经由与碳储存有关的CoA依赖性碳链延长生成7碳化学品的方法
【专利说明】经由与碳储存有关的CoA依赖性碳链延长生成7碳化学品 的方法 发明领域
[0001] 本发明涉及使用一种或多种分离的酶（诸如酮硫解酶、脱氢酶、还原酶、水 合酶、单加氧酶、硫酯酶和转氨酶）或使用表达一种或多种此类酶的重组宿主细胞从乙酰 基-CoA和丙酰基-CoA生物合成庚二酸、7-羟基庚酸、7-氨基庚酸、庚亚甲基二胺和1，7-庚 二醇（下文为"C7结构单元"）中一种或多种的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 尼龙是聚酰胺，其通常通过二胺与二羧酸的缩聚合成。类似地，尼龙可通过内 酰胺的缩聚生成。一种无处不在的尼龙是尼龙6,6,其通过六亚甲基二胺（HMD)和己二 酸的反应生成。尼龙6可以通过己内酰胺的开环聚合生成（Anton&Baird,Polyamides Fibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology, 2001)〇
[0004] 尼龙7和尼龙7, 7代表与尼龙6和尼龙6, 6相比具有增值特征的新型聚酰胺。尼 龙7是通过7-氨基庚酸聚合生成的，而尼龙7, 7是通过庚二酸和庚亚甲基二胺的缩聚生成 的。不存在生成用于尼龙7和尼龙7, 7的单体的经济上可行的石油化学路径。
[0005] 鉴于没有经济上可行的石油化学单体给料；生物技术提供了一种经由生物催化的 备选方法。生物催化是使用生物催化剂（诸如酶）来实施有机化合物的生物化学转化。
[0006] 生物衍生给料和石油化学给料两者是用于生物催化过程的可行起始材料。
[0007] 因而，针对此背景，清楚的是需要用于生成庚二酸、7-羟基庚酸、7-氨基庚酸、庚 亚甲基二胺和1，7_庚二醇（h印tanediol)(下文为"C7结构单元"）中一种或多种的可持 续方法，其中所述方法是基于生物催化剂的。
[0008] 然而，无野生型原核生物或真核生物天然过度生成此类C7结构单元或将其排出 至胞外环境。不过，已经报告了庚二酸的代谢。
[0009] 二羧酸庚二酸作为碳源经由氧化被众多细菌和真菌有效转化成中心代谢 物。辅酶A(CoA)活化的庚二酸到CoA活化的3-氧代庚二酸的0 -氧化经由例如与芳香 族底物降解有关的途径促进进一步代谢。已经广泛表征了 3-氧代庚二酰基-CoA被几种 细菌分解代谢成乙酰基-CoA和戊二酰基-CoA(HarwoodandParales,AnnualReviewof Microbiology, 1996, 50:553 - 590)。
[0010] 最优性原理陈述微生物调节其生物化学网络以支持最大生物量生长。超出宿主 生物体中表达异源路径的需要，将碳流量引向充当碳源而非充当生物量生长成分的C7结 构单元与最优性原理矛盾。例如，与天然生产者的产量性能相比，将1-丁醇途径从梭菌 (Clostridium)物种转移入其它生产菌株中经常下降一个数量级（Shen等，Appl.Environ. Microbiol. , 2011, 77(9) :2905 - 2915) 〇
[0011] 在C7脂肪族主链上形成末端官能团（诸如羧基、胺或羟基基团）前，7碳脂肪族主 链前体的有效合成是合成一种或多种C7结构单元中的重要考虑因素。
[0012] 发明概述
[0013] 本文件至少部分基于如下的发现：有可能构建生成7碳链脂肪族主链前体诸如 庚酰基-CoA的生物化学路径，其中可以形成两个官能团，即羧基、胺或羟基，从而导致庚二 酸、7-羟基庚酸、7-氨基庚酸、庚亚甲基二胺、和1，7-庚二醇（下文为"C7结构单元"）中一 种或多种的合成。庚二酸和庚二酸盐、7-羟基庚酸和7-羟基庚酸盐及7-氨基庚酸和7-氨 基庚酸盐在本文中可互换使用，指其任何中性或离子化形式的化合物，包括其任何盐形式。 本领域技术人员应当理解，具体的形式会取决于pH。本文中描述的这些途径、代谢工程和培 养策略取决于与聚羟基烷酸酯积累细菌的碳储存途径相关的CoA依赖性延长酶或者同源 物。
[0014] 面对最优性原理，发明人令人惊讶地发现了可以组合合适的非天然途径、给料、宿 主微生物、对宿主生物化学网络的弱化策略和培养策略来有效生成一种或多种C7结构单 JL〇
