专利名称：一种毕赤酵母表达载体的构建和使用方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种便于实现蛋白质天然N端表达的毕赤酵母表达载体的构建方法及应用示范。
背景技术：
、
随着分子生物学及基因工程技术的快速发展，目前外源蛋白已经能够成功的在大肠杆菌、昆虫细胞甚至哺乳类细胞中进行表达，虽然这些表达系统已经被广泛的研究和应用，但依然存在着许多缺点和不足。与之相比，毕赤酵母生长周期较短，遗传操作简单，具备真核细胞蛋白合成通路，能够对蛋白质进行真核修饰(蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等)，同时，毕赤酵母能在简单培养基上进行高密度生长，即使在大规模发酵中，其包含的重组元件能够稳定遗传，并且表达后的蛋白质易于纯化，因此近年来毕赤酵母已成为外源蛋白表达的优选系统之一。目前使用最广泛的巴斯德毕赤酵母宿主细胞为Cregg 1985年建立的GS115菌株。毕赤酵母GS115具有组氨酸脱氢酶缺陷型基因his4，因而可接受含HIS4的载体而具有HIS+表型以筛选转化子。目前适合毕赤酵母GSl 15表达的载体有多种，如pPIC9、pPIC3、pPIC9k、pA0815、pA0804、pPICz 和 pPICza 系列等。pPIC9K是一种分泌性毕赤酵母表达载体，包含5' AOXl启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4)、3' AOXl基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还含有PBR322序列。该质粒在多克隆位点的前面包含能够起到分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。目前PPIC9K仅能够使用SnaBUEcoR I,Avr II和Not I四种酶切位点，其中仅EcoR I和Not I较为常用，若使用SnaBl和Avr II则通常需要分布酶切。同时由于所要表达的目的基因碱基具有一定的随机性，经常会存在包括EcoR I.Avr II等在内的酶切位点，因此限制了该载体的使用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种多克隆位点处包含多个单酶切位点的PPIC9K表达载体，该载体能能够适用于内部含有EcoR I.Avr II等酶切位点基因的表达。为实现上述目的，本发明的技术方案提供了一种毕赤酵母表达载体PPIC9K11，所述表达载体能够适用于内部含有EcoR I.Avr II等酶切位点基因的表达，其特征在于，所述表达载体多克隆位点处添加了 AflII、BSSHII、Spe I和Mlu I四个原pPIC9K载体没有的单酶切位点，PPIC9K11多克隆位点结构如图I所示。本发明公开了 pPIC9KD的构建方法，具体包括以下步骤I)引物设计及多克隆位点扩增a.根据PPIC9K中多克隆位点处序列设计引物9Kadd(SEQ IDNO 1)5' -GCGGCCGCACGCGTGCGCGCCTTAAGACTAGTCCTAGGGAATTCTACGTAA-3'
以PPIC9K质粒为模板，使用引物9Kadd和PPIC9K通用引物5’ -AOXC -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')进行PCR，扩增出片段9KADD并连至pUCm_T载体上，新载体命名为pUCm-T-9KADD。2)pPIC9KD质粒的构建对pPIC9K和pUCm-T-9KADD载体分别使用限制性酶切位点BamH I和Not I进行双酶切，纯化酶切后的片段并进行连接，经测序后获得PPIC9K11质粒。本发明还公开了 pPIC9KD质粒的使用方法。具体包括以下步骤I)引物设计及目的基因的扩增a.选择目的基因内部没有的酶切位点并以此设计上下游引物，根据限制性内切酶缓冲液(以TAKARA公司为例)的不同可选择的酶切位点组合有EcoR I和Not I以及EcoR
I、Afl II、BssHII、Spe I、Mlu I五种酶中任意两种的组合,其他包括Avr II和Not I、AflII和Not I等在内的组合则需要对载体进行分布酶切。b.使用设计好的引物以目的基因或包含目的基因的载体为模板进行PCR，回收目的条带并与T载体连接，转化大肠杆菌并测序。2)载体与目的基因的酶切、连接及转化a.选择与引物对应的酶对pPIC9KD质粒及包含目的基因的T载体进行双酶切。b.分别回收目的基因及酶切的pPIC9KD质粒片段，并使用T4DNA连接酶进行连接。c.对包含目的基因的pPIC9KD进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子；按照手册上的标准流程进行诱导表达获得目的蛋白。
图I :质粒pPIC9KD的多克隆位点示意图
具体实施例方式本发明中所涉及的生物材料均为已公开或商品化的材料，具体可通过以下方式获得载体PPIC9K :购于 Novagen 公司；载体pUCm-T :购自上海生工生物工程公司；以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例I质粒pPIC9KD的构建I)引物设计及多克隆位点扩增a.根据PPIC9K中多克隆位点处序列设计引物9Kadd:5' -GCGGCCGCACGCGTGCGCGCCTTAAGACTAGTCCTAGGGAATTCTACGTAA-3'以pPIC9K质粒为模板，使用弓I物9Kadd和pPIC9K通用引物5 ’ -AOX (5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')进行 PCR，其反应条件为94°C 5min ；2 个循环，94°C 30s, 45°C 30s,72 °C 70s ；28 个循环，94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 70s ；72°C IOmin ;10°C 保存，扩增出片段9KADD使用I. 0%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T_9KADD)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
