9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQID NO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQ IDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所公开的启动子区；一个有效连接的可转录序 列；和一个转录终止序列。植物表达构建物也可以包含其它序列，其中包括但不限于包含可 用于克隆目的的限制酶位点的多接头序列。
[0124] 棺物表汰构律物中的遗传元件
[0125] 植物表达构建物可以包含不止一个各自与不同启动子有效连接的可表达基因序 列。许多启动子可用于任何目的基因的植物基因表达，所述目的基因包括但不限于选择标 记、评价标记、有害生物耐性基因、抗病性基因、营养强化基因和任何其它有农学意义的基 因。可用于植物基因表达的组成型启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒（CaMV) P-35S启动子，该启动子赋予在大多数植物组织，包括单子叶植物（参见，例如，Dekeyser 等，PlantCell2 :591，1990 ;Terada和Shimamoto，Mol.Gen.Genet. 220 :389,1990)中的组 成型、高水平表达（参见，例如，〇del等，Nature313 :810,1985);CaMV35S启动子的串联 重复形式、增强的35S启动子（P-e35S)、胭脂氨酸合酶启动子（An等，PlantPhysiol. 88 : 547,1988)、章鱼氨酸合酶启动子（Fromm等，PlantCelll:977,1989);如美国专利第 5, 378, 619号所述的玄参花叶病毒（P-FMV)启动子和FMV启动子的增强形式（P-eFMv)(其 中P-FMV的启动子序列串联重复）、花椰菜花叶病毒19S启动子、甘鹿杆状病毒启动子、鸭妬 草黄斑驳病毒启动子以及其它已知在植物细胞中表达的植物DNA病毒启动子。
[0126] 多种对环境信号、激素信号、化学信号和/或发育信号应答的植物基因启动子可 用于在植物细胞中表达有效连接的基因，所述启动子包括由下列信号调节的启动子：（1) 热（Callis等，PlantPhysiol. 88 :965,1988)，（2)光（如豌豆rbcS_3A启动子，Kuhlemeier 等，PlantCell1:471，1989;玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen，PlantCell3:997, 1991 ;或叶绿素a/b结合蛋白启动子，Simpson等，EMBOJ. 4 :2723,1985)，（3)激素如脱落 酸（Marcotte等，PlantCell1 :969，1989)，（4)创伤（如wunI，Siebertz等，PlantCell 1 :961，1989);或（5)化学药品如茉莉酮酸甲酯、水杨酸或安全剂。使用（6)器官特异性启 动子（如Roshal等，EMBOJ. 6 :1155,1987;Schernthaner等，EMBOJ. 7 :1249,1988;Bustos 等，PlantCelll:839,1989)也是有利的。
[0127] 本发明的启动子是能够在快速生长的分生组织和生殖组织中转录有效连接的DNA 序列、并且可以在表达构建物中有效连接任何目的基因的植物启动子。
[0128] 植物表达构建物可以包括位于转基因中多肽编码序列上游或下游的RNA加工 信号如内含子。此外，所述表达构建物可以包括来自植物基因3'非翻译区的其它调节 序列（Thornburg等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:744(1987);An等，PlantCell1 : 115 (1989))，例如包括3'终止子区以增加所述mRNA的mRNA稳定性，例如马铃薯的PI-II终 止子区或章鱼氨酸或胭脂氨酸合酶3'终止子区。mRNA的5'非翻译区在翻译起始中起重要 作用，也可以成为植物表达构建物中的遗传成分。例如，已经证明来自热激蛋白基因的非翻 译5'前导序列增强植物中的基因表达（参见，例如，美国专利5, 362, 865)。这些其它的上 游和下游调节序列可以来自对于所述表达构建物中存在的其它元件为天然或异源的来源。
