一种用于对不同银杏进行基因分型的SNP引物及检测方法与流程

技术领域:

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于对不同银杏进行基因分型的snp引物及检测方法。

背景技术：

银杏(ginkgobilobal.)作为裸子植物银杏纲(ginkgopsida)现存唯一种，典型的中生代孑遗物种，素有“活化石”之美誉。银杏为落叶大乔木，树干高大，雌雄异株。树皮幼时浅绿色，老树呈灰褐色，深纵裂，粗糙；分枝繁茂，分长短枝。种子核果状，有臭味；中种皮骨质，白色，具2～3棱；内种皮膜质淡褐色，子叶2片；花期4～5月，9～10月种子成熟。银杏集材用、果用、叶用、园林绿化、观赏于一体，是一种全能的树种。银杏叶中含有大量的银杏黄酮类和银杏内酯类物质，对治疗神经病，骨髓病和脑病有独特的效用。银杏叶的非凡药用价值，已经使银杏叶制剂形成了一个巨大的产业。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)是指单个核苷酸的变异引起的基因组水平上dna序列的多态性，其形式包括单碱基的插入、缺失、转换和颠换。在群体中，其等位基因频率大于1％，但有时也把cdna中频率小于1％的单碱基变异称之为snp。snp标记是继rflp和ssr之后发展起来的第三代分子标记，并广泛应用于植物遗传育种中，具有遗传稳定性高；密度高、分布广；二态性和等位基因性；富有代表性；易于实现高通量、自动化检测的特点。因此，snp被认为是应用前景最好的遗传标记之一。

随着测序技术的发展，测序质量的提高和成本的降低，挖掘snp位点并借此进行相关研究的例子越来越多。但该技术在植物中的应用多集中于农作物，在林木类方面的研究相对较少，且在银杏这一物种上的研究更是未见报道。随着时代的发展，野生资源的保护至关重要，对于孑遗树种古银杏保护不容忽视。因此，现急需一种快速、方便、可靠的银杏古树名木资源分子鉴定技术。利用dna分子标记方法绘制dna指纹图谱，能从本质上反映生物个体间的差异。常规的dna指纹图谱是采用第二代分子标记简单序列重复(ssr)进行的，但是第三代分子标记snp，无须基于凝胶电泳进行指纹图谱的检测，减少误差，省时，且高通量，准确性高。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于对不同银杏进行基因分型的snp引物，为84株古树名木建立指纹图谱。本发明的另一目的是提供上述snp引物的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于对不同古银杏进行基因分型的snp引物，由22对引物组成，各引物的核苷酸序列如下表所示：

应用所述的snp引物构建银杏古树名木的指纹图谱，获得84个银杏古树名木对应的指纹图谱，如下表所示：

所述的应用snp引物构建银杏古树名木的指纹图谱，所使用的引物为11，名称分别：snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22。

所述snp引物在不同古银杏基因组dna的snp位点基因分型检测中的应用。

所述的应用，包括以下步骤：

1)待测银杏样品dna的提取；

2)使用相同反应体系及程序对银杏样本基因组dna进行pcr扩增，得到待测银杏的pcr产物；

3)对pcr扩增产物进行高分辨率溶解曲线分析确定snp位点的基因型；

4)sanger测序再次验证snp基因型。

步骤2)中，pcr反应体系10μl：25ng模板dna；1xforget-me-not^tmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o补齐。

步骤2)中，pcr反应程序：预变性95℃2min；95℃变性5s，45个循环；60℃复性30s。

步骤3)中，hrm的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

本发明通过实验证明：本发明的引物共22对，其中11对snp引物组合可以用于构建银杏古树名木的指纹图谱。本发明利用银杏转录组数据开发的snp引物能够对银杏进行基因分型，并且本发明操作方法简单，通量高，成本低。此外，本发明开发的11对snp引物构建了不同银杏古树名木的指纹图谱，验证的22个snp位点还可以用来分子标记辅助育种，遗传多样性研究，基于snp的关联分析，以及用于种质资源鉴定与分类等。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：