[0015] 在一些实施方案中，可以使用NADH或NADPH依赖性酶经由两个循环的CoA依赖性 碳链延长从乙酰基-CoA和丙酰基-CoA形成用于转化成C7结构单元的C7脂肪族主链。参 见图1和图2。
[0016] 在一些实施方案中，生成C7脂肪族主链的CoA依赖性碳链延长途径中的酶有目的 地含有不可逆酶促步骤。
[0017] 在一些实施方案中，可以使用硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸 脱氢酶、或单加氧酶酶促形成末端羧基基团。参见图3和图4。
[0018] 在一些实施方案中，可以使用转氨酶或脱乙酰酶酶促形成末端胺基团。参见 图5和图6。
[0019] 在一些实施方案中，可以使用单加氧酶或醇脱氢酶酶促形成末端羟基基团。参见 图7和图8。
[0020] 在一个方面，本文件特征在于用于生物合成选自庚二酸、7-氨基庚酸、7-羟基庚 酸、庚亚甲基二胺和1，7-庚二醇的产物的方法。该方法包括经由两个循环的CoA依赖性碳 链延长从乙酰基-CoA和丙酰基-CoA酶促合成7碳链脂肪族主链（例如庚酰基-CoA)，并且 在所述主链中酶促形成两个选自羧基、胺、和羟基基团的末端官能团，由此形成所述产物。 所述两个循环的CoA依赖性碳链延长中的每个可以包括使用0 -酮硫解酶、3-羟酰基-CoA 脱氢酶或3-氧化酰基-CoA还原酶、稀酰基-CoA水合酶、和反式-2-稀酰基-CoA还原酶以 从乙酰基-CoA和丙酰基-CoA形成庚酰基-CoA。两个末端官能团可以是相同的（例如胺 或羟基）或者可以是不同的（例如末端胺和末端羧基基团；或末端羟基基团和末端羧基基 团）。
[0021] 转氨酶或脱乙酰酶可以酶促形成胺基团。转氨酶可以与SEQIDN0. 8-13 中所列的任一种氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0022] 单加氧酶（例如与氧化还原酶和/或铁氧还蛋白组合）或醇脱氢酶可以酶促形成 羟基基团。单加氧酶可以与SEQIDN0:14-16中所列的任一种氨基酸序列具有至少70%序 列同一性。
[0023] 硫酯酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、或6-氧代己酸脱氢酶可以酶促形成末端 羧基基团。硫酯酶可以与SEQIDNO: 1中所列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性。
[0024] 羧酸还原酶（例如与磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶组合）可以在形成所述产物中形 成末端醛基团作为中间体。羧酸还原酶可以与SEQIDN0. 2-7中所列的任一种氨基酸序列 具有至少70 %序列同一性。
[0025] 可以通过发酵在重组宿主中实施任何方法。所述宿主可以经受需氧、厌氧或微需 氧培养条件下的培养策略。可以在营养物限制的条件下培养所述宿主。可以使用陶瓷中空 纤维膜保留所述宿主以维持发酵期间的高细胞密度。
[0026] 在任何方法中，所述宿主对高浓度的C7结构单元的耐受性可以通过在选择性环 境中的连续培养而得到改善。
[0027] 对发酵补料的主要碳源可以源自生物或非生物给料。在一些实施方案中，所述 生物给料是，包括或者源自单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙 酸（levulinicacid)、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟（condensed distillers'solubles)或城市废物。
[0028] 在一些实施方案中，非生物给料是或者源自天然气、合成气、C02/H2、甲醇、乙醇、来 自环己烷氧化过程的非挥发性残留物（NVR)或碱洗废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物 废物流。
[0029] 本文件特征还在于重组宿主，其包含至少一种编码以下的外源核酸：（i) 酮硫 解酶或乙酰基-CoA羧化酶和酮脂酰基-[acp]合酶，（ii)3-羟酰基-CoA脱氢酶或3-氧 化酰基-CoA还原酶，（iii)稀酰基-CoA水合酶，和（iv)反式-2-稀酰基-CoA还原酶，其 中所述宿主生成庚酰基-CoA。宿主进一步可以包含硫酯酶、醛脱氢酶、或正丁醛脱氢酶中的 一种或多种，其中宿主生成庚醛或庚酸。
