专利名称：产土臭素的菌株的制作方法
技术领域：
一种结合闻香手段从制曲过程中筛选白酒中微生物代谢相关的香气物质产生菌的筛选及运用该方法筛选土霉味物质土臭素(geosmin)产生菌的筛选鉴定及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
白酒是我国特有的一种蒸馏酒，并深得消费者的喜爱。白酒香味成分复杂是众所周知的，每种白酒都是由几百种香味成分组分的集合体。而这些呈香物质的来源，与白酒的生产过程是离不开的。白酒中香味物质的形成，不仅是微生物将淀粉、蛋白质等物质转化而生成醇、醛、酸、酮、酯等物质，同时与酿制过程中的原料选择、制曲工艺、酿酒工艺及操作过程密切相关。不同的白酒所采用的原料和辅料各有差异，而不同的原料的组分也有很大的差异，这就 为白酒香味物质提够了丰富的前驱物。如大米中富含醇、醛、酮、酸、酯、酚、内酯类、乙缩醛类、呋喃类、吡嗪类、噻吩、噻唑类等化合物；玉米中富含芳香族化合物；豌豆中富含吡嗪类化合物等。粮谷原料中的淀粉、蛋白质、脂肪、单宁、果胶质及辅料中的木质素等成分经微生物发酵后的代谢产物基本上都是白酒的香味成分。乳酸、乙酸和高级醇类等来自粮谷中淀粉的降解和转化，高级脂肪酸乙酯来源于粮谷中脂肪酸的酯化，甲醇由果胶质酶解而得，等
坐寸ο相对于同是蒸懼酒的威士忌(whiskey)、白兰地(brandy)和兰姆酒(rum)而言,我国的白酒属多菌种发酵，微生物包括大曲微生物、窖泥微生物还有空气微生物，所以白酒的香味成分是数量众多的霉菌、酵母菌和细菌等微生物相互作用形成的特定微生态结构，进而代谢产生的挥发性代谢产物的结果。这就造就了白酒的香味成分不但种类繁多，含量微少，且每种白酒中的香味成分的种类和含量都不相同。含量微少、种类繁多的香味物质在每种白酒的酒体中有自己一套既复杂又微妙的香和味的关系。因此，确定每种白酒典型风格最重要的风味构成组分，明确各香味组成成分在白酒酿造过程中的来源及产生条件，从而在源头控制白酒中的各香气的含量及比例，对提闻白酒风味品质具有深远影响。
发明内容
针对现有技术难点及存在的问题，本发明的目的在于提供一种结合闻香手段，从制曲过程中筛选白酒中微生物代谢产生的香气物质的相关菌株的筛选及鉴定方法。该方法可快速有效地从白酒生产过程中，如制曲过程及其周围环境中筛选产白酒中目的香气物质的菌株。应用该方法，成功从清香型白酒厂生产的大曲中筛选得到四株产geosmin的菌株，分别命名为LBG-FXJ、FJ-HX、QC-I和QC-2，根据其菌落、细胞形态和生理生化特征以及16SrRNA基因序列比对结果，该四菌株均为链霉菌()，其中LBG-FXJ为白色链霉菌(albus、, FJ-HX 为弗氏链霉菌(Sire/ fradiae、。这四菌株在土豆-葡萄糖培养基中均能大量积累土霉味物质geosmin。解决了清香型白酒中土霉味物质geosmin来源的问题。筛选得到的四株链霉菌可以作为模式菌，用于白酒生产中产geosmin菌株的检测及其产生机理的研究。本发明的技术方案产土臭素的菌株，共四株，分别为
(1)分类命名为白色链霉菌LBG-FXJ,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4206 ；
(2)分类命名为弗氏链霉菌fradiae) 已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4205 ；
(3)分类命名为链霉菌sp.) QC-I,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4535 ；
(4)分类命名为链霉菌sp.) QC-2,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4536。所述产土臭素的菌株的筛选方法，结合闻香手段从制曲过程中筛选白酒中微生物代谢相关的香气物质产生菌的筛选方法，以风味为导向，结合嗅觉感官，筛选能够代谢白酒中相关香气物质的微生物；
