专利名称：一种阿魏酸酯酶基因(Fae-A)的克隆及重组酶的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)EOOl菌株的ー种新型A型阿魏酸酯酶(Fae-A)基因成熟肽cDNA序列的克隆及表达，属于生物工程技术领域。
背景技术：
阿魏酸(ferulic acid)的化学名称为4_羟基_3_甲基_2_苯丙烯酸，是植物界普遍存在的ー种酚酸，其在植物细胞壁结构中起着重要的作用，可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。在谷物的细胞壁中，阿魏酸的单体和多种ニ聚体主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上。阿魏酸酯酶(EC. 3. I. I. 73)又称肉桂酸酯酶、肉桂酰酯酶，是羧酸水解酶的ー个亚类，也是一种胞外水解酶，是能水解阿魏酸甲酷、低聚阿魏酸酯和多聚阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的酶。因此，可以利用阿魏酸酯酶作用于植物细胞壁，释放出游离阿魏酸或者是ニ聚体阿魏酸，其主要的生理功能有抗氧化和清除自由基、抗血栓、降血脂及防治冠心病，并具有抗菌消炎以及抗突变和防癌作用。反式阿魏酸在美国、日本已允许用作食品添加剤，目前在医药、食品和化妆品エ业中广泛应用。阿魏酸酯酶的微生物来源广泛，如黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉，青霉类、嗜酸乳酸杆菌等各种丝状真菌以及细菌。宇佐美曲霉是黑曲霉的ー个变种，它具有生长速度快、产孢子少等优点，就前期研究的结果来看，两个菌种在基因水平上的差异极小。目前对于阿魏酸酯酶的研究，主要集中于对原始菌株培养条件的优化以増加产酶量或者是提高酶活，也有一部分研究者采用基因工程技术和蛋白质工程技术来提高阿魏酸酯酶的酶活。近年来，随着对自然界半纤维素资源的开发利用，尤其是反式阿魏酸优越的生理功能，人们对不同来源和不同特性的阿魏酸酯酶进行了深入地研究，阿魏酸酯酶的应用领域得到了不断地拓展，除了在食品方面的利用，其在造纸、饲料、纺织、酿酒、医药、环境和能源等エ业领域逐步开始了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种源于Aspergillus usamii EOOl的新型A类阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表达的方法，为该阿魏酸酯酶的产业化生产奠定理论基础。根据氨基酸序列以及底物特异性等，将阿魏酸酯酶分为A、B、C、D四类，Shin等研究表明这四类阿魏酸酯酶都含有不同的保守序列和基序。根据同源比对，A. usamii EOOl分泌的为A型阿魏酸酯酶，命名为Aus Fae-A，其相应的基因命名为Aus Fae_A。A. usamii EOOl菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵エ业》杂志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。本发明的技术方案一种源自A. usamii EOOl的新型的A类阿魏酸酯酶(AusFae-A)，其基因(Aus Fae-A)成熟肽cDNA核苷酸序列为SEQ ID NO 10
所述的由成熟肽cDNA序列所推导的Aus Fae-A氨基酸序列为SEQ ID NO :2。所述的重组阿魏酸酯酶的活性測定方法于25mL具塞试管中，取5mL粗酶液于加入O. 2g去淀粉麦麸(DSWB)，试管中，在40°C下恒温水浴回旋反应15min,沸水浴中灭酶3min,离心,取ImL上清液(根据释放出的阿魏酸量稀释适当倍数)加入9mL无水こ醇，振摇，离心，取上清液用紫外分光光度计在320nm下测定吸光值，同时设置空白对照(5mL粗酶液于沸水浴中灭酶3min，加入O. 2g DSffB于试管中，其他操作步骤同上)，计算酶活时减去酶液中原有的阿魏酸(即空白)。所述的Aus Fae-A成熟肽cDNA序列的克隆和表达的方法如下(I)从已报道的Aspergillus niger CBS 513. 88基因组信息中找出编码黑曲霉 A类阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计一对特异性引物，引物序列如下FAE-F :5’ GAATTCGCTTCCACGCAAGGCATCTC 3’FAE-R 5 GCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCG 3’提取A. usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)说明书进行RT-PCR扩增。将两轮PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T载体连接(pUCm-T-Fae-A)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生エ测序，得到Aus Fae-A成熟肽cDNA序列。(2)将测序结果正确的pUCm-T-Fae-A与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Fae-A(图I)，并对重组质粒进行序列測定。(3)GS115/Fae-A的构建、表达、产物纯化及活性测定用Sac I对pPIC9K-Fae_A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Fae-Α;按照手册上的标准流程进行诱导表达，用紫外吸收法測定重组阿魏酸酯酶活性。本发明的有益效果本发明提供了ー种来源于A. usamii EOOl的新型的阿魏酸酯酶成熟肽基因cDNA序列的克隆及表达的方法，生物信息学分析表明该阿魏酸酯酶属于此类酶的A类，所以命名为Aus Fae A，其相应的基因命名为Aus Fae-Α。本发明为该酶的产业化生产奠定了理论基础，有较大的エ业化生产和应用潜カ及经济价值，也为其他菌株新型阿魏酸酯酶的研究奠定了理论基础。
图I :重组质粒pPIC9K-Fae_A的构建示意图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进ー步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1A. usamii EOOlFae-Α成熟肽cDNA序列的克隆以A. usamii EOOl 总 RNA 为模板，Oligo dT-Adaptor Primer 为引物反转录合成cDNA的第一条链；以M13Primer M4和FAE-F为引物进行第一轮PCR，其反应条件为940C 5min，30 个循环(94°C 30s, 53°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ;以 FAE-F 和 FAE-R 为引物进行第二轮 PCR，其反应条件为94°C 5min，30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72 °C IOmin0将两轮PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-Aus Fae-A)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生エ测序。实施例2Aus Fae-A成熟肽基因在毕赤酵母GSl 15中的表达将测序结果正确的pUCm-T-Fae-Α与pPIC9K质粒均用EcoR I和Not I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Fae-A，并对重组质粒进行序列測定。用Sac I对pPIC9K-Fae_A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Fae-A。该基因工程菌用I. 0%甲醇诱导表达96h，采 用紫外吸收法测得发酵液中重组阿魏酸酯酶活性达85IU/mL。
权利要求
1.ー种来源于Aspergillus usamii EOOl的新型A类阿魏酸酯酶,其核苷酸和氨基酸序列分别为 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO :2。
2.A. usamii EOOl新型A类阿魏酸酯酶基因序列克隆及表达的方法 (1)从已报道的Aspergillusniger CBS 513. 88基因组信息中找出编码黑曲霉A类阿魏酸酯酶的完整DNA序列，然后对该序列进行开放读码框分析和信号肽预测，根据预测的结果设计ー对特异性引物，引物序列如下FAE-F :5’ GAATTCGCTTCCACGCAAGGCATCTC3，FAE-R :5’ GCGGCCGCTTACCAAGTACAAGCTCCG3，提取A. usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. O)说明书进行RT-PCR扩增；将两轮PCR产物用I %琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T载体连接(pUCm-T-Fae-A)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生エ测序，得到AusFae-A成熟肽cDNA序列； (2)将测序结果正确的pUCm-T-Fae-A与pPIC9K质粒均用EcoRI和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9K-Fae-A(图I)，并对重组质粒进行序列測定； (3)GS115/Fae_A的构建、表达、产物纯化及活性测定用SacI对pPIC9K_Fae-A进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Fae-A;按照手册上的标准流程进行诱导表达，用紫外吸收法測定重组阿魏酸酯酶活性。
全文摘要
本发明提出了一种源于Aspergillus usamii E001的新型A类阿魏酸酯酶基因成熟肽cDNA序列的克隆及表达的方法，其核苷酸序列为SEQ ID NO1，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO2，相应的基因命名为Aus Fae-A。本发明还公开了产阿魏酸酯酶工程菌的构建以及重组阿魏酸酯酶的高效表达的方法，具有较大的工业化生产潜力和经济价值。
文档编号C12N15/81GK102703403SQ20121018137
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者唐存多, 李剑芳, 邬敏辰, 陈忠法, 龚燕燕 申请人:江南大学