引物组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是分支杆菌鉴定技术领域。具体而言，涉及引物组 合物及其用途，更具体的，本发明涉及引物组合物、试剂盒及其在对待测分支杆菌进行菌种 鉴定中的用途，构建待测分支杆菌ITS区域核酸测序文库的方法，对待测分支杆菌进行菌 种鉴定的方法、系统，以及同时对多个待测分支杆菌样本进行菌种鉴定的方法和系统。
【背景技术】
[0002] 分枝杆菌是好氧的细胞内细菌生物类属，其在感染宿主后存活在单核细胞和巨噬 细胞的内体区室（endosomalcompartments)中。结核杆菌（Mycobacteriumtuberculosis) 为革兰氏阳性细菌中分枝杆菌属（mycobacterium)的一个成员，而非结核性分枝杆菌 (mycobacteriumotherthantuberculosis)是分枝杆菌属中除了结核杆菌以外细菌的统 称。其中的鸟型结核菌（Mycobacteriumaviumcomplex)广泛的自艾滋病患的检体被分离 到后，非结核性分枝杆菌才受到重视。非结核性分枝杆菌在环境中普遍存在且种类繁多，目 前超过九十余种。
[0003] 结核分枝杆菌（M.tuberculosis)及其复合群传染了世界人口的大约三分之一， 约17亿人患结核病（Kochi，A.，结核（Tubercle)72 :1-6(1991))，在世界范围内使更多 人丧生（每年大约3百万）（发病率与死亡率周报（MorbidityandMortalityWeekly Report) 42 :961-964 (1993));其它治病性分枝杆菌如鸟分枝杆菌（M.avium)复合体（MAC)、 副结核分枝杆菌（M.paratuberculosis)、溃瘍分枝杆菌（M.ulcerans)、麻风分枝杆菌 (M.leprae)、堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii)、海分枝杆菌（M.marinum)、玛尔摩尔分枝杆 菌（M.malmoense)和偶发分枝杆菌复合体也是常见的病原体（参见：Wayne，L.G.，临床微 生物学综述（Clin.Micro.Rev.)5 :1-25(1992)或Falkinham，J.O.，临床微生物学综述 9 : 177-215(199)关于不同分枝杆菌病原体的综述），主要易感者是慢性呼吸道疾患（C0PD、肺 结核残余空洞、矽肺、支气管扩张症、肺囊性纤维化等）和免疫抑制特别是AIDS患者。鸟分 枝杆菌复合群（Mycobacteriumavium)在所有晚期AIDS患者的几乎半数中引起传播性疾 病（Nightingale，S.D?等人，传染病杂志（Jour.Infect.Dis.) 165:1082-1085 (1992))。世 界卫生组织估计，到2000年为止感染人免疫缺陷病毒（HIV)的人数将超过4千万（世界卫 生组织（文件WH0/GPA/CNP/EVA/93. 1)全球AIDS计划（1993))。副结核分枝杆菌（鸟分枝 杆菌的一个亚种）在反刍动物中引起副结核病，引起农产品加工业（例如，牛奶和牛肉）每 年损失，耗费了大量的社会费用。
[0004]人类分枝杆菌疾病包括结核病（由结核分枝杆菌M.tuberculosis引起）、麻疯 病（由麻疯分枝杆菌M.leprae引起）、Bairnsdale溃瘍病（由溃瘍分枝杆菌M.ulcerans 引起）和由海分枝杆菌（Emarinum)、堪萨斯分枝杆菌（M.kansasii)、瘰病分枝杆菌 (M.scrofulaceum)、苏尔加分枝杆菌（M.szulgai)、蟾蜍分枝杆菌（M.xenopi)、偶发分枝杆 菌（M.fortuitum)、龟分支杆菌（M.chelonei)、嗜血分枝杆菌（M.haemophilum)和胞内分枝 杆菌（M.intracellulare)引起的各种感染。证据显示，非结核性分枝杆菌所引发的院内传 染正逐步增加，且所导致的状况已由无害的移生转变成具侵害性的感染。此外，非结核性分 枝杆菌亦可造成微生物检体的污染而导致不必要的治疗及可能有害的诊断步骤。分析菌株 的种类及检体来源可协助确认菌群的重要性，一旦怀疑发生突发（out-break)或假性群突 发，分析技术应可迅速确认来源及确定适当的控制措施。
