用于检测A类、B类、C类及D类β-内酰胺酶基因的菌落多重PCR用的引物和试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测内酰胺酶基因的引物对。本发明还涉及用于检测 内酰胺酶基因的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在病原菌中的多重抗生素抗性的出现和传播是全球性的健康危机^ 内酰胺 抗生素是用于治疗细菌感染的最成功的药物之一并且占据了全球抗生素市场总额的大约 65% 2。因此，通过获得编码内酰胺酶的基因所致的对内酰胺抗生素的抗性是如以 下的革兰氏阴性病原菌中最严重的问题之一：各种肠杆菌科、假单胞菌属以及鲍氏不动杆 菌中的菌3,4。在1940年公开了观察内酰胺酶的首篇报告之后5,也就是引入首个商用 抗生素（青霉素）的前一年，超过1，200个不同的内酰胺酶（bla)基因已经在临床菌株 中得到鉴别，显示了bla基因由于其连续突变所致的显著多样性4。所述bla基因基于其氨 基酸序列和官能团可被分成4种主要类别A-D。A类、C类及D类酶利用丝氨酸用于0-内 酰胺水解，而B类金属酶需要二价锌离子用于底物水解4。在这些酶中，吸引最多临床关注 的内酰胺酶是超广谱内酰胺酶（ESBL)，其水解大多数青霉素和第三或第四代具有 氧亚氨基侧链的头孢菌素；以及碳青霉烯酶，其可水解几乎所有内酰胺类，包括碳青霉 烯类 6 8。具有ESBL基因和具有碳青霉烯酶基因的革兰氏阴性病原体是造成死亡率增加和 严重的医院爆发的原因，这提出了严重的治疗和感染控制挑战 3'7。
【发明内容】
技术问题
[0003] 为实现爆发的早期检测并使耐药菌传播减至最小，用于检测抗性基因的快速诊断 方法的可用性也是非常重要的。使用经典的基于培养的表型试验测定易感性或抗性是临 床微生物实验室中使用的一般方法，但此项工序耗时并且不容易检测到由肠杆菌科引起的 ESBL和碳青霉烯酶产生，这是由于酶表达的可变水平以及一些抗生素组合的不良特异性 相反，基于分子的诊断方法的实施轻易克服了这些限制并且可以提高检测抗性基因的 速度和准确性，这对于感染控制和在医院和社区环境中的治疗选择是重要的9。然而，先前 开发的用于bla基因检测的方法受限于若干bla基因的鉴别并且用于检测所有临床上重要 的bla基因的分子诊断方法是不可用的11 17。因为这些方法仅可以检测部分类型的bla基 因，所以其不能代替易感性测试。
[0004] 为了解决这类问题，本发明人设计了即用型的54个PCR引物对，其最佳特征在于 容易用于以完美的特异性和灵敏性快速和准确地检测所有临床上重要的bla基因。此大规 模bla检测方法（被命名为WRSEs(iEblaFinder)可快速和准确地以低成本测定临床菌株的 bla基因分型且因此可以帮助使抗生素抗性减至最小。显而易见的是，WReEs^EblaFinder检 测先前研究的菌株中的24个额外的未报道的bla基因，表明此方法具有检测存在临床菌株 中的所有bla基因的能力。
[0005] 问题的解决方案
[0006]根据第一方面，本发明提供用于鉴别内酰胺酶核酸的引物对。所述引物对可 选自由以下引物对组成的引物对组的引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和 6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15 和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序 列号25和26对、序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和 34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列 号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52 对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对、序列号59和60对、序列号 61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、 序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对、序列号79和 80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列 号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98 对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对 以及序列号107和108对；以及上述引物的全长互补引物对。具体来说，这些引物对可具有 至少两（2)个选自所述引物对组的引物对。更具体来说，这些引物对可具有至少五（5)个 选自所述引物对组的引物对。更具体来说，这些引物对可具有至少八（8)个选自所述引物 对组的引物对。更具体来说，这些引物对可以是具有所有引物对（总共54个引物对）的引 物对组。
[0007] 如本文所用的术语"互补"和"互补的"是指能够在严格杂交条件下杂交到特定核 酸分子的核酸。因此，如果在特定的DNA分子与核酸之间发生杂交，那么特定的DNA分子通 常与核酸"互补"。如果特定的DNA分子杂交到全长核酸分子，那么特定的DNA分子通常是 "全长互补的"。"互补"进一步是指嘌呤和嘧啶核苷酸在双链核酸分子中经由氢键缔合的能 力。以下碱基对是互补的：鸟嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。
[0008] 在下文中使用根据安布勒分子分类（Ambler'smolecularclassification)的 内酰胺酶分类。最广泛使用的内酰胺酶分类是安布勒分类35,该分类基于其氨基 酸序列将内酰胺酶分为四类（A、B、C以及D)。安布勒最初划分了两类:A类，活性位点 丝氨酸0 _内酰胺酶；和B类，金属-内酰胺酶，其为了活性需要二价金属离子，通常是 Zn2+。之后，发现一类新的丝氨酸内酰胺酶，其与随后知道的A类酶几乎不具有序列相 似性。被命名为C类的其成员也被称为'AmpC' 内酰胺酶。发现另一类丝氨酸内 酰胺酶（熟悉地称为0XAP-内酰胺酶）与A类或C类几乎不具有相似性并且被命名为D类。这三类丝氨酸0 -内酰胺酶充分不同，比对程序如BLAST没有发现可检测的序列相似 性，但在这三类丝氨酸0 _内酰胺酶中存在充分的结构相似性，很明显它们是同源的，也就 是说来自同一祖先。
[0009]
[0010] 根据第二方面，本发明提供用于鉴别A类0 -内酰胺酶核酸的一个或多个引物对。 所述引物对可以是选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序列号1和2对、序列 号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列 号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22 对、序列号23和24对以及序列号25和26对；以及用于鉴别A类0 -内酰胺酶核酸的其各 自的全长互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别A类内酰 胺酶核酸的序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9 和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序 列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对。
[0011] 根据第三方面，本发明提供选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序 列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和 36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列 号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54 对、序列号55和56对以及序列号57和58对；以及用于鉴别B类0 -内酰胺酶核酸的其各 自的全长互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别B类内酰 胺酶核酸的序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、 序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43 和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序 列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58对。
[0012] 根据第四方面，本发明提供选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序 列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和 68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序 列号77和78对；以及用于鉴别C类内酰胺酶核酸的其各自的全长互补引物对。具体 来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别C类0 -内酰胺酶核酸的序列号59和60 对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号 69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对以及序列号77和78 对。
[0013] 根据第五方面，本发明提供选自由以下组成的引物对组的一个或多个引物对：序 列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和 88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列 号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105 和106对以及序列号107和108对；以及用于鉴别D类0 -内酰胺酶核酸的其各自的全长 互补引物对。具体来说，本发明提供由以下组成的引物对：用于鉴别D类内酰胺酶核酸 的序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87 和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序 列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号 105和106对以及序列号107和108对。
[0014] 根据第六方面，本发明提供一种用于鉴别内酰胺酶核酸的检测试剂盒，其中 所述试剂盒包括：
[0015] a)至少一个能够杂交到0 -内酰胺酶核酸的引物对；
[0016] b)至少一个阳性对照和至少一个阴性对照；以及
[0017] c)用于鉴别e-内酰胺酶核酸的方案；
[0018] 其中引物对选自由以下组成的组：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和 6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号15 和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序 列号25和26对、序列号27和28对、序列号29和30对、序列号31和32对、序列号33和 34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列 号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52 对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对、序列号59和60对、序列号 61和62对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、 序列号71和72对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对、序列号79 和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序 列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和 98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106 对以及序列号107和108对；以及其各自的全长互补引物对。
