用核酸复制技术获得片段，例如使 用分子生物学领域技术人员众所周知的重组DNA技术的PCR(聚合酶链式反应）技术。对于 使用特定扩增引物对扩增靶核酸序列（如通过PCR)，"严格PCR条件"指这样的条件：允许 所述引物对仅与具有对应野生型序列（或其互补物）的引物将会结合的靶核酸序列杂交， 并且最好产生单一扩增产物。
[0109] 本领域内的技术人员知道制备植物基因组DNA的方法。在一种方法中，可以用 限制酶部分消化，然后根据大小选择处于特定大小范围内的DNA片段，可以从选定物种 制备基因组DNA文库。可以将所述基因组DNA克隆进合适的构建物，所述构建物包括但 不限于噬菌体，使用从许多销售商（参见例如Stratagene，LaJollaCA或GibcoBRL， Gaithersburg,MD)获得的合适克隆试剂盒用合适的构建物如噬菌体制备。
[0110] 在另一实施方案中，可以修饰本文公开的启动子的核苷酸序列。本领域内的技术 人员可以创造在核苷酸序列上有改变的DNA分子。可以修饰或改变如SEQIDN0:9、SEQID N0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、SEQ IDN0:25、SEQIDN0:26、SEQIDN0:27、SEQIDN0:28、SEQIDN0:29 和SEQIDN0:30 所示的本发明的核苷酸序列，以增强它们的控制特性。例如，可以通过在基于PCR的DNA修 饰方法中插入、缺失或取代模板序列而修饰所述序列。"变异型"DNA分子是包含如下改变 的DNA分子：其中天然序列的一个或多个核苷酸发生了缺失、添加和/或置换，但最好同时 基本保留启动子功能。在启动子片段的情况下，"变异型"DNA可以包括影响其有效连接的 最小启动子转录的改变。例如通过标准DNA诱变技术或通过化学合成所述变异型DNA分子 或其部分，可以产生变异型DNA分子。
[0111] 本发明的启动子序列除可用于调节基因表达外，还可用作核酸杂交实验中的探针 或引物。本发明的核酸探针和引物可以在严格条件下与靶DNA序列杂交。术语"严格杂交 条件"定义为：在该条件下探针或引物特异性地与靶序列杂交，而不与非靶序列杂交，该条 件可以根据经验确定。术语"严格条件"按照通过特定杂交程序（参见例如Sambrook等， 1989,在 9. 52-9. 55,Sambrook等，1989 在 9. 47-9. 52,9. 56-9. 58 ;Kanehisa，Nuci.Acids Res. 12 :203-213,1984 ;和Wetmur和Davidson，J.Mol.Biol. 31 :349-370,1968)使核酸探 针与靶核酸的杂交（即与特定目的核酸序列的杂交），在功能上加以定义。促进DNA杂交的 合适严格杂交条件是本领域内技术人员已知的，例如，在6.Ox氯化钠/柠檬酸钠（SSC)中 约45°C，然后用2.OxSSC在50°C洗涤，或者所述条件可以在实验室手册中找到，所述实验 室手册包括但不限于CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.， 1989,6.3.1-6. 3. 6。例如，可以在以下范围内选择洗涤步骤中的盐浓度：从约2.OxSSC在 50°C的低严格性到约0. 2xSSC在50°C的高严格性。此外，洗涤步骤中的温度可以从室温 (约22°C)的低严格性条件增加到约65°C的高严格性。可以同时改变温度和盐，或者可以 使温度或盐浓度保持恒定，而改变另一变量。对于高严格性，例如，使用DNA或RNA探针或 引物的杂交可以在以下条件下进行：6xSSC，0. 5%SDS，5xDenhardt's，100iig/mL非特异 性DNA(如超声处理过的鲑精DNA)，65°C，用0. 5xSSC，0. 5%SDS在65°C下洗涤。
[0112] 假如一种核酸分子与另一种核酸分子显示完全互补性，那么说前者是后者的"互 补物"。如本文所用，当其中一种分子的每一个核苷酸都与另一种分子的核苷酸互补，就说 这两种分子显示"完全互补性"。假如两种分子相互杂交，其稳定性足以允许它们至少在 常规的"低严格性"条件下保持相互退火，那么这两种分子就是"最小互补的"。相似地， 假如两种分子相互杂交，其稳定性足以允许它们在常规的"高严格性"条件下保持相互退 火，那么这两种分子就是"互补的"。人们考虑：假如探针或引物与靶序列结合的特异性是 保守的，那么就可以用低严格性条件如低杂交和/或洗涤温度来鉴定具有较低程度序列相 似性的相关序列。因此，由于本发明核苷酸序列与互补DNA片段序列段选择性形成双链体 分子的能力，因此可以使用它们。通过杂交检测DNA区段是本领域内技术人员众所周知 的，因此根据所设想的应用，人们会希望使用不同的杂交条件以获得探针对靶序列不同程 度的选择性，而选择的方法将取决于所希望的结果。常规严格性条件描述于Sambrook等， MolecularCloning,ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborPress,Cold SpringHarbor,NewYork, 1989 和Haymes等，NucleicAcidHybridization,APractical Approach,IRLPress,Washington,DC,1985。
