1] 本发明的方法包括但不限于PCR技术、分离基因组DNA、构建表达构建物、瞬时测 定和植物转化方法，这些方法是本领域内技术人员众所周知的，并使用标准技术或其修改 形式执行。
[0142]草甘膦啼洒试骑
[0143] 在一个实施方案中，进行草甘膦耐性的温室或田间评价。本文用术语"草甘膦"统 称母体除草剂N-膦酰甲基甘氨酸（也称为草甘膦酸）、其盐或酯、或在植物组织中转化为 N-膦酰甲基甘氨酸的化合物、或以其它方式提供离子形式N-膦酰甲基甘氨酸（也称为草甘 膦离子）的化合物。作为例证，Franz的美国专利第3, 799, 758号和第4, 405, 531号公开 了本文使用的水溶性草甘膦盐，所述文献的公开内容通过引用结合到本文中。可以按照本 发明使用的草甘膦盐包括但不限于碱金属盐，例如钠盐和钾盐；铵盐；(^_ 16烷基铵盐，例如 二甲基铵盐和异丙基铵盐链烷醇铵盐，例如单乙醇铵盐；C^^烷基锍盐，例如三甲基 锍盐；它们的混合物等等。草甘膦酸分子有三个酸位点，这三个酸位点有不同的pKa值；因 此可以使用一代盐、二代盐和三代盐，或它们的混合物，或任何中间中和水平的盐。
[0144] 草甘膦盐有商业意义，部分因为它们是水溶性的。许多铵盐、烷基铵盐、链烷醇铵 盐、烷基锍盐和碱金属盐是高度水溶性的，允许配制成高度浓缩的水溶液，在使用时用水稀 释。
[0145] 这样的浓缩水溶液可以含有按酸相当（ga.e. /I)表示的每升约50克到约500克 草甘膦。优选更高的草甘膦浓度，例如约300到约500ga.e. . 1。
[0146] 或者将草甘膦盐配制成水溶性组合物或水分散性组合物，例如采用粉剂、颗粒剂、 丸状或片剂的形式。所述组合物常常称为干制剂，但词语"干"在这里不应当理解为意味着 完全不含水。通常干制剂含有少于约5% (重量）的水，例如约0.5%到约2% (重量）的 水。这样的制剂需要在使用时溶解或分散于水中。
[0147] 设想的干草甘膦制剂可以含有按酸相当表示的约5%到约80% (重量） 的草甘膦。优选在上述范围内的较高草甘膦浓度，例如约50%到约80%a.e.。用于制造干 制剂的尤其有用的草甘膦盐是钠盐和铵盐。
[0148] 本发明的植物处理组合物和液体以及干浓缩组合物可以任选地含有一种或多种 所需的赋形剂成份。对于草甘膦组合物尤其有用的赋形剂成份是表面活性剂，表面活性剂 协助水性喷洒溶液保留在相对疏水的植物叶表面，也帮助草甘膦穿透叶的蜡质外层（角质 层）并因此接触叶内的活组织。表面活性剂也可以执行其它有用功能。
[0149] 可以用于本发明草甘膦组合物中的表面活性剂在类型和化学种类上没有限制。在 特定情形下，非离子型、阴离子型、阳离子型和两性型或者一种以上所述类型的组合都是有 用的。然而，一般优选至少一种存在的表面活性剂（如果有的话）应当是非阴离子型的，即 至少一种所述表面活性剂应当是非离子型、阳离子型或两性型的。
[0150] 在此有用的许多表面活性剂具有包含一个或多个部分的化学结构，所述部分各由 一个c2_4烯化氧单位或C2_4烯化氧单位聚合链或共聚合链组成。所述表面活性剂称为聚氧 化烯表面活性剂，包括非离子型、阴离子型、阳离子型和两性型。在目前设想的组合物中有 用的聚氧化烯表面活性剂包含约2到约100个C2_4烯化氧单位。在优选的聚氧化烯表面活 性剂中，烯化氧单位形成一条或多条环氧乙烷链或环氧乙烷和环氧丙烷共聚物链，烯化氧 单位的每条链具有一个氢* (hydrido)端基或用Ci_4烧基或Ci_4烧醜基封端。
[0151] 在本发明组合物中有用的表面活性剂的疏水部分可以是基本基于烃的，在这种情 况下所述疏水部分一般是c8_24、优选c12_18的烷基、链烯基、烷芳基、烷酰基或链烯酰基链。这 些链可以是线性或分支的。或者，所述疏水部分可以含有硅原子，例如采取硅氧烷基团的形 式如七甲基三硅氧烷基团，或者所述疏水部分可以含有氟原子，例如作为部分氟化的烷基 链或全氟烃基链。
[0152] 在非离子型表面活性剂中，尤其优选的种类包括聚氧乙烯烷基、链烯基或烷芳基 醚（例如乙氧基化伯醇或仲醇或烷基酚）、聚氧乙烯烷基或链烯基酯（例如乙氧基化脂肪 酸）、聚氧乙烯脱氧山梨糖醇烷基酯、甘油基烷基酯、蔗糖酯、烷基多聚糖苷等等。所述非离 子型表面活性剂的代表性具体例子包括聚氧乙烯（9)壬基酚、Shell的Ne〇d〇lTM25-7(聚 氧乙烯（7)C12_15线性伯醇）、UnionCarbide的Tergitol? 15-S-9(聚氧乙烯（9)C12_15仲 醇）、ICI的Tween? 20(聚氧乙烯（20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯）和Henkel的Agrinul? PG-2069 (C9_n烷基多聚糖苷）。