[0129] 用本发明的启动子序列控制植物细胞中的基因表达。所公开的启动子序列是构 成用于植物转化的构建物的一部分的遗传成分。本发明的启动子序列可以与任何合适的 植物转化质粒或构建物一起使用，所述质粒或构建物包含如所述的可选择或可筛选标记以 及相关调节元件，以及一种或多种以足以赋予特定所需性状的方式表达的核酸。本发明设 想的有农学意义的合适结构基因的例子包括但不限于：一种或多种耐虫性基因如苏云金 芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis) (B.t.)基因、有害生物耐性基因如防制真菌病的基 因、除草剂耐性基因如赋予草甘膦耐性的基因、改善品质的基因，所述品质指例如产量、营 养强化、环境或胁迫耐性、或任何在植物生理学、生长、发育、形态学或植物产品上的所需 改变。例如，结构基因将包括任何赋予耐虫性的基因，包括但不限于如下列文献所述的芽 孢杆菌属昆虫防制蛋白基因：W09931248,特此通过引用完整地结合到本文中，美国专利第 5, 689, 052号，特此通过引用完整地结合到本文中，美国专利第5, 500, 365号和第5, 880275 号，特此通过引用完整地结合到本文中。在另一实施方案中，所述结构基因可以赋予对除草 剂草甘膦的耐性，赋予所述耐性的基因包括但不限于农杆菌属（Agrobacterium)菌株CP4 草甘膦抗性EPSPS基因（aroA:CP4)，如美国专利第5, 633, 435所述，特此通过引用完整地 结合到本文中，或草甘膦氧化还原酶基因（G0X)，如美国专利第5, 463, 175所述，特此通过 引用完整地结合到本文中。
[0130] 或者，所述DNA编码序列可以通过编码非翻译RNA分子，例如通过反义介导的机制 或共阻抑介导的机制引起内源基因表达的定向抑制，从而影响这些表型（参见，例如，Bird 等，Biotech.Gen.Engin.Rev. 9 :207,1991)。所述RNA也可以是工程化以切割所需内源mRNA 产物的催化性RNA分子（即核酶）（参见例如，Gibson和Shillitoe，Mol.Biotech. 7 :125， 1997)。因此，产生表达目的表型改变或形态学改变的蛋白或mRNA的任何基因可用于实施 本发明。
[0131] 除位于上游（5'）或DNA序列内的调节元件或序列外，还有下游（3'）序列影响基 因表达。因此，本文所用术语调节序列指与细胞的蛋白质合成装置联合作用，控制、介导或 影响基因产物表达的位于DNA序列上游、中间或下游的任何核苷酸序列。
[0132] 本领域内的技术人员知道适于植物转化的构建物。最好使用所述的可筛选或可 评价标记，将本发明的启动子序列掺入表达构建物中，并在瞬时分析中进行测试以在转化 植物中提供基因表达的指标。在瞬时测定中检测基因表达的方法是本领域内技术人员已 知的。已经报道了使用各种植物、组织和DNA传递系统瞬时表达标记基因。例如，瞬时分析 的类型可以包括但不限于在任何瞬时植物测定中使用任何目的植物物种，通过对组织的电 穿孔或粒子轰击直接传递基因。这样的瞬时系统将包括但不限于来自小麦悬浮培养物的原 生质体（Zhou等，PlantCellReports12 :612,1993)、小麦叶原生质体的电穿孔（Sethi 等，J.CropSci. 52:152,1983);由玉米组织制备的原生质体的电穿孔（Sheen，J.ThePlant Cell3:225,1991)、或对特定目的组织的粒子轰击。本发明包括应用任何瞬时表达系统来 评价与选定报道基因、标记基因或目的农学基因有效连接的调节序列。设想在瞬时测定中 通过合适传递系统测试的植物组织的例子将包括但不限于叶基组织、愈伤组织、子叶、根、 胚乳、胚、花组织、花粉和表皮组织。
[0133] 在瞬时测定中可以使用任何可评价或可筛选标记。对本发明启动子或5'调节序 列进行瞬时分析优选的标记基因包括葡糖醛酸糖苷酶（GUS)基因或绿荧光蛋白（GFP) 基因。将包含有效连接标记基因的5'调节序列的表达构建物传递到组织中，然后根据所述 标记，通过合适的机制分析所述组织。使用定量或定性分析作为工具，评价所述5'调节序 列当有效连接目的农学基因时在稳定植物中的可能表达分布型。最后，将本发明的5'调节 序列直接掺入合适的植物转化表达构建物，所述构建物包含有效连接可转录目的DNA序列 的5'调节序列，将所述构建物转化进植物，分析稳定转化植株及其后代的所述5'调节序列 赋予的所需表达分布。
[0134] 将外源DNA引入植物细胞的合适表达构建物包括但不限于用于农杆菌属介导的 方法中的无毒性（disarmed)Ti质粒。这些构建物可以包含一个抗性标记、1-2个T-DNA边 界、大肠杆菌（E.coli)和农杆菌属的复制起点以及一个或多个目的基因和相关调节区。本 领域内的技术人员知道在农杆菌介导的方法中，可以利用许多菌株和方法。这样的菌株包 括但不限于农杆菌属菌株C58、LBA4404、EHA101和EHA105。尤其优选的菌株是根癌农杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)菌株。
[0135] 可以通过本发明方法引入的核酸的例子包括，例如，来自另一物种的DNA序列或 基因，或甚至起源于同一物种或在同一物种中存在、但通过并非传统繁殖或育种技术的遗 传工程方法掺入受体细胞的基因或序列。然而，术语"外源的"也用于指不在受转化的细胞 中正常存在、或者可能仅仅不以所述转化DNA区段或基因中出现的形式、结构存在的基因， 或者指正常存在、但人们希望以不同于天然表达模式的方式（如过量表达）表达的基因。因 此，术语"外源的"基因或DNA用于指任何引入受体细胞的基因或DNA区段，而不论所述细 胞中是否已经存在相似基因。外源DNA中包括的DNA类型包括：已经在所述植物细胞中存 在的DNA、来自其它植物的DNA、来自不同生物的DNA、或外部产生的DNA如包含基因反义信 息的DNA序列或编码基因的合成或修饰形式的DNA序列。
[0136] 可以通过任何植物转化方法将包含本发明启动子序列的植物转化构建物引入植 物。可以利用几种方法将DNA序列引入植物细胞，这些方法是本领域内众所周知的。合适 的方法包括但不限于细菌感染（如用上文所述的农杆菌属）、二元细菌人工染色体构建物、 直接传递DNA(如通过PEG介导的转化、干燥/抑制介导的DNA摄入、电穿孔、与碳化硅纤维 一起揽拌）以及加速DNA包被的粒子（在Potrykus，Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol. Biol.，42 :205,1991 中综述）。
[0137] 特异性转化双子叶植物的方法主要使用根癌农杆菌。例如，已经报道的转基因植 物包括但不限于棉花（美国专利第5, 004, 863号；美国专利第5, 159, 135号；美国专利第 5, 518, 908号，W097/43430)、大豆（美国专利第5, 569, 834号；美国专利第5, 416, 011号； McCabe等，Bio/Technology，6 :923,1988 ;Christou等，PlantPhysiol.，87 :671，1988);芸 苔属（Brassica)(美国专利第 5, 463, 174 号）以及花生（Cheng等，PlantCellRep.，15 : 653.1996) 。
[0138] 已经报道了转化单子叶植物的相似方法。已经针对多种作物描述了使用这些方 法的转化和植物再生，所述作物包括但不限于石习柏（Asparagusofficinalis;Bytebier 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. ,84:5345,1987);大麦（Hordeumvulgarae;Wan和 Lemaux,PlantPhysiol. , 104 :37,1994);玉米（Zeamays;Rhodes,C.A?等，Science, 240 : 204,1988 ;Gordon_Kamm等，PlantCell, 2 :603,1990;Fromm等，Bio/Technology, 8 :833, 1990;Koziel等，Bio/Technology，ll:194，1993);燕麦（Avenasativa;Somers等，Bio/ Technology，10:1589，1992);鸡脚草（Dactylisglomerata;Horn等，PlantCellRep.， 7:469,1988);水稻（Oryzasativa，包括indica变种和japonica变种，Toriyama等，Bio/ Technology, 6:10,1988;Zhang等，PlantCellRep., 7:379,1988;Luo和Wu,PlantMol. Biol.Rep.，6 :165，1988;Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.，76 :835，1988;Christou等， Bio/Technology，9:957，1991);高梁（Sorghumbicolor;Casas，A.M?等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，90:11212，1993);甘鹿（Saccharumspp.;Bower和Birch，PlantJ.，2:409， 1992);華状羊茅（Festucaarundinacea;Wang，Z.Y?等，Bio/Technology，10:691，1992); 草皮草（Agrostispalustris;Zhong等，PlantCellRep.，13 :1，1993);小麦（Triticum aestivum;Vasil等，Bio/Technology，10 :667,1992;WeeksT?等，PlantPhysiol.，102 : 1077,1993;Becker等，Plant，J. 5 :299,1994)和苜猜（Masoud，S.A?等，Transgen.Res.，5 : 313.1996) 。对于本领域内技术人员明显的是：可以利用和改变多种转化方法，从多种目的 作物产生稳定的转基因植物。
[0139] 棺物分析方法
[0140] 分析转化植物中目的基因的存在以及本发明启动子序列赋予的表达水平和/或 分布型。本领域内的技术人员知道可用于分析转化植物的多种方法。使用多种方法评价基 因表达，并确定所引入的基因是否整合、是否正常起作用以及是否如所预期地遗传。对于本 发明，可以通过测定启动子有效连接的基因的表达水平，评价所述启动子。使用报道基因， 通过瞬时测定方法，可以确定对启动子功能的初步评价，但从对稳定植物的分析可以获得 更确定性的启动子评价。植物分析方法包括但不限于DNA印迹分析或RNA印迹分析、基于 PCR的方法、生物化学分析、表型筛选方法、田间评价和免疫诊断学测定。
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