[0113] 在本发明的一个实施方案中，在其它植物组织的杂交测定中使用核酸序列SEQID N0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQID NO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26、或这些序列的片段、区、顺式元件或寡聚物，以鉴定 密切相关或同源的基因和相关的调节序列。这些包括但不限于在任何基体上进行的DNA印 迹分析或RNA印迹分析，所述基体包括但不限于合适制备的植物组织、纤维素、尼龙或组合 滤膜、芯片或载玻片。这样的方法是本领域内众所周知的，并且可以在由经销商提供的试剂 盒或制剂中获得。
[0114] 本文所用的核酸片段是并非全长的核酸的部分。例如，对于本发明，任何长度短于 所公布的SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQ IDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26的核苷酸序列的核苷酸序列都 被认为是片段。片段也可以包括能够在如上文所定义的严格杂交条件下与天然核酸特异性 杂交的至少最小长度。这样的最小片段的长度最好是天然核酸序列的至少8个核苷酸、更 优选15个核苷酸、甚至更优选至少20个核苷酸、最优选至少30个核苷酸。
[0115] "探针"是分离的核酸，其上连接有常规的可检测标记或报道分子，例如放射性同 位素、配体、化学发光试剂或酶。"引物"是分离的核酸，其通过核酸杂交与互补靶DNA链退 火，形成引物和靶DNA链之间的杂交体，然后由聚合酶如DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。可 以使用引物对扩增核酸序列，如通过聚合酶链式反应（PCR)或其它常规核酸扩增方法。
[0116] 探针和引物的长度一般为11个核苷酸或更长，最好18个核苷酸或更长，更优选 25个核苷酸、最优选30个核苷酸或更长。所述探针和引物在高严格性杂交条件下与靶 DNA或RNA序列特异性杂交，在低严格性条件下与另一物种的靶天然序列特异性杂交。依 照本发明的探针和引物最好与天然序列有完全序列相似性，虽然探针与天然序列不同并且 可以通过常规方法设计保留与靶天然序列杂交的能力。制备和使用探针和引物的方法描 述于，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第二版，第 1-3 卷，Sambrook等编 辑，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989 (下文称为 "Sambrook等，1989，'）；CurrentProtocolsinMolecularBiology，Ausubel等编辑，Green PublishingandWiley-Interscience，NewYork，1992 (定期更新）（下文称为"Ausubel 等，1992"）；和Innis等，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications, AcademicPress:SanDiego, 1990。可以从已知序列衍生出PCR引物对，例如通过使用 为该目的的计算机程序如Primer(Version0.5，（D卜WhiteheadInstitutefor BiomedicalResearch,Cambridge,MA)。可以使用基于本文公开的天然启动子序列的引物 和探针确认所公开的序列，必要时使用所述引物和探针通过常规方法如重克隆和重测序来 修饰所公开的序列。
[0117] 构律物和表汰构律物
[0118] 可以将依照本发明的天然或合成的核酸掺入能够引入宿主细胞并在宿主细胞中 复制的重组核酸构建物中，一般是DNA构建物。在一个优选的实施方案中，将如SEQIDN0: 9,SEQIDNO：10,SEQIDNO：1USEQIDNO：12,SEQIDNO：22,SEQIDNO：23,SEQID NO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29 和SEQ IDNO:30所示的本发明的核苷酸序列或其片段、变异体或衍生物掺入表达盒，所述表达盒 包括与遗传元件例如可选择、可筛选或可评价的标记基因有效连接的本发明的启动子区。
[0119]在另一实施方案中，如SEQIDN0 :9、SEQIDN0 :10、SEQIDN0 :11、SEQIDN0 : 12、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQID NO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29和SEQIDNO:30所示的本发明所公开的核酸序列有 效连接到遗传元件，如赋予与下列性状有关的所需特征的核酸：植物形态学、生理学、生长 和发育、产量、营养强化、抗病性或有害生物耐性、或环境或化学药品耐性。这些遗传元件如 标记基因或目的农学基因可以在转化植物细胞或转化植物的鉴定中起作用，或产生具有农 学应用的产物。