所采取的筛菌策略为将大曲的菌悬液稀释涂布到分离培养基上，30°C培养4天后，挑取单菌落接入灭菌后加水量为麸皮质量50%-150%的麸皮管中，30°C培养7天后，经过2-3个事先经培训，熟知目的香气的闻香人员闻香检测，初步筛选从中发现有目的香气的管子；将该管中的一部分发酵产物进行气相色谱-闻香仪(GC-O)和气相色谱-质谱(GC-MS)检测，进行进一步验证，确定具有目的香气化合物后，将该管中的微生物进行分离，得到产目的香气物质的目的菌株；
所述产目的香气物质的目的菌株为上所述产土臭素的菌株；
选取麦芽汁琼脂为分离培养基，选取PH为6. O的麦芽汁琼脂用于霉菌、酵母的筛选；选取pH为8. O的麦芽汁琼脂用于放线菌、细菌的筛选；
添加质量分数O. 1%的Triton-100到分离培养基中，防止菌丝扩散，从而形成单菌落，易于挑取。所述产土臭素的菌株的应用，筛选得到的四株产土臭素的链霉菌可以作为模式菌，用于白酒生产中产geosmin菌株的检测及其产生机理的研究。为了模拟制曲过程的培养条件，使分离到的纯种菌株尽可能再现曲中的生长状态，制作了“固体麸皮管”。从而避免由于培养条件不同导致微生物代谢产物不同的因素。固体麸皮管制备50g麸皮，25-75g水，混合均匀。装入试管中，压实至试管约2/3处。115°C下，灭菌15min。为确定该培养方式是否能够使曲中产geosmin的微生物在该培养条件下产geosmin,做以下试验
取Ig曲粉，加到20mL无菌生理盐水，玻璃珠打匀。将菌悬液按十倍比例逐次稀释至不同浓度梯度。取0. 5mL各梯度菌悬液至不同固体麸皮试管中，30°C静置培养。菌悬液浓度较高的在5-7天出现该气味，菌悬液浓度较低的在10-15天出现该气味。说明该培养方式能够使产geosmin的微生物生长并产生该物质，可以作为筛选验证方法。同时，在筛菌过程中发现，涂布平板后，最先长出的是羽绒状的丝状菌，并且迅速、生长，覆盖其他类型菌落。从而不能将涂布产生的单菌落挑取，限制了可分离菌株的数量。为去除霉菌蓬松的菌丝体的干扰，添加O. 1%的Triton-ΙΟΟ，可以有效防止防止菌丝扩散。从而形成单菌落，易于挑取。生物材料样品保藏
从清香型白酒厂生产的大曲中筛选得到四株产土臭素geosmin的菌株，分别命名为LBG-FXJ、FJ-HX, QC-I和QC-2，根据其菌落、细胞形态和生理生化特征以及16S rRNA基因序列比对结果，该四菌株均为链霉菌(泣其中LBG-FXJ为白色链霉菌(S trep tomyces albus ), F J-HX 为弗氏链霉菌(51 trep tomyces fradiae )。在申请日之前已送往中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，
LBG-FXJ保藏编号CGMCC No. 4206，保藏日期2010年10月8日。
FJ-HX保藏编号CGMCC No. 4205，保藏日期2010年10月8日。QC-I保藏编号CGMCC No. 4535，保藏日期2011年I月11日。QC-2保藏编号CGMCC No. 4536，保藏日期2011年I月11日。
图I麸皮中添加水的比例对微生物代谢产生geosmin的影响。图2产geosmin菌株FXJ发酵麸皮后风味质谱图。图3四株产geosmin菌的菌落形态。
具体实施例方式实施例I :
筛选方案确定
将大曲的菌悬液稀释涂布到分离培养基(麦芽汁琼脂)中。30°C培养4天后，挑取单菌落接入灭菌后加水50%-150%的麸皮管中，30°C培养7天后，经过2-3个事先经培训，熟知目的香气的闻香人员闻香检测。初步筛选从中发现有土霉味的管子。将该管中的一部分发酵产物进行GC-O和GC-MS检测，进行进一步验证。确定具有目的香气化合物后，将该管中的微生物进行分离。实施例2:
分离培养基的确定
由于在麦芽中各种微生物生长较快，利于缩短筛菌周期。且麦芽汁易于大量制备，从而可以保证筛菌培养基的稳定性。所以，选取麦芽汁琼脂为筛菌培养基。选取pH为6. O的麦芽汁琼脂用于霉菌，酵母的筛选。选取PH为8. O的麦芽汁琼脂用于放线菌，细菌的筛选。添加O. 1%的Triton-100，防止菌丝扩散。从而形成单菌落，易于挑取。实施例3
筛选产geosmin菌株培养基确定
为了模拟制曲过程的培养条件，使分离到的纯种菌株尽可能再现曲中的生长状态，制作了“固体麸皮管”。从而避免由于培养条件不同导致微生物代谢产物不同的因素。同时在研究过程中发现发霉麸皮中会有geosmin产生，所以考察了向麸皮中不同水的添加量对微生物产geosmin浓度的影响，从而确定最适合产geosmin的水添加量。由图I可知，向麸皮添加50°/Γ 50%的水均可以导致麸皮在自然条件下产生明显含量的geosmin，说明添加50°/Γ 50%的水是适合微生物geosmin的产生，所以确定添加50°/Γ 50%的水到麸皮中作为筛选培养基。实施例4
白酒大曲中产geosmin菌株的筛选
运用上述方法，从各酒厂生产的白酒大曲中，共分离到867株单菌株，将这些菌株进行单菌种麸皮管发酵，从中发现5株菌发酵后具有明显土霉气味。利用顶空固相微萃取结合气相质谱(HS-SPME-GC-MS)和气相色谱-闻香仪(GC-0)，将该发酵产物进行检测。通过比对土霉未知化合物与 geosmin 在 NIST 05 a. L Database (Agilent Technologies Inc.) >AMDIS、Wiley 275. L database中标准离子碎片图谱比对,直接添加geosmin标准品离子图谱等方法来确认检测土霉异味化合物。发现这五株菌的挥发性代谢产物谱中有明显的geosmin峰,说明geosmin为这五株菌的主要产物。这五株菌分别为清香型白酒厂A清巷 曲中和清香型白酒厂B红心大曲中各分离得到一株产geosmin的菌株，分别命名为FXJ和HX。从汾酒厂所用的清茬大曲中分离出三株产geosmin的菌株，分别命名为QC_1，QC-2，QC-3。实施例5
菌落形态特征观察
为进一步描述所筛选得到的五株菌，在PDA培养基中观察该菌的菌落形态特征，其结果如附图3。表I PDA培养基上的五株菌的菌落形态特征
权利要求
1.产土臭素的菌株，分类命名为弗氏链霉菌(5 /· /7 ο _75·/ra￡/iae)FJ-HX,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 4205。
2.权利要求I所述产土臭素的菌株的应用，其特征在于筛选得到的该株产土臭素的弗氏链霉菌用作模式菌，用于白酒生产中产geosmin菌株的检测及其产生机理的研究。
全文摘要
产土臭素的菌株，属于生物工程技术领域。本发明公开了结合闻香手段，以风味为导向，从制曲过程中筛选白酒中微生物代谢产生的香气物质的相关菌株的筛选及鉴定方法。应用该方法，成功从清香型白酒厂生产的大曲中筛选得到土臭素geosmin的菌株，命名为FJ-HX，根据其菌落、细胞形态和生理生化特征以及16SrRNA基因序列比对结果，该菌株为弗氏链霉菌(Streptomycesfradiae)。其在土豆-葡萄糖培养基中能大量积累土霉味物质geosmin。解决了清香型白酒中土霉味物质geosmin来源的问题。筛选得到的弗氏链霉菌可以作为模式菌，用于白酒生产中产geosmin菌株的检测及其产生机理的研究。
文档编号C12Q1/04GK102719376SQ20121018180
公开日2012年10月10日 申请日期2011年4月8日 优先权日2011年4月8日
发明者徐岩, 杜海, 范文来 申请人:江南大学