新型植物表达构建物的制作方法
【专利说明】新型植物表达构建物
[0001] 本申请是申请日为2000年12月12日，申请号为200810212531. 1，发明名称为"新 型植物表达构建物"的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及分离和应用核酸分子以控制植物中的基因表达，所述核酸分子具体是 新型植物启动子。
[0003] 发明背景
[0004] 植物遗传工程的一个目标是产生具有重要农学特征或性状的植物。遗传工程 的最近发展已经提供了产生包含和表达外源基因的转基因植物的必要工具（Kahl等， WorldJ.ofMicrobiol.Biotech. 11:449-460,1995)。对于植物遗传工程尤其需要的目 的性状或品质包括但不限于：昆虫抗性、真菌病抗性、对其它害虫和病原体的抗性、除草 剂耐性、更高的稳定性或更长的保存期、更高产量、环境耐性以及营养强化（nutritional enhancement)。植物转化和再生领域内的技术进步已经使得研究者能够从异源来源或天然 来源提取外源DNA(如一个基因或多个基因），然后将所述外源DNA掺入植物基因组。在一 种方法中，通常不在特定植物或特定植物组织中表达的新型基因的表达可能赋予所需的表 型效应。在另一种方法中，以反义取向的基因或基因部分的转录可能通过防止或抑制内源 基因的表达而产生所需效应。
[0005] 为产生转基因植物，将包括异源基因序列的构建物引入植物细胞，所述异源基因 序列当在植物中表达时赋予所需表型。所述构建物还包括有效连接所述异源基因序列的植 物启动子，该植物启动子通常在一般情况下不与所述异源基因连接。将所述构建物引入植 物细胞，产生转化植物细胞，然后将所述转化植物细胞再生为转基因植物。所述启动子控制 该启动子有效连接的所引入DNA序列的表达，并因此影响所述DNA序列所赋予的所需特性。
[0006] 利用多种启动子定制基因表达可能是有利的，以便一个基因或多个基因在植物生 长和发育的恰当时间、在所述植物中的最佳位点并且以产生所需效应所必需的量有效转 录。例如，基因产物的组成型表达在植物的一个位点可能是有利的，但在该植物的另一部分 就不是那么有利。在其它情况下，在植物某个发育阶段或在应答某些环境或化学刺激时产 生基因产物可能是有利的。遗传改良种质的商业化发展也已经前进到将多种性状引入作物 的阶段，该方法常常被称为基因堆积方法（genestackingapproach)。在该方法中，可以将 赋予不同目的性状的多种基因引入植物。当将多种基因引入植物时，重要的是调整或控制 每个基因以获得最佳表达，并且使得调节元件多样化，以降低基因沉默的可能性。根据这些 和其它的考虑，在植物生物工程技术中基因表达的最佳控制和调节元件多样化显然是重要 的。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明涉及包含以下元件的DNA植物表达构建物：拟南芥属肌动蛋白（Act)启动 子序列Actla、Actlb、Act2、Act3、Act7、Act8、Actll、Actl2 和延伸因子 1a(EF1a)启动 子序列、以及由有效连接于在作物细胞中起作用的异源结构基因序列的这些启动子获得的 片段和顺式元件。
[0009] 因此，根据本发明的一个实施方案，提供以有效连接包含下列元件的重组DNA构 建物：在作物细胞中起作用的启动子，所述启动子包括：来自SEQIDNO:9、SEQIDN0 :10、 SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDNO: 25和SEQIDNO:26的至少一种顺式元件；对于所述启动子异源的结构DNA序列；和在植物 中起作用的3'非翻译区，该3'非翻译区引起在RNA序列的3'末端添加聚腺苷酸化核苷酸。 例如，所述启动子可以主要包含来自下面任何一种的5'调节区：SEQIDNO:9、SEQIDN0 : 10、SEQIDNO:11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQID NO:25和SEQIDNO:26(包括或不包括它们中间的任何内含子序列）。所述结构基因可以 包含任何异源核苷酸序列，其中所述序列的表达导致转基因作物中在农学上有用的性状或 产品。
[0010] 根据本发明的一方面是一种DNA构建物，该DNA构建物包含有效连接本发明启动 子序列的结构DNA序列，所述结构DNA序列编码赋予作物除草剂耐性的蛋白。该除草剂耐 性蛋白包括但不限于草甘膦耐性蛋白基因如单独的草甘膦抗性EPSP合酶基因，或者该基 因与一种或多种草甘膦降解蛋白基因的组合。