[0120] 在另一实施方案中，一种遗传元件产生作为选择装置的产物，该产物在可再生植 物组织中起作用，产生赋予所述植物组织对在其它情况下有毒的化合物的抗性的化合物。 用作可选择、可筛选或可评价标记的目的基因包括但不限于GUS( 0 -葡糖醛酸糖苷酶的编 码序列）、GFP(绿荧光蛋白的编码序列）、LUX(萤光素酶的编码基因）、抗生素抗性标记基 因或除草剂耐性基因。转座子和相关抗生素抗性基因的例子包括转座子Tns(bla)、Tn5(npt II)、Tn7(dhfr)、青霉素、卡那霉素（和新霉素、G418、博来霉素）；氨甲碟呤（和三甲氧苄二 氨嘧啶）；氯霉素；卡那霉素和四环素。
[0121] 在一份关于微生物应用的报道中已经概述了对于植物选择标记有用的特征 (AdvisoryCommitteeonNovelFoodsandProcesses，1994 年 7 月）。这些包括产生最 小数目未转化组织的严格选择、不明显干扰再生的大量独立转化事件、应用于大量物种、以 及评价组织中所述标记存在的测定的可用性。
[0122] 许多选择标记基因是本领域内已知的，几种抗生素抗性标记满足这些标准，包括 卡那霉素抗性标记（nptII)、潮霉素B抗性标记（aphIV)和庆大霉素抗性标记（aac3和 aacCA)。有用的显性选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因（如潮霉素抗性、卡那霉 素抗性、博来霉素抗性、G418抗性、链霉素抗性或壮观霉素抗性）；和除草剂抗性基因（如 膦丝菌素乙酰转移酶）。选择除草剂抗性转化子的有用策略描述于，例如，Vasil，Cell CultureandSomaticCellGeneticsofPlants,第I-III卷，LaboratoryProcedures andTheirApplicationsAcademicPtess，NewYork，1984。尤其优选用于本发明中的 选择标记基因是赋予化合物抗性的基因，所述化合物如抗生素如卡那霉素，以及除草剂如 草甘勝G)ella_Cioppa等，Bio/Technology5 (6)，1987,美国专利 5, 463, 175,美国专利 5, 633, 435)。也可以实施其它选择装置，这些选择装置也处于本发明的范围内。
[0123] 为实施本发明，使用制备和应用DNA构建物和宿主细胞的常规组合物和方法，如 特别是在Sambrook等，1989中讨论的。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是植物 细胞。许多适于转染植物细胞或适于建立转基因植物的DNA构建物已经在如Pouwels等， CloningVectors:ALaboratoryManual，1985,增刊 1987);Weissbach和Weissbach， MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,1989；Gelvin等，Plant MolecularBiologyManual,KluwerAcademicPublishers, 1990 ;和R.R.D.CroyPlant MolecularBiologyLabFax，BI0SScientificPublishers，1993 中描述。植物表达构建物 可以包括，例如，处于5'和3'调节序列转录控制下的一个或多个克隆植物基因。它们也可 以包括如所述选择含有所述表达构建物的宿主细胞的选择标记。这样的植物表达构建物还 包含一个启动子调节区（如控制诱导型或组成型表达、环境调节或发育调节表达、细胞特 异性或组织特异性表达的调节区）、一个转录起始位点、一个核糖体结合位点、一个RNA加 工信号、一个转录终止位点和一个聚腺苷酸化信号。也包括其它细菌起源的序列以允许所 述构建物在细菌宿主中克隆。所述构建物一般还将包含广宿主范围的原核生物复制起点。 在一个尤其优选的实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞，所述植物表达构建物包含：一个 如SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11、SEQIDN0:12、SEQIDN0:22、SEQIDN0: 23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQID NO:29和SEQIDNO:30所公开的启动子区；一个有效连接的可转录序列；和一个转录终止 序列。设想作为表达载体中遗传成分的其它调节序列包括但不限于可以与所述启动子偶联 的非翻译前导序列。在一个尤其优选的实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞，所述植物表 达构建物包含：一个如SEQIDN0: