段KpnI-Hsp60~luxCDABE-XhoI ;将上述2种功能片段进行连接，得到9. 9 kb的质粒pOP ； 3)构建质粒pU⑶is用限制性内切酶治7/ 1和历'fldIII消化质粒pUC19，回收2. 6 kb的功能片段，将其与DifL (SEQ ID N0:2)、DifR (SEQ ID NO:3)进行三片段连接，得到2. 7kb的质粒ptXDis ； 4)构建质粒PU⑶I:将质粒pU⑶is用ZhI和Cleil消化，得到2. 7kb的功能片段A ；以质粒 pbluelnt 为模板，用引物 Int-f (SEQ ID NO:4)与引物 Int-rl (SEQ ID N0:5)扩增出I. 3kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int经酶切C al和Clal切)后与功能片段A进行连接，得到4. O kb的质粒pUCDI ； 5)构建质粒PU⑶IH:质粒pU⑶I用油al消化，连入油al消化的场^ 片段(SEQ IDNO:9)，得到 5. I kb 的质粒 pUCDIH ； 6)构建质粒pOPHI用限制性内切酶通ο I消化质粒pOP，回收9. 8 kb的功能片段，用限制性内切酶通ο I消化质粒pU⑶IH，得到2. 5 kb的功能片段将上述2个功能片段进行连接，得到12. 3 kb的质粒pOPHI。
8.一种无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，由以下方法制备得到 O电转化法将权利要求I 6任一项所述的整合质粒pOPHI转入分枝杆菌中，获得自主发光分枝杆菌； 2)将获得的自主发光分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。
9.根据权利要求8的制备方法，其特征在于，所述分枝杆菌包括耻垢分枝杆菌(Mycobacterium. smegmatis), €t亥If 胃(Mycobacterium. tuberculosis), ^(Mycobacterium. bovis 皮7( ),海分枝杆菌或布鲁_坏死分枝杆菌 iMycobac teri um. ulcerans )。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2)的具体操作为将步骤I)得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37°C培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含潮霉素(Hyg)的7H11板上，37°C培养，挑取在Hyg板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Hyg板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选 所得相应克隆是正确的丢失Hyg抗性的克隆。
全文摘要
本发明公开了一种整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌，所述整合质粒pOPHI包括启动子，发光所需酶基因(LuxCDABE)，整合酶基因(Int)和抗性筛选基因的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点(attP)和复制子。整合质粒pOPHI转入分枝杆菌后，经过传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌。构建得到的无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌可通过细菌的发光与否来判断其死活，可用于多种实验检测，能快速得到可信的实验数据。
文档编号C12N15/66GK102719471SQ20121018300
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者张天宇 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院