一种鉴别6种紫檀属木材的DNA组合条形码及其鉴别方法和应用与流程

本发明属于木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体涉及一种鉴别6种紫檀属木材的dna组合条形码及其鉴别方法和应用。

背景技术：

紫檀属(pterocarpusjacq.)隶属豆科(leguminosae)，约70种，主要分布于热带及亚热带地区。紫檀属木材以其木材品质及药用价值闻名全球。由于巨大经济利益链的存在和社会对其需求量的不断增加，非法及过度开采使紫檀属木材资源日益匮乏。因此，紫檀属木材资源逐渐得到了国际法律法规的关注。目前，檀香紫檀和刺猬紫檀2个树种被列入濒危野生动植物种国际贸易保护公约(cites)附录ii；数个紫檀属树种也被列入国际自然保护联盟(iucn)红色名录；同时，印度紫檀于1999年被中国政府列入国家重点保护野生植物名录。

紫檀属木材树种识别为保护木材资源及法律法规的实施提供了技术支持。然而，基于木材解剖学的传统识别技术只能鉴别紫檀属木材到“属”或者“类”，无法实现“种”水平的鉴别。而新兴的dna条形码技术为紫檀属木材“种”水平识别提供了可能。

dna条形码是一段标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的dna片段。近年来，dna条形码已经发展成为物种鉴定的重要工具。但单一dna条形码对于物种尤其针对进化关系复杂物种的识别能力较为有限。而dna组合条形码通过多条单一序列的组合具有更丰富的序列信息位点，进而提高物种识别能力，是一种有效的物种鉴别方法。

总体来说，紫檀属木材物种丰富，基于木材解剖学的传统识别技术难以实现木材“种”水平的识别，而新兴的dna条形码技术，特别是dna组合条形码逐步发展成为木材识别的有效工具。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对传统木材识别技术无法准确鉴别6种紫檀属木材。

所以，本发明的第一目的是提供一种鉴别6种紫檀属木材的dna组合条形码。

本发明的第二目的是提供一种鉴别6种紫檀属木材的方法。

本发明的第三目的是提供所述dna组合条形码和分子生物学方法在鉴别6种紫檀属木材中的应用。

基于此，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供了一种鉴别6种紫檀属木材的dna组合条形码，所述dna组合条形码是条形码序列matk、ndhf-rpl32、rbcl或its2中的任意2种以上或全部组合形成的dna组合条形码。

优选的，所述dna组合条形码是matk+ndhf-rpl32+its2组合条形码。该dna组合条形码为细胞核基因its2序列与质体基因(matk和ndhf-rpl32)组合。所述matk+ndhf-rpl32+its2序列如seqidno.9-14所示。

优选的，所述6种紫檀属木材分别为安哥拉紫檀pterocarpusangolensisdc.、印度紫檀pterocarpusindicuswilld.、大果紫檀pterocarpusmacrocarpuskurz、檀香紫檀pterocarpussantalinusl.f.、非洲紫檀pterocarpussoyauxiitaub.及染料紫檀pterocarpustinctoriuswelw.。

进一步地，本发明提供了一种鉴别6种紫檀属木材的方法，该方法利用dna组合条形码，并通过分子生物学手段来鉴别6种紫檀属木材；所述dna组合条形码是条形码序列matk、ndhf-rpl32、rbcl或its2中的任意2种以上或全部组合形成的dna组合条形码。

具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)将木材样品研磨处理成木粉；

(2)提取步骤(1)所得的木粉样品的dna；

(3)以步骤(2)提取得到的dna为模板，pcr扩增所述matk、ndhf-rpl32和its2条形码序列；

(4)将步骤(3)得到的pcr扩增产物进行测序，得到matk、ndhf-rpl32和its2序列，并对其进行组合；

(5)以步骤(4)所得的matk+ndhf-rpl32+its2条形码组合基于taxondna法和系统发育进化树法鉴别6种紫檀属木材。

优选的，步骤(1)所述的木粉研磨至200目及以上。

优选的，步骤(2)中所述dna需进行纯化，dna终浓度为1-200ng/μl。

优选的，步骤(3)所述pcr扩增的matk引物序列如seqidno.1-2所示，ndhf-rpl32引物序列如seqidno.3-4所示，its2引物序列如seqidno.5-6所示。

优选的，步骤(3)所述pcr扩增反应体系为0.5-3udna聚合酶、1.0-2.0mmmgcl2、200μm单一dntp、0.1-5.0μm单一引物、ph7.0-8.0的0.1-1.5mg/ml牛血清白蛋白和10-1000ng模板dna；pcr反应条件为94-96℃预变性0.5-10min；94-96℃变性0.05-2min，40-65℃退火0.5-2min，72℃延伸0.3-2min，循环20-50次；72℃终延伸2-15min。

