专利名称：米曲霉gh11木聚糖酶基因耐热性改造的方法及突变酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 4018菌株的常温木聚糖酶(AoXynllA)基因热稳定改造，突变木聚糖酶工程菌的构建及重组突变木聚糖酶的高效表达，属于生物工程技术领域。
背景技术：
木聚糖酶(EC 3. 2. I. 8)是一类重要的工业用酶。它主要是作用于木聚糖主链，随机地切开木聚糖内部的木糖苷键，水解产物主要为不同聚合度的木寡糖和少量的木糖，是 木聚糖降解酶中最关键的酶。近几年，由于木聚糖酶在饲料工业、食品加工及酿造等行业具有潜在的工业应用和经济价值，尤其是在工业造纸上的应用，减少因漂白产生的环境污染，受到了越来越多的关注。然而在许多工业中，木聚糖酶都需要在高温条件下进行操作，因此对木聚糖酶耐热性的研究也引起了国内外研究的高度重视。开发耐热型木聚糖酶的研究主要包括筛选超耐热的木聚糖酶生产菌和利用基因工程对酶分子进行定向改造，相对于筛菌技术的盲目性，后者具有更强的针对性，受到国内外学者的青睐。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质分析，可将其分为不同的家族，其中以糖苷水解酶第10家族和第11家族居多。由于G/11家族的木聚糖酶分子量较小，且结构比较简单，更适合作为理论研究的分子模型，可以用于极端条件下木聚糖酶催化模式系统及蛋白质分子折叠机理等的研究。基因工程技术、生物信息学以及计算机科学的快速发展，为分子生物学的研究开辟了新的前景。我们可以运用大规模高性能的计算机及其相关软件，结合基因工程手段，利用模拟试验对酶分子进行定向改造以提高热稳定性，加速木聚糖酶在各种领域中的应用过程。
发明内容
本发明的目的是提供一种常温的木聚糖酶热稳定性改造、突变木聚糖酶工程菌构建以及突变木聚糖酶的高效表达的方法。本发明的技术方案根据来源于A. oryzae CICC 40186木聚糖酶AoXynllA的空间结构设计突变S55R和N155D，得到突变木聚糖酶=AoXynlIAyq，其成熟肽基因序列为SEQ IDNO :1，S55R和N15 可以形成盐桥。A. oryzae菌株购于中国工业微生物菌种保藏中心(China Center of IndustrialCultureCollection, CICC)，编号为 40186。所述的由成熟肽基因编码得到的AoXynllAYQ氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的重组木聚糖酶的活性测定方法于25mL具塞试管A和B中，各加入用pH 4. 6、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液配制的质量浓度为0. 5%的桦木木聚糖(Sigma, USA)溶液2. 4mL, 50°C预热IOmin,在A管中加入0. ImL适当稀释的酶液，50°C准确反应15min;立即各加入2. 5mL 3'，5' - 二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加O. ImL酶液，A和B管均煮沸7min ;冷却后各加去离子水5mL，摇匀；540nm处以B管为空白对照测定A管吸光度值，并从木糖标准曲线上查出相应的还原糖(以木糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义在本测定条件下，以每分钟产生
Iμ mo I还原糖所需的酶量定义为I个木聚糖酶活性单位(IU)。所述的耐热杂合木聚糖酶基因的设计、克隆及表达(I)变基因AoXynl IAyq及其表达质粒的构建根据GenBank上AoXynllA的基因序列设计引物F1, R1, F2, R2 F1 5/ -GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3'，含 EcoR I 酶切位点R1 :5 ’ -AGGTGATTGCTCTACGGCTTCCGGGGTT-3，， F2 :5 ’ -ACGGGGAATCATTTCGATGCGTGGGCTA-3，，R2 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位点以本实验室保存的pUCm-T-AoXynllA为模板，分别以F1J1和F2, R2为1，2两组引物同时进行第一轮PCR，分为PCRl和PCR2两组；以本实验室保存的pUCm-T-AoXynllA为模板，以第一轮PCRl产物和R2为引物进行第二轮PCR ；以第二轮PCR产物为模板，以PCR2产物和F1为引物进行第三轮PCR。将第三轮PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-AoXynllAYQ)。转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序结果正确的pUCm-T-AoXynl IAyq和pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒PPIC9K-AoXynllAYQ(图I)，并对重组表达质粒进行序列测定。(4)GS115/AoXynllAYQ重组子的构建、表达及酶活的测定用Sal I对PPIC9K-AoXynllAYQ进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS 115/AoXynllAYQ ;按照手册上的标准流程进行诱导表达；发酵液经初步纯化后使用SDS-PAGE检测目的蛋白分子量。本发明的有益效果本发明提供了一种新型简便的通过构建盐桥提升木聚糖酶热稳定性的方法，改造后得到的突变木聚糖酶命名为AoXynllA ，其相应的基因为AoXynl IAyq，其热稳定性有了一定提高，有较大的工业化生产和应用潜力以及经济价值，也为其它木聚糖酶的研究奠定了基础。