[0011] 根据本发明的另一实施方案，提供如上文所述的那些DNA构建物，其中所述启动 子是杂种或嵌合启动子，包含有效连接异源启动子序列的由选自以下的一种或多种序列获 得的至少一种顺式元件：SEQIDN0 :9、SEQIDN0 :10、SEQIDN0 :11、SEQIDN0 :12、SEQ IDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQIDN0:25和SEQIDN0:26,所述异源启动子 序列如花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子或玄参花叶病毒启动子。
[0012].根据本发明的又一实施方案，提供串联的例如如上文所述的DNA构建物，其中所 述启动子是杂种或嵌合启动子，包含有效连接在转基因作物细胞中表达的异源基因序列的 由选自以下的一种或多种序列获得的至少一种顺式元件：SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQ IDNO: 11、SEQIDNO: 12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和 SEQIDN0:26。所述嵌合启动子序列更具体地是包含在SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQ IDNO: 29和SEQIDNO:30中定义的序列。
[0013] 根据本发明的再一实施方案，提供例如如上文所述的DNA构建物，其中所述结构 DNA序列是草甘膦耐性基因，使得当将所述DNA构建物引入植物细胞时，它赋予所述植物 细胞对于每升至少包括50克酸当量（ga.e./l)草甘膦的草甘膦水溶液制剂的耐性。在 其它相关实施方案中，所述DNA构建物赋予所述植物细胞对于草甘膦浓度更高（例如每升 至少300克酸相当草甘膦）的草甘膦制剂的耐性。根据一个实施方案，所述DNA构建物 赋予所述植物细胞对于以下除草剂施用的耐性：例如以每英亩16盎司（oz)的比率施用 RoundupUltra?.至少一次，而在其它实施方案中，草甘膦耐性扩展到例如以每亩16oz、每 英亩32oz或每英亩64oz施用一到二次或更多次。
[0014] 根据本发明的另一实施方案，提供用上文所述DNA构建物转化的转基因作物，其 中包括单子叶植物物种和双子叶植物物种。我们已经发现：当使用拟南芥属肌动蛋白和拟 南芥属EF1a启动子在其它作物物种例如棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因（如 aroA:CP4)表达时，所述启动子充分有活性，所述植物耐受草甘膦的商业化施用比率，展现 良好的营养性耐性以及对繁殖组织的损伤低。也可以使用这样的启动子在植物中表达其它 目的基因，所述目的基因包括但不限于赋予下列性状的基因：除草剂耐性、昆虫防制、抗病 性、稳定性增加或保存期增加、产量提高、营养强化、表达药用多肽产物或其它需要的多肽 产物、或植物生理学或形态学的所需改变等等。
[0015] 根据本发明的另一实施方案，提供用多种DNA构建物转化的转基因植物，所述DNA 构建物包含拟南芥属肌动蛋白和拟南芥属EF1a启动子，所述启动子在其它作物物种例如 棉花、番茄和向日葵中控制草甘膦耐性基因（如aroA:CP4)表达时充分有活性，所述植物耐 受草甘膦的商业化施用比率，展现良好的营养性耐性以及对繁殖组织的损伤低。也可以使 用这样的启动子在植物中表达其它目的基因，所述目的基因包括但不限于赋予下列性状的 基因：除草剂耐性、昆虫防制、抗病性、稳定性增加或保存期增加、产量提高、营养强化、表达 药用多肽产物或其它需要的多肽产物、或植物生理学或形态学的所需改变等等。
[0016] 根据本发明的再一实施方案，提供用DNA构建物转化的转基因作物，所述DNA构建 物包含拟南芥属肌动蛋白和拟南芥属EF1a启动子作为与花椰菜花叶病毒DNA分子融合的 嵌合DNA分子，所述嵌合DNA分子在植物中具有启动子活性，在其它作物物种例如棉花、番 茄和向日葵中充分有活性，例如当用来控制草甘膦耐性基因（如aroA:CP4)表达时，所述植 物耐受草甘膦的商业化施用比率，展现良好的营养体耐性以及对生殖组织的损伤低。也可 以使用这样的启动子在植物中表达其它目的基因，所述目的基因包括但不限于赋予下列性 状的基因：除草剂耐性、昆虫防制、抗病性、稳定性增加或保存期增加、产量提高、营养强化、 表达药用多肽产物或其它需要的多肽产物、或植物生理学或形态学的所需改变等等。
[0017] 根据本发明的又一实施方案，提供在植物中表达结构DNA序列的方法。这样的方 法包括：提供如上文所述的DNA构建物，将所述DNA构建物引入植物细胞，然后再生所述植 物细胞产生植株，以便在所述植物中可表达所述结构DNA。根据一个相关实施方案，提供防 除杂草的方法，其中所述DNA构建物包含草甘膦耐性基因，对用所述DNA构建物转化的作物 施用一次其用量足以防除杂草而不会显著损害所述作物的草甘膦。
[0018] 附图简述