1)结果高度准确、可靠：利用本发明进行检测与鉴定，检测结果100％准确，检测结果提供了高度的可靠性，为银杏古树名木提供指纹图谱，对野生资源的保护意义重大。

2)操作快速简便：进行不同个体间的样本检测，一般整个试验过程只需几小时即可完成，与传统的测序技术相比，省时省力，可以实现高通量。

3)无需基于凝胶电泳进行，减少试剂和耗材的使用，更佳环保，同时节省人力和减少人工误差。

4)检测结果灵敏度高：对待检测样品仅需提供模板dna25ng即可准确进行鉴定。

附图说明

图1是从银杏转录组测序数据中鉴定出的snp及其变异类型和数目结果图；

图2是以引物snp18为例，在不同古银杏个体表现出的扩增曲线图；

图3是以引物snp18为例，利用高分辨率溶解曲线分析后，不同古银杏个体表现出不同的溶解曲线峰图；

图4是以引物snp18为例，根据不同古银杏个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为cc，蓝色为ct，绿色为tt。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、初步筛选对银杏进行基因分型的snp引物

1)转录组数据的获得

根据制造商的说明书使用rneasyplantminikit(qiagen，hilde，germany)进行银杏总rna提取。提取后，在1.0％的琼脂糖凝胶上检测rna的降解和污染。使用分光光度计(implen，westlakevillage，ca，usa)检查rna纯度。使用2.0flurometer(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)中的rnaassaykit测定rna的浓度。使用anagilentbioanalyzer2100system(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)中的rnanano6000assaykit评估rna的完整性。

每个样品的总量为3μgrna用作rna样品制备的输入材料。按照制造商的说明书，使用ultratmrnalibraryprepkit(neb，usa)生成测序文库，并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。简而言之，使用poly-toligo附着磁珠从总rna纯化mrna。在nebnextfirststrandsynthesisreactionbuffer(5×)中，在高温下使用二价阳离子打断成短片段。以mrna为模板，使用六碱基随机引物和m-mulv逆转录酶(rnaseh-)合成第一链cdna。随后使用dna聚合酶i和rna酶h进行第二链cdna合成。通过外切核酸酶/聚合酶活性将剩余突出部分转化为平端。在dna片段的3'末端腺苷酸化后，连接具有发夹环结构的nebnext适配子以进行杂交。为了选择长度优先为150-200bp的cdna片段，文库片段用ampurexp系统(beckmancoulter，beverly，usa)纯化。然后将3μluserenzyme(neb，usa)与大小选择的接头连接的cdna在37℃下使用15min，然后在95℃下pcr5min。进而使用phusion高保真dna聚合酶，通用pcr引物和index(x)引物进行pcr。最后，将pcr产物纯化(ampurexp系统)，并在agilentbioanalyzer2100系统上评估文库质量。根据制造商的说明书，使用truseqpeclusterkitv3-cbot-hs(illumia)在cbot群集生成系统上进行索引编码样本的聚类。集群生成后，在illuminahiseqtm2500高通量平台上对其准备进行测序，并生成配对末端读取。

fastq格式的原始数据(rawreads)首先通过内部perl脚本进行处理。在此步骤中，通过删除包含适配器的读取，包含poly-n的读取以及从原始数据读取的低质量来获取干净的数据(cleanreads)。同时，计算了cleandata的q20，q30，gc含量和序列重复水平。所有的下游分析都是以高质量的cleandata为基础。然后，将所有库/样本中的左文件(read1files)合并到一个大的left.fq文件中，将正确的文件(read2files)合并到一个大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用trinity(grabherretal.，2011)完成转录组组装，默认情况下min_kmer_cov设置为2，其他所有参数设置为默认值。选择具有最长长度的每个基因的转录本作为unigenes。

2)snp的识别

本实施例通过使用picard-toolsv1.41和samtoolsv0.1.18来排序，删除重复读取，对齐合并获得每个样本的bam结果。采用gatk2v3.2软件用于执行snpcalling(mckennaetal，2010)。原始的vcf文件使用gatk标准方法过滤(参数为clusterwindowsize:10；mq0>＝4and(mq0/(1.0*dp))>0.1；qual<10；qual<30.0orqd<5.0orhrun>5)，最后仅保留距离大于5的snp。通过该方法鉴定出65535个snp，snp变异的形式有多种，但类型主要有转换和颠换，转换是颠换的2倍左右，如图1所示。

3)snp引物的设计

根据转录组unigenes序列，挑选60个snp位点，利用oligo6.0软件设计60对snp引物。设计的方法如下：首先确定snp位点所在序列的位置，然后在snp位点的上下游分别设计正向引物和反向引物，引物设计的参数为引物长度18-23bp；tm60℃左右，尽可能保证上下游引物的tm值一致，一般不超过2℃；gc含量在40-60％(45-55％最佳)；pcr产物大小为100-300bp；其它还应注意引物3'端不应出现超过3个的连续g或c；引物不能形成发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之间尽量不能有连续4个以上的碱基互补，尤其避免3'端的互补。

4)snp引物的有效性验证

提取银杏基因组dna，以银杏基因组dna为模板，采用待检测snp引物进行pcr扩增，获得pcr扩增产物；反应结束后，取3μl的pcr产物加入4μlloadingbuffer，再加3μlddh2o，利用8％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后采用银染方法对pcr扩增产物进行检测。能检测到目的条带且无其它杂带和引物二聚体的，该待检测引物即为有效引物。

10μl的pcr反应体系中包括：10×buffer；0.2mmol/ldntps；2.5mmol/lmg²⁺；0.2μmol/lsnp引物；1utaqdna聚合酶和40ngdna模版；剩余ddh2o补齐。

pcr的反应程序为：预变性94℃5min；30循环的94℃30s，最佳tm55℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。

结果表明：挑选的60对snp引物中，有45对引物能够扩增出条带，说明引物设计的方法较好，但其中的18对引物扩增出的条带不单一，可能存在多个snp位点，暂不考虑进行hrm分析，另外27对引物扩增条带单一且产物大小与预期一致，暂为有效snp引物，用于hrm分析。1对引物对应1个目标snp位点，1对引物的扩增产物为含有对应snp位点的dna片段。

2、再次筛选对银杏进行基因分型的snp引物

1)pcr扩增及高分辨率溶解曲线(hrm)分析进行基因分型

以90个银杏个体(其中6个银杏个体为转录组测序的银杏；84棵银杏古树名木，分别来自3个群体，贵州盘县28株，浙江天目山28株和湖北安陆28株)的基因组dna为模板，分别采用上述27对snp有效性引物进行pcr扩增，得到每个个体的27个引物对应的pcr扩增产物，每个引物对的pcr扩增产物为含有某个snp位点的dna片段。

pcr反应体系10μl：25ng模板dna；1×forget-me-not^tmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o补齐。采用viia7中的highresolutionmelt进行pcr及基因分型。第一步，10μl的pcr反应程序：预变性95℃2min；45个循环的95℃变性5s，60℃复性30s；第二步，hrm的反应程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。

结果表明：有22对引物能够进行基因分型，其余5对引物(snp23，snp24，snp25，snp26，snp27)因有杂峰或基因分型时可信度不高，所以被淘汰。采用appliedhrmsoftwarev2.0进行溶解曲线分析。22对引物对应的snp位点得到hrm验证，其中，高分辨率溶解曲线部分结果如下：

图2为以snp18为例，在不同银杏个体表现出的扩增曲线；图3为以snp18为例，利用高分辨率溶解曲线分析后，不同银杏个体表现出不同的溶解曲线峰；图4为以snp18为例，根据不同银杏个体表现出的差异溶解曲线峰，对其进行基因分型结果的溶解曲线，红色为cc，蓝色为ct，绿色为tt。22对snp引物对90个银杏个体的基因分型结果如下表所示：

其中，11对snp引物组合(snp1，snp4，snp6，snp8，snp10，snp14，snp16，snp17，snp19，snp20，snp22)构建银杏古树名木指纹代码，获得84个银杏古树名木对应的指纹图谱，序号1-28为贵州盘县这个群体的28株古银杏，序号29-56为浙江天目山这个群体的28株古银杏，序号57-84为湖北安陆这个群体的28株古银杏，如下表所示:

2)高分辨率溶解曲线分析结果的验证

通过对pcr产物测序对高分辨率溶解曲线分析得到的基因分型的结果进行验证。具体步骤如下：挑选snp的不同分型的pcr产物10μl，进行sanger测序，根据测序峰图和等位基因出现的频率确定基因型，并与hrm技术的snp基因分型结果进行比较，以验证引物基因分型的准确性。

经过sanger测序验证本发明的引物通过hmr分析对银杏进行基因分型的结果100％正确，结果可靠。