[0030] 生成庚醛或庚酸的重组宿主可以进一步包含单加氧酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、6-羟 基己酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶、或7-氧代庚酸 脱氢酶中的一种或多种，所述宿主生成庚二酸或庚二酸半醛。
[0031] 生成庚醛或庚酸的重组宿主可以进一步包含单加氧酶、转氨酶、6-羟基己酸脱氢 酶、5-羟基戊酸脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、和醇脱氢酶中的一种或多种，其中宿主生成 7_氨基庚酸。
[0032] 生成庚醛或庚酸的重组宿主可以进一步包含单加氧酶，其中宿主生成7-羟基庚 酸。
[0033] 生成庚醛、庚酸、7-羟基庚酸、或7-氨基庚酸的重组宿主可以进一步包含羧酸还 原酶、转氨酶、脱乙酰酶、N-乙酰基转移酶、或醇脱氢酶中的一种或多种，所述宿主生成 庚亚甲基二胺。
[0034] 生成7-羟基庚酸的重组宿主可以进一步包含羧酸还原酶或醇脱氢酶，其中宿主 生成1，7-庚二醇。
[0035] 重组宿主可以是原核生物，例如来自埃希氏菌属（Escherichia)如大肠 杆菌（Escherichiacoli);来自梭菌属（Clostridia)如杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii)、自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)或者克鲁佛梭 菌（Clostridiumkluyveri);来自棒状杆菌属（Corynebacteria)如谷氨酸棒状杆 菌（Corynebacteriumglutamicum);来自贪铜菌属（Cupriavidus)如钩虫贪铜菌 (Cupriavidusnecator)或者耐金属贪铜菌（Cupriavidusmetallidurans);来自假单 胞菌属（Pseudomonas)如焚光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌 (Pseudomonasputida)或者食油假单胞菌（Pseudomonasoleavorans);来自代尔夫特菌 属（Delftia)如食酸代尔夫特菌（Delftiaacidovorans);来自芽孢杆菌属（Bacillus) 如枯草芽胞杆菌（Bacillussubtillis);来自乳杆菌属（Lactobacillus)如德氏乳杆 菌（Lactobacillusdelbrueckii);或者来自乳球菌属（Lactococcus)如乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)或来自红球菌属（Rhodococcus)如马红球菌（Rhodococcusequi)。
[0036] 重组宿主可以是真核生物，例如来自曲霉属（Aspergillus)如黑曲霉 (Aspergillusniger);来自酵母属（Saccharomyces)如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae);来自毕赤氏酵属（Pichia)如巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris);来自 耶罗维亚酵母属（Yarrowia)如解脂耶罗维亚酵母（Yarrowialipolytica);来自伊萨 酵母属（Issatchenkia)如东方伊萨酵母（Issathenkiaorientalis);来自德巴利酵母 属（Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母（Debaryomyceshansenii);来自Arxula属如 Arxulaadenoinivorans;或者来自克鲁维酵母菌属（Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母 菌（Kluyveromyceslactis)的真核生物。
[0037] 在一些实施方案中，弱化或增强宿主的内源生物化学网络以（1)确保乙酰基-CoA 和丙酰基-CoA的胞内利用度，（2)产生NADH或NADPH不平衡，其仅可以经由C7结构单元 的形成来平衡，（3)阻止降解导致并包含C7结构单元的中心代谢物，中心前体，并且（4)确 保从细胞的有效流出。
[0038] 本文中描述的任何重组宿主可以进一步包含下列一种或多种弱化的酶：聚羟基 烷酸酯合酶、乙酰基-CoA硫酯酶、丙酰基-CoA硫酯酶、柠檬酸甲酯合酶、乙酰基-CoA特异 性0 -酮硫解酶、形成乙酸的磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乳酸脱氢酶、menaquinol-延胡索酸 氧化还原酶、形成异丁醇的2-酮酸脱羧酶、形成乙醇的醇脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、丙酮酸 脱羧酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、NADH-消耗性转氢酶、NADH-特异性谷氨酸脱氢酶、NADH/ NADPH利用性谷氨酸脱氢酶、庚二酰基-CoA脱氢酶；接受C7结构单元和中心前体作为底物 的酰基-CoA脱氢酶；戊二酰基-CoA脱氢酶；或庚二酰基-CoA合成酶。
[0039] 本文中描述的任何重组宿主可以进一步过表达一种或多种编码以下的基因：乙酰 基-CoA合成酶；6-磷酸葡糖酸脱氢酶；转酮醇酶；反馈抗性苏氨酸脱氨酶；吡啶核苷酸转 氢酶；甲酸脱氢酶；甘油醛-3P-脱氢酶；苹果酸酶；葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；果糖1，6二磷 酸酶；丙酰基-CoA合成酶；L-丙氨酸脱氢酶；L-谷氨酸脱氢酶；L-谷氨酰胺合成酶；二胺 转运蛋白；二羧酸转运蛋白；和/或多药物转运蛋白。
[0040] 可以在一种或多种细胞（例如宿主细胞）株中实施本文中描述的途径的反应，所 述细胞株（a)天然表达一种或多种相关酶，（b)经过遗传工程化改造以表达一种或多种相 关酶，或（c)天然表达一种或多种相关酶，并且经过遗传工程化改造以表达一种或多种相 关酶。或者，相关酶可以自上述类型的宿主细胞提取，并且可以以纯化或半纯化形式使用。 任选地，可以将提取的酶固定化至合适的反应容器的底部和/或壁。此外，此类提取物包括 可以作为相关酶来源使用的裂解物（例如细胞裂解物）。在由本文件提供的方法中，可以在 细胞（例如宿主细胞）中实施所有步骤，可以使用提取的酶实施所有步骤，或者可以在细胞 中实施一些步骤，并且可以使用提取的酶实施其它步骤。
[0041] 除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术 人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以使用与本文中描述的方法和材料相似或等同的 方法和材料来实施本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及完整并入本文中 提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它出版物。在冲突的情况中，应以本说明书（包括 定义）为准。另外，材料、方法和例子仅是例示性的，而不意图为限制性的。
[0042] 本发明的一个或者多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐明。根据说明书 和附图，并根据权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。根据专利法的标 准实践，词语"包含"在权利要求书中可被"基本上由…组成"或者"由…组成"替代。
[0043] 附图简述
[0044] 图1是产生庚酰基-CoA的例示性生物化学途径的示意图，其使用NADH依赖性酶 并用乙酰基-CoA和丙酰基-CoA作为中心代谢物。
[0045] 图2是产生庚酰基-CoA的例示性生物化学途径的示意图，其使用NADPH依赖性酶 并用乙酰基-CoA和丙酰基-CoA作为中心代谢物。
[0046] 图3是使用庚酰基-CoA作为中心前体产生庚酸的例示性生物化学途径的示意图。
[0047]图4是使用庚酸作为中心前体产生庚二酸的例示性生物化学途径的示意图。