[0019] 图1是pCGN8086的质粒图谱。
[0020] 图2是pM0N45325的质粒图谱。
[0021] 图3是pM0N45331的质粒图谱。
[0022] 图4是pM0N45332的质粒图谱。
[0023] 图5是pCGN9190的质粒图谱。
[0024] 图6是pCGN9153的质粒图谱。
[0025] 图7是pCGN8099的质粒图谱。
[0026] 图8是pCGN8088的质粒图谱。
[0027] 图9是pCGN8068的质粒图谱。
[0028] 图10是pCGN8096的质粒图谱。
[0029] 图11是PCGN9151的质粒图谱。
[0030] 图12是pM0N10156的质粒图谱。
[0031] 图13是pM0N52059的质粒图谱。
[0032] 图14是pM0N54952的质粒图谱。
[0033] 图15是pM0N54953的质粒图谱。
[0034] 图16是pM0N54954的质粒图谱。
[0035] 图17是pM0N54955的质粒图谱。
[0036] 图18是pM0N54956的质粒图谱。
[0037] 序列表简述
[0038]SEQIDN0:1是用于分离Act2启动子的正向PCR引物。
[0039]SEQIDN0 :2是用于分离Act2启动子的反向PCR引物。
[0040]SEQIDN0 :3是用于分离Act8启动子的正向PCR引物。
[0041] SEQIDN0 :4是用于分离Act8启动子的反向PCR引物。
[0042]SEQIDN0 :5是用于分离Actll启动子的正向PCR引物。
[0043]SEQIDN0:6是用于分离Actll启动子的反向PCR引物。
[0044]SEQIDN0 :7是用于分离EF1启动子的正向PCR引物。
[0045]SEQIDN0 :8是用于分离EF1启动子的反向PCR引物。
[0046] SEQIDN0:9是Act2启动子的序列，其中包括Act2基因的内含子序列。碱基位 置1-764代表启动子序列；碱基位置765-1215代表内含子，其后是在ATG之前的5碱基5' 非翻译区（5'UTR);转录起始位点位于碱基位置597。
[0047] SEQID勵：10是八(^8启动子的序列，其中包括4(^8基因的第一个内含子。碱基 位置1-797代表启动子序列；碱基位置798-1259代表内含子，其后是在ATG之前的10碱基 5'UTR;转录起始位点位于碱基位置646。
[0048]SEQIDN0 :11是Actll启动子的序列，其中包括Actll基因的第一个内含子。碱 基位置1-1218代表启动子序列；碱基位置1219-1381代表内含子，其后是在ATG之前的10 碱基5'UTR;转录起始位点位于碱基位置1062。
[0049]SEQIDN0:12是EF1启动子的序列，其中包括EFI基因的第一个内含子。碱基位 置1-536代表启动子序列；碱基位置537-1137代表内含子，其后是在ATG之前的22碱基 5'UTR;转录起始位点位于碱基位置481。
[0050]SEQIDN0:13是用于分离Actla启动子的正向PCR引物。
[0051] SEQIDN0 :14是用于分离Actlb启动子的正向PCR引物。
[0052]SEQIDN0 :15是用于分离Actla和Actlb启动子的反向PCR引物。
[0053]SEQIDN0:16是用于分离Act3启动子的正向PCR引物。
[0054]SEQIDN0:17是用于分离Act3启动子的反向PCR引物。
[0055]SEQIDN0 :18是用于分离Act7启动子的正向PCR引物。
[0056]SEQIDN0:19是用于分离Act7启动子的反向PCR引物。
[0057]SEQIDN0:20是用于分离Actl2启动子的正向PCR引物。
[0058]SEQIDN0:21是用于分离Actl2启动子的反向PCR引物。
[0059] SEQIDN0 :22是Actla启动子的序列，其中包括Actla基因的第一个内含子。碱 基位置1-1033代表启动子序列；碱基位置1034-1578代表内含子和5'UTR。
[0060]SEQIDN0 :23是Actlb启动子的序列，其中包括Actlb基因的第一个内含子。碱 基位置1-914代表启动子序列；碱基位置915-1468代表内含子和5'UTR序列。
[0061] SEQIDN0:24是Act3启动子的序列，其中包括Act3基因的第一个内含子。碱基 位置1-1023代表启动子序列；碱基位置1024-1642代表内含子和5'UTR序列。
[0062]SEQIDN0:25是Act7启动子的序列，其中包括Act7基因的第一个内含子。碱基 位置1-600代表启动子序列；碱基位置601-1241代表内含子和5'UTR序列。
[0063]SEQIDN0:26是Actl2启动子的序列，其中包括Actl2基因的第一个内含子。碱 基位置1-1017代表启动子序列；碱基位置1018-1313代表内含子和