[0153] 在阳离子型表面活性剂中，尤其优选的种类包括聚氧乙烯叔烷基胺或链烯基胺 (如乙氧基化脂肪胺）、季铵表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚胺等等。所述阳离子型表面活性 剂有代表性的具体例子包括聚氧乙烯（5)椰油胺（cocoamine)、聚氧乙烯（15)牛油脂肪胺、 氯化二硬脂酰基二甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵、氯化甲基双（2-羟乙基）椰油铵、氯化 N-十二烷基吡啶和聚氧丙烯（8)氯化乙氧基三甲基铵。尤其优选的聚氧乙烯烷基醚胺是 PCT公开说明书W0 96/32839公开的那些化合物。本领域内知道许多阳离子叔铵表面活性 剂可以与草甘膦组合使用，并且可以用于本文所设想的组合物中；所述叔铵表面活性剂具 有式
[0154] (NRaRbRcRd)mAn
[0155] 其中A是合适的阴离子如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、硫酸根或磷酸根，m和n 是整数，使得阳离子（NIfRbRf)的正电荷与阴离子A的负电荷相平衡，Ra、Rb、IT和Rd的选 择包括但不限于：
[0156] ⑴Ra是苄基或C8_24，优选C12_18、烷基或链烯基，而Rb、R。和Rd独立地是Ci_4烷基， 优选甲基；
[0157] (ii)RiPRb独立地是C8_24、优选C12_18烷基或链烯基，而Re和Rd独立地是Ci_4烷 基，优选甲基；
[0158] (iii)R^C8_24、优选C12_18烧基或链烯基，Rb是具有约2到约100个C2_4烯化氧单 位（优选环氧乙烷单位）的聚氧化烯链，而Re和Rd独立地是Ch烷基，优选甲基；
[0159] (iv)Ra是C8_24、优选C12_18烷基或链烯基，Rb和Rc是具有总共约2到约100个C2_4 烯化氧单位（优选环氧乙烷单位）的聚氧化烯链，而Rd是Ch烷基，优选甲基；
[0160] (v) 1^是具有约2到约100个C2_4烯化氧单位的聚氧化烯链，其中主要是C3_4烯化 氧单位（优选环氧丙烷单位），而Rb、Re和Rd独立地是Ch烷基，优选甲基或乙基。
[0161] 该类型中尤其优选的季铵表面活性基是那些在Claude等的美国专利第 5, 464, 807号中公开的化合物。
[0162] 在一个实施方案中，与所述季铵表面活性基结合的所述阴离子A可以是草甘膦阴 离子。
[0163] 在两性型表面活性剂，包括本领域内习惯更正确地描述为两性离子型的表面活性 剂中，尤其优选的种类包括聚氧乙烯烷基氧化胺、烷基甜菜碱、烷基取代的氨基酸等等。所 述两性型表面活性剂有代表性的例子包括氧化十二烷基二甲基胺、聚氧乙烯（2)氧化椰油 胺和硬脂酰基二甲基甜菜碱。
[0164] 本领域内技术人员可以从标准参考来源中选择不限于上述种类的合适表面活性 齐U，所述标准参考来源包括Gower出版的HandbookofIndustrialSurfactants,第二版 (1997)、MCPublishingCompany出版的McCutcheon'sEmulsifiersandDetergents, 北美和国际版（1997)和Cosmetic，ToiletryandFragraneeAssociation出版的 InternationalCosmeticIngredientDictionary,第六版（1995)卷 1 和卷 2〇
[0165] 本发明组合物的其它可选成份包括改变颜色、粘度、胶凝特性、冰点、吸湿性、结块 行为、溶解速率、分散性或其它配制特性的试剂。
[0166] 草甘膦商业制剂的例子包括但不限于：MonsantoCompany销售的
【主权项】
1. 一种嵌合启动子，所述启动子包含与Act8启动子有效连接的花椰菜花叶病毒35S CaMV启动子的重复增强子，其中所述35S CaMV启动子如SEQ ID N0:29的碱基位置1-523 所示。
2. 权利要求1的嵌合启动子，其中所述嵌合启动子是CaMV: Act8。
3. 权利要求1的嵌合启动子，其中Act8启动子是SEQ ID NO: 10。
4. 权利要求2的嵌合启动子，其中所述嵌合启动子是SEQ ID NO: 29。
5. -种DNA构建物，所述DNA构建物包含一个或多个含有权利要求1-4任一项的嵌合 启动子的表达盒和结构DNA序列；其中所述结构DNA序列有效连接所述嵌合启动子和3'未 翻译区。
6. 权利要求5的DNA构建物，其中所述结构DNA序列是除草剂耐性基因。
7. 权利要求6的DNA构建物，其中所述除草剂耐性基因是草甘膦耐性基因。
8. 权利要求7的DNA构建物，其中所述草甘膦耐性基因是5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷 酸合酶基因或草甘膦氧化还原酶基因。
9. 权利要求7的DNA构建物，其中所述草甘膦耐性基因是arM: CP4基因。
10. 权利要求5的DNA构建物，其中所述结构DNA序列是苏云金芽孢杆菌 从)昆虫防治基因。
11. 一种制备转基因植物的方法，其包括由包含权利要求5-10任一项的DNA构建物的 转基因植物细胞再生转基因植物，其中所述转基因植物包含所述DNA构建物。
12. 权利要求11的方法，其中所述转基因植物包含权利要求7-9中任一项的DNA构建 物，还具有营养性和生殖性草甘膦耐性。
13. 权利要求12的方法，其中所述转基因植物耐受暴露于高达每4000平方米7248克 的草甘膦。
14. 权利要求13的方法，其中所述转基因植物耐受暴露于每4000平方米453-1812克 的草甘膦。
15. 权利要求11-14任一项的方法，其中所述转基因植物是单子叶作物。
16. 权利要求15的方法，其中所述单子叶作物是大麦、玉米、水稻、黑麦、高梁或小麦。
17. 权利要求11-14任一项的方法，其中所述转基因植物是双子叶作物。
18. 权利要求17的方法，其中所述双子叶作物是苜猜、番爺、大豆、棉花、canola或向 日葵。
19. 一种在植物中表达结构DNA序列的方法，该方法包括： (1) 提供权利要求5-10任一项的DNA构建物； (2) 将所述DNA构建物引入植物细胞；和 (3) 使所述植物细胞再生而产生植株，使得所述结构DNA序列在所述植株中可表达。
20. -种防除杂草的方法，该方法包括： (1) 提供用权利要求7-9任一项的DNA构建物转化的作物；和 (2) 对所述作物施用足量草甘膦以防除杂草而不损害所述作物。
21. -种农学上有用的不可生存产品，所述产品是从包含权利要求5-10任一项的DNA 构建物的转基因植物加工得到的，其中所述产品包含所述DNA构建物。
22. 权利要求21的产品，其中所述产品是食品。
23. 权利要求21的产品，其中所述产品是皮棉。
24. 权利要求21的产品，其中所述产品是营养物。
25. 权利要求1-4任一项的嵌合启动子在构建转基因植物中的用途，其中所述转基因 植物包含所述嵌合启动子。
26. -种制备转基因草甘膦耐性植物的方法，其包括： (a) 使转基因植物与另一植物杂交，其中所述转基因植物包含权利要求7-9任一项的 DNA构建物； (b) 获得来源于步骤（a)的杂交的至少一个子代植物；和 (c) 选择草甘膦耐性子代，其中所述子代包含所述DNA构建物，并且是转基因草甘膦 耐性植物。
27. 权利要求26的方法，其中所述步骤（c)包括用草甘膦喷洒子代。
28. 权利要求26的方法，其中所述步骤（c)包括用杂交或扩增方法检测所述DNA构建 物。
29. -种生长转基因草甘膦耐性植物的方法，其包括： (1) 种植至少一种种子,其中所述种子包含权利要求7-9任一项的DNA构建物；并 (2) 使所述种子长成植物，由此生长转基因植物，其中所述转基因植物包含所述DNA 构建物，并且是草甘膦耐性植物。 30?-种嵌合启动子，其为 SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30 或 SEQ ID NO: 27。
【专利摘要】本发明涉及新型植物表达构建物。更具体地说，本发明提供了包含5’调节序列以调节有效连接的基因在植物中表达的DNA构建物。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-82, C12N15-09, A01H5-00
【公开号】CN104531702
【申请号】CN201410680468
【发明人】L. 芬彻 K., 辅拉辛斯基 S., Q. 威尔金森 J.
【申请人】孟山都技术有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2000年12月12日
【公告号】CA2394984A1, CA2394984C, CA2635905A1, CA2635905C, CA2640686A1, CA2641218A1, CA2641218C, CA2839066A1, CN1434868A, CN100425701C, CN101311267A, CN101353658A, CN101353669A, EP1240340A2, EP1240340B1, EP1632576A2, EP1632576A3, EP2339005A2, EP2339005A3, EP2339006A2, EP2339006A3, US6462258, US6660911, US6919495, US6949696, US7112725, US7141722, US8822666, US8987434, US20020144304, US20030199681, US20030199682, US20050005332, US20050022261, US20070022494, US20070094746, US20130157859, US20130338005, US20150057155, WO2001044457A2, WO2001044457A3