[0048]图5是使用庚酸作为中心前体产生7-氨基庚酸的例示性生物化学途径的示意图。
[0049] 图6是使用7-氨基庚酸、7-羟基庚酸、或庚二酸半醛作为中心前体产生庚亚甲基 二胺的例示性生物化学途径的示意图。
[0050]图7是使用庚酸作为中心前体产生7-羟基庚酸的例示性生物化学途径的示意图。
[0051]图8是使用7-羟基庚酸作为中心前体产生1，7庚二醇的例示性生物化学途径的 示意图。
[0052] 图9是从中心代谢物产生丙酰基-CoA的例示性生物化学途径的示意图。
[0053] 图10含有由tesB编码的大肠杆菌硫酯酶（参见GenBank登录号AAA24665. 1， SEQIDN0:1)、海分枝杆菌（Mycobacteriummarinum)駿酸还原酶（参见GenBank登录号 ACC40567. 1，SEQIDN0:2)、耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis)駿酸还原酶（参 见GenBank登录号ABK71854. 1，SEQIDN0:3)、Segniliparusrugosus駿酸还原酶（参见 GenBank登录号EFV11917. 1，SEQIDN0:4)、耻垢分枝杆菌羧酸还原酶（参见GenBank登录 号ABK75684.1，SEQIDN0:5)、马赛分枝杆菌（Mycobacteriummassiliense)駿酸还原酶 (参见GenBank登录号EIV11143.1，SEQIDN0:6)、Segniliparusrotundus駿酸还原酶（参 见GenBank登录号ADG98140.1，SEQIDN0:7)、紫色色杆菌（Chromobacteriumviolaceum) 转氨酶（参见GenBank登录号AAQ59697.1，SEQIDN0:8)、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa) 〇-转氨酶（参见GenBank登录号AAG08191. 1，SEQIDN0:9)、丁香假单胞菌 (Pseudomonassyringae)?-转氨酶（参见GenBank登录号AAY39893.1，SEQIDN0:10)、球 形红杆菌（Rhodobactersphaeroides) 转氨酶（参见GenBank登录号ABA81135. 1，SEQ IDNO: 11)、大肠杆菌转氨酶（参见GenBank登录号AAA57874.1，SEQIDNO: 12)、河流 弧菌（VibrioFluvialis) ?-转氨酶（参见GenBank登录号AEA39183. 1，SEQIDNO: 13); 极单胞菌物种（Polaromonassp. )JS666单加氧酶（参见GenBank登录号ABE47160. 1，SEQ IDNO: 14)、分枝杆菌物种（Mycobacteriumsp.)HXN_1500单加氧酶（参见GenBank登录号 CAH04396. 1，SEQIDNO: 15)、南非分枝杆菌（Mycobacteriumaustroafricanum)单加氧酶 (参见GenBank登录号ACJ06772. 1，SEQIDNO: 16)、极单胞菌物种JS666氧化还原酶（参 见GenBank登录号ABE47159. 1，SEQIDNO: 17)、分枝杆菌物种HXN-1500氧化还原酶（参 见GenBank登录号CAH04397.1，SEQIDN0:18)、极单胞菌物种JS666铁氧还蛋白（参见 GenBank登录号ABE47158. 1，SEQID勵：19)、分枝杆菌物种取^1500铁氧还蛋白（参见GenBank登录号CAH04398.1，SEQIDN0:20)、枯草芽抱杆菌（Bacillussubtilis)磷酸泛 酰巯基乙胺基转移酶（参见GenBank登录号CAA44858. 1，SEQIDN0:21)、和诺卡尔菌物种 (Nocardiasp.)NRRL5646磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（参见GenBank登录号ABI83656. 1， SEQIDNO:21)的氨基酸序列。
[0054] 图11是在24小时后如经由LC-MS测定的7-羟基庚酸的峰面积的变化（作为相 对于空载体对照用于将庚酸转化成7-羟基庚酸的单加氧酶活性的测量）的棒图。