图I :重组质粒pPIC9K_AoXynllAYQ的构建示意图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例I突变基因AoXynl IAyq及其表达质粒的构建采用大引物PCR技术构造融合基因，主要分为三步分别以？1，札和匕1 2为1，2两组引物同时进行第一轮PCR，(940C 5min ;2个循环，94°C 30s, 45°C 30s, 72°C 30s ；28个循环94°C30s，55°C30s，72°C30s ；72°C IOmin ;10°C保存)分为PCRl和PCR2两组；以本实验室保存的pUCm-T-AoXynllA为模板，以第一轮PCRl产物和R2为引物进行第二轮PCR(94°C 5min ；2个循环，94。0 3()8，451308，721608 ;28 个循环 94°C 30s，55°C 30s，72°C 60s ；72°C IOmin ；10°C保存)；以第二轮PCR产物为模板，以PCR2产物和F1为引物进行第三轮PCR(94°C5min ；2个循环，94。0 3()8，451308，721608 ;28 个循环 94°C 30s，55°C 30s，72 60s ；72°C IOmin ；10°C保存)。将第三轮PCR 产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-AoXynllAYQ)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。将测序正确的pUCm-T-AoXynllAYQ与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-AoXynllAYQ，并对重组表达质粒进行序列测定，送去上海生工测序。实施例2GS115/AoXynllAYQ重组子的构建、表达及酶活的测定用Sal I对pPIC9K-AoXynllAYQ进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/AoXynllAYQ。该工程菌用I. O %甲醇诱导72h。离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经SDS-PAGE检测为单一条带，改造后木聚糖酶最适反应温度为55°C，热稳定性较原酶也有了一定提高。
权利要求
1.一种改造后的源自米曲霉(Aspergillus oryzae)CICC 40186、归属于糖苷水解酶第11家族的木聚糖酶基因AoXynl IAyq，其对应的基因和蛋白质序列分别为SEQ ID NO :1和SEQID NO :2。
2.突变木聚糖酶工程菌的构建方法和表达方法 (I)突变基因AoXynl IAyq及其表达质粒的构建根据GenBank上AoXynllA的基因序列设计引物F1, R1, F2, R2 F1 5/ -GAATTCTCCACACCCAGTAGCAC-3'，含 EcoR I 酶切位点 R1 :5’ -AGGTGATTGCTCTACGGCTTCCGGGGTT-3’，F2 :5’ -ACGGGGAATCATTTCGATGCGTGGGCTA-3’， R2 5/ -GCGGCCGCTCAATAAACAGTGATAGCAG-3'，含 Not I 酶切位点以本实验室保存的pUCm-T-AoXynllA为模板，分别以FnR1和F2, R2为1，2两组引物同时进行第一轮PCR，分为PCRl和PCR2两组；以本实验室保存的pUCm-T-AoXynllA为模板，以第一轮PCRl产物和R2为引物进行第二轮PCR ；以第二轮PCR产物为模板，以PCR2产物和F1为引物进行第三轮PCR ;将第三轮PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-AoXynllAYQ);转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序；将测序结果正确的pUCm-T-AoXynllAYQ和pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒PPIC9K-AoXynllAYQ,并对重组表达质粒进行序列测定； ⑵GS115/AoXynllAYQ重组子的构建、表达及酶活的测定用Sal I对PPIC9K-AoXynllAYQ进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GSl 15/AoXynlIAyq ;按照手册上的标准流程进行诱导表达，用I. 0%甲醇诱导72h ;离心上清液为重组木聚糖酶粗酶液，经SDS-PAGE检测均为单一条带，重组木聚糖酶最适反应温度为55°C。
全文摘要
本发明的目的是提供一种常温的木聚糖酶热稳定性改造、突变木聚糖酶工程菌构建以及突变木聚糖酶的高效表达的方法。根据来源于A.oryzae CICC 40186木聚糖酶AoXyn11A的空间结构设计突变S55R和N155D，得到突变木聚糖酶AoXyn11AYQ，其成熟肽基因序列为SEQ ID NO1，S55R和N155D可以形成一个跨二级结构的盐桥。实验结果表明突变后该酶热稳定性有了明显的提高，作为一种耐热型的酶制剂，该木聚糖酶具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N1/19GK102703481SQ20121018137
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者刘晓彤, 李剑芳, 邬敏辰 申请人:江南大学