[0019] 具体来说，试剂盒用于鉴别A类内酰胺酶核酸，所述A类内酰胺酶核酸包 括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5 和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14对、序列号 15和16对、序列号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对 以及序列号25和26对；以及其各自的全长互补引物对。
[0020] 具体来说，试剂盒用于鉴别A(A1)类0 -内酰胺酶核酸，所述A(A1)类0 -内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号1和2对、序列号3和4对、 序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14 对以及序列号15和16对。
[0021] 具体来说，试剂盒用于鉴别A(A2)类0 -内酰胺酶核酸，所述A(A2)类0 -内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号17和18对、序列号19和20 对、序列号21和22对、序列号23和24对以及序列号25和26对；以及其各自的全长互补 引物对。
[0022] 具体来说，试剂盒用于鉴别B类0 -内酰胺酶核酸，所述B类0 -内酰胺酶核酸包 括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号27和28对、序列号29和30对、序列 号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号39和40 对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号 49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对以及序列号57和58 对；以及其各自的全长互补引物对。
[0023] 具体来说，试剂盒用于鉴别B(B1)类0-内酰胺酶核酸，所述B(B1)类0-内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号27和28对、序列号29和30 对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38对、序列号 39和40对以及序列号41和42对；以及其各自的全长互补引物对。
[0024] 具体来说，试剂盒用于鉴别B(B2)类0 -内酰胺酶核酸，所述B(B2)类0 -内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号43和44对、序列号45和46 对、序列号47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号 55和56对以及序列号57和58对；以及其各自的全长互补引物对。
[0025]具体来说，试剂盒用于鉴别C类0-内酰胺酶核酸，所述C类0-内酰胺酶核酸包 括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号59和60对、序列号61和62对、序列 号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72 对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对；以及其各自的全长互补引物 对。
[0026]具体来说，试剂盒用于鉴别C(C1)类内酰胺酶核酸，所述C(C1)类内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号59和60对、序列号61和62 对、序列号63和64对、序列号65和66对以及序列号67和68对；以及其各自的全长互补 引物对。
[0027]具体来说，试剂盒用于鉴别C(C2)类内酰胺酶核酸，所述C(C2)类内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号69和70对、序列号71和72 对、序列号73和74对、序列号75和76对、序列号77和78对；以及其各自的全长互补引物 对。
[0028]具体来说，试剂盒用于鉴别D类0-内酰胺酶核酸，所述D类0-内酰胺酶核酸包 括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号79和80对、序列号81和82对、序列 号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92 对、序列号93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号 101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对以及序列号107和108对；以及 其各自的全长互补引物对。
[0029]具体来说，试剂盒用于鉴别D(D1)类0-内酰胺酶核酸，所述D(D1)类0-内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号79和80对、序列号81和82 对、序列号83和84对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号 91和92对以及序列号93和94对；以及其各自的全长互补引物对。
[0030]具体来说，试剂盒用于鉴别D(D2)类0 -内酰胺酶核酸，所述D(D2)类0 -内酰胺 酶核酸包括选自由以下组成的组的一个或多个引物对：序列号95和96对、序列号97和98 对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106对 以及序列号107和108对；以及其各自的全长互补引物对。
[0031]
[0032]根据第七方面，本发明提供一种鉴别来自样品中的内酰胺酶类型的方法，其 包括：
[0033] (a)将所述样品与选自包括以下的引物对组的一个或多个引物对在溶液中接触： 序列号1和2对、序列号3和4对、序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序 列号11和12对、序列号13和14对、序列号15和16对、序列号17和18对、序列号19和 20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序列号25和26对、序列号27和28对、序列 号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38 对、序列号39和40对、序列号41和42对、序列号43和44对、序列号45和46对、序列号 47和48对、序列号49和50对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对、 序列号57和58对、序列号59和60对、序列号61和62对、序列号63和64对、序列号65和 66对、序列号67和68对、序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74对、序列 号75和76对、序列号77和78对、序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84 对、序列号85和86对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号 93和94对、序列号95和96对、序列号97和98对、序列号99和100对、序列号101和102 对、序列号103和104对、序列号105和106以及序列号107和108对；以及其各自的全长 互补引物对；
[0034] (b)在一个反应室中使用所述引物对通过聚合酶链反应（PCR)同时扩增以产生扩 增的核酸产物；以及
[0035] (c)通过凝胶电泳检测所述核酸产物。
[0036] 具体来说，本发明可以是鉴别来自样品中的内酰胺酶类型的方法，其包括：
[0037] (a)将所述样品与以下在溶液中接触：选自包括序列号1和2对、序列号3和4对、 序列号5和6对、序列号7和8对、序列号9和10对、序列号11和12对、序列号13和14 对、序列号15和16对的组的用于A1类0 -内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列 号17和18对、序列号19和20对、序列号21和22对、序列号23和24对、序列号25和26 对的组的用于A2类0 -内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号27和28对、序列 号29和30对、序列号31和32对、序列号33和34对、序列号35和36对、序列号37和38 对、序列号39和40对、序列号41和42对的组的用于B1类0 -内酰胺酶的一个或多个引 物对；选自包括序列号43和44对、序列号45和46对、序列号47和48对、序列号49和50 对、序列号51和52对、序列号53和54对、序列号55和56对、序列号57和58对的组的用 于B2类0 -内酰胺酶的一个或多个引物对；选自包括序列号59和60对、序列号61和62 对、序列号63和64对、序列号65和66对、序列号67和68对的组的用于C1类0 -内酰胺 酶的一个或多个引物对；选自包括序列号69和70对、序列号71和72对、序列号73和74 对、序列号75和76对、序列号77和78对的组的用于C2类0 -内酰胺酶的一个或多个引 物对；选自包括序列号79和80对、序列号81和82对、序列号83和84对、序列号85和86 对、序列号87和88对、序列号89和90对、序列号91和92对、序列号93和94对的组的用 于D1类0 -内酰胺酶的一个或多个引物对；以及选自包括序列号95和96对、序列号97和 98对、序列号99和100对、序列号101和102对、序列号103和104对、序列号105和106 以及序列号107和108对的组的用于D2类-内酰胺酶的一个或多个引物对；
[0038] (b)在用于每类0 -内酰胺酶的不同的反应室中使用每类引物对通过聚合酶链反 应（PCR)同时扩增以产生扩增的核酸产物；以及
[0039] (c)通过凝胶电泳检测每个反应室的所述核酸产物。
[0040] 更具体来说，本发明可以包括用于PCR产物的测序的其他步骤。
[0041] 本发明的有益效果
[0042] 本发明提供一种快速和准确的分子方法，其克服了以下失败之处：(a)检测所有 临床上重要的bla基因以及（b)通过使用54个引物对充分解释表型试验结果，所述引物对 经由新型和精巧的优化方法来设计。在172种对照菌株和403种临床菌株中，以完美的特 异性和灵敏性，本方法（URSEStttEblaFinder)可以检测所有临床上重要的bla基因。因此， uh?stieblaFinder的此大规模bla检测能力能够实现鉴别细菌性病原体中的所有bla基因 的迅速和临床应用。
【附图说明】
[0043] 图1显示使用单菌落的大规模bla检测方法（tARSESCAtEblaFinder)。将来自过夜 培养物的单菌落悬浮在含有〇. 1%TritonX-100的溶液中，之后立即在100°C下加热细胞 悬浮液10分钟。通过离心步骤在18,OOOXg下持续1分钟除去细胞碎片之后，使上清液 (1以，模板）经受具有8个多重？0?管（六1、六2、81、82、(：1工2、01以及02)的多重？0?。每 个多重PCR管的34y1反应混合物含有1XDiaStar?多重PCRSmart混合物和0. 2yMbla 型特异性引物（例如，在多重P