[0005] 因此，目前结核分枝杆菌鉴定、与非结核分枝杆菌的鉴别，受到广泛关注，成为研 究热点，越来越多的从基因层面，采用分子生物学技术进行研究及产品研发，不仅突破了结 核与非结核自身生长时间长、条件苛刻的局限，甚至比优化过的液体培养时间更短。
[0006] 然而，目前的分枝杆菌鉴定方法仍有待改进。
【发明内容】
[0007] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0008] 现今比较常见的针对某特定区域的Q-PCR鉴定菌种技术，基因芯片核酸探针杂交 技术等等分子生物学技术都已得到广泛运用，但是同时由于芯片杂交技术原理及荧光信号 对Q-PCR技术的限制，两者成本都不低，一次反应检测的种类非常有限。
[0009] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于提出一种成本低、效率高、敏感度高、方便快捷且一次反应能够鉴别多种菌种的分支杆 菌菌种鉴定方法。具体地，发明人发现，基于基因层面，分枝杆菌16S-23SrRNA转录间隔 区，即分支杆菌的ITS区域，高度保守，其序列和长度依菌种不同差异较大，因而，发明人 采用该分枝杆菌特定区域--ITS区域，进行对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴 另IJ，具体地，其通过设计获得在不同分枝杆菌之间的同源性非常高的特异性引物（SEQID NO: 1-4)，对待测样本的分枝杆菌特定区域进行扩增并测序，经比对一次反应即可对同一样 本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，具有敏感度高、方便全面、快速的优点。
[0010] 因而，根据本发明的一个方面，本发明首先提供了一种引物组合物。根据本发明的 实施例，该引物组合物包含：第一引物组，所述第一引物组的核酸序列如SEQIDN0:1-2所 示；以及第二引物组，所述第二引物组的核酸序列如SEQIDNO: 3-4所示。发明人惊奇地发 现，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆菌特定区域--ITS区域，并且该引物组合 物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均适用，能够有效用于分支杆菌 菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的鉴别。进而，利用本发明的引物 组合物对包含ITS区域的待测分支杆菌核酸样本进行两轮PCR扩增，一步即能够实现分支 杆菌ITS区域核酸的富集，进而测序后，能够有效获得待测分支杆菌核酸样本ITS区域的核 酸序列，经过比对分析即可容易地实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支杆 菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本低、 效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
[0011] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试 剂盒包含前面所述的引物组合物。如前所述，本发明的引物组合物能够特异性识别分枝杆 菌ITS区域，并且该引物组合物在不同分枝杆菌之间的同源性高，对各种分支杆菌菌种均 适用，能够有效用于分支杆菌菌种鉴定，尤其是对结核性分枝杆菌和非结核性分枝杆菌的 鉴别，因而，本发明的试剂盒能够有效用于分支杆菌菌种鉴定尤其是结核性分枝杆菌和非 结核性分枝杆菌的鉴别，并且，利用本发明的试剂盒，通过对待测分支杆菌样本进行扩增、 测序和比对分析，一次即能够实现待测分支杆菌ITS区域核酸的富集并有效获得待测分支 杆菌核酸样本ITS区域的核酸序列，实现对待测分支杆菌的菌种鉴定，而并不受待测分支 杆菌菌种的限制，并且，一次反应即可对同一样本中存在的多种分枝杆菌进行鉴别，成本 低、效率高、敏感度高、方便、快速，鉴定结果准确、可靠，可重复性好。
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