2)pPIC9KD质粒的构建对pPIC9K和pUCm-T_9KADD载体分别使用限制性酶切位点BamH I和Not I进行双酶切，，酶切时间为4h，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下连接过夜(> 12h)，转化大肠杆菌DH5 a，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。实施例2甘露聚糖酶表达质粒的构建及异源表达I)合成引物 Man5A-F 5 ' -GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3 '、Man5A_R :5 '-ACGCGTTTA (A/G) GC (A/G) CTA (C/T) CAATAGCAG-3'，下划线所示分别为 EcoR I 和 Mlu I 酶切位点。以载体pUCm-T-Man5A质粒为模板，PCR获得甘露聚糖酶基因Man5A (94°C 3min ；30个循环，94°C 30s，56°C 30s，72°C Imin ;72。。IOmin ;4°C 99min)，将PCR产物用 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-Man5A)，转化大肠杆菌JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。
2)将测序正确的pUCm-T_Man5A与pPIC9KD质粒均用EcoR I和Mlu I进行双酶切，回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pPIC9KD-Man5A，并对重组表达质粒进行序列测定。3)用Sal I对pPIC9KD_Man5A进行线性化,按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/Man5A。该工程菌用2. 0%甲醇诱导96h，DNS法测得发酵液中重组甘露聚糖酶活性达82IU/mL。离心上清液为重组甘露聚糖酶粗酶液，经截留分子量为IOkDa的超滤膜浓缩,再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示重组甘露聚糖酶分子量为44. 3kDa，表明该酶已在新载体pPIC9KD中成功实现了分泌表达。
权利要求
1.一种包含多个多克隆位点的载体PPIC9K11，其特征在于它的多克隆位点结构如图I所示。
2.—种构建载体pPIC9KD的方法，其特征在于具体构建步骤包括 1)引物设计及多克隆位点扩增 a.根据pPIC9K中多克隆位点处序列设计引物9Kadd 5' -GCGGCCGCACGCGTGCGCGCCTTAAGACTAGTCCTAGGGAATTCTACGTAA-3' 以pPIC9K质粒为模板，使用引物9Kadd和pPIC9K通用引物5’ -AOX(5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3丨)进行PCR，扩增出片段9KADD并连至pUCm_T载体上，新载体命名为pUCm-T-9KADD ； 2)pPIC9KD质粒的构建 对pPIC9K和pUCm-T-9KADD载体分别使用限制性酶切位点BamH I和Not I进行双酶切，纯化酶切后的片段并进行连接，经测序后获得PPIC9K11质粒。
3.—种pPIC9KD质粒的使用方法，其特征在于具体步骤包括 1)引物设计及目的基因的扩增 a.选择目的基因内部没有的酶切位点并以此设计上下游引物，根据限制性内切酶缓冲液(以TAKARA公司为例)的不同可选择的酶切位点组合有EcoR I和Not I以及EcoR I、Afl II、BssHII、Spe I、Mlu I四种酶中任意两种的组合,其他包括Avr II和Not I、Afl II和Not I等在内的组合则需要对载体进行分布酶切； b.使用设计好的引物以目的基因或包含目的基因的载体为模板进行PCR，回收目的条带并与T载体连接，转化大肠杆菌并测序； 2)载体与目的基因的酶切、连接及转化 a.选择与引物对应的酶对pPIC9KD质粒及包含目的基因的T载体进行双酶切； b.分别回收目的基因及酶切的pPIC9KD质粒片段，并使用T4DNA连接酶进行连接； c.对包含目的基因的pPIC9KD进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子；按照手册上的标准流程进行诱导表达获得目的蛋白。
全文摘要
本发明的目的是提供一种多克隆位点处包含多个单酶切位点的pPIC9K表达载体，该载体能能够适用于内部含有EcoR I、Avr II等酶切位点基因的表达。所述表达载体的特征在于，该表达载体的多克隆位点处添加了Afl II、BssH II、Spe I和Mlu I四个原pPIC9K载体没有的单酶切位点，pPIC9KD多克隆位点结构如图1所示。
文档编号C12N15/81GK102703496SQ20121018137
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月5日 优先权日2012年6月5日
发明者李剑芳, 邬敏辰, 魏喜换 申请人:江南大学