优选的，步骤(5)中taxondna法基于“bestmatch”和“bestclosematch”2个指标判别；系统发育进化树法基于邻接法鉴别。

更进一步地，本发明提供了上述dna组合条形码，或上述鉴别6种紫檀属木材的方法在紫檀属木材鉴别中的应用。

本发明具有如下优点：

1、本发明基于一种dna组合条形码，可以实现6种紫檀属木材的准确鉴别，突破了传统木材识别技术无法识别木材到“种”的局限；

2、本发明筛选的鉴别引物特异性好，扩增及测序成功率较高；

3、本发明优选的matk+ndhf-rpl32+its2序列组合dna条形码在紫檀属6种木材中存在明显的差异位点，具有很强的鉴别能力；

4、本发明优选的taxondna法和系统发育进化树法操作简单，且基于这两种方法综合区分树种，识别准确度高；

5、本发明取样量极少，且不受取材位置(边材、心边材过渡区及心材)、样品原始状态(木块、木粉)因素影响；

6、本发明实验条件依赖少，一般pcr实验室均可满足；

7、本发明为紫檀属木材的准确识别提供了一种新的途径和思路。

总之，本发明提供的dna组合条形码及其方法可以实现6种紫檀属木材的准确鉴别，解决了传统木材识别方法无法鉴别紫檀属木材到“种”水平的难题，为海关、质量检验检疫等木材贸易执法部门和木材经营贸易人员提供一种高效可靠的鉴别方法，具有较高的实用价值。

附图说明

图1基于taxondna法的“bestmatch”(a)和“bestclosematch”(b)的单一及组合条形码的物种识别成功率；

图2基于dna组合条形码构建的系统发育邻接树(a)matk+ndhf-rpl32+its2,(b)matk+rbcl+its2；

图3基于dna组合条形码matk+ndhf-rpl32+its2鉴别未知样品的系统发育邻接树。

具体实施方式

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的发明范围。该技术领域的技术工程师可根据上述发明的内容做出一些非本质性的改进和调整。

实施例1：紫檀属树种木材特异性引物设计

(1)从genbank中下载紫檀属的质体dna序列matk、ndhf-rpl32、rbcl和细胞核dna序列its2(表1)；

表1genbank中下载的紫檀属dna条形码序列

(2)应用clustalx1.81软件比对序列，并查找确定紫檀属间4种dna条形码序列的差异位点；

(3)应用primerpremier5软件对matk、ndhf-rpl32、rbcl和its2四个条形码设计引物。所述扩增引物如表2所示。

表2四种dna条形码引物信息

实施例2：6种紫檀属木材标准样品的dna组合条形码优选与确定

(1)标准样品采集。

6种紫檀属标准样品(分别为安哥拉紫檀、印度紫檀、大果紫檀、檀香紫檀、非洲紫檀及染料紫檀)合计39号，均取自中国林业科学研究院木材标本馆。

(2)样品制备。

选取木材样品，利用70％酒精消毒后的解剖刀片将木材试样外表面切除，以避免外源污染；将木材试样切成若干木屑，并置于低温冷冻研磨仪中低温预冷3min，研磨3min，运行频率10cps；研磨结束后，过200目筛网，将细木粉分装到若干50ml的微量离心管中，每管木粉量500mg，并置于-80℃低温冰箱保存备用。

(3)dna提取。

在消毒处理的超净工作环境中，参照参考文献jiao等文章(jiaol,yiny,chengy,jiangx.dnabarcodingforidentificationoftheendangeredspeciesaquilariasinensis:comparisonofdatafromheatedoragedwoodsamples.holzforschung.2014；68(4):487-494.)对6种紫檀属木材进行dna提取。

(4)pcr扩增反应与测序。

引物对为实施例1中的四种dna条形码序列引物对，以dna提取物为模板进行pcr扩增，反应体系为30μl：其中premixextaq15μl(包括l.25uextaqdna聚合酶，2mmmgcl2，200μm单一dntp)，0.2μm单一引物和约20ng模板dna。所有pcr反应均在pcr扩增仪上进行。

反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，52℃(matk)、47℃(ndhf-rpl32)、50℃(rbcl)及51℃(its2)退火30s，72℃延伸20s，循环40次；72℃终延伸7min，即可获得高效扩增的dna目的片段。将扩增产物纯化后进行双向直接测序。

(5)序列比对分析与序列组合。

应用contigexpress软件对测序结果进行测序质量评估，去除两端低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接及校对。6种紫檀属木材的matk、ndhf-rpl32、rbcl及its2四种条形码序列genbank登录号和序列特征信息分别如表3和表4所示。

应用editseq软件分别对6种紫檀属木材物种的四种条形码进行组合，得到matk+its2、matk+ndhf-rpl32、matk+rbcl、ndhf-rpl32+its2、ndhf-rpl32+rbcl、rbcl+its2、matk+ndhf-rpl32+its2、matk+ndhf-rpl32+rbcl、matk+rbcl+its2、ndhf-rpl32+rbcl+its2、matk+ndhf-rpl32+rbcl+its2等11个dna条形码组合。

表3本研究测序得到的6种紫檀属木材的四种条形码序列genbank登录号

表4四种dna条形码序列特征信息

(6)序列组合dna条形码优选与确定。

应用mega软件通过k2p距离模型对单一及dna组合条形码的种内距离和种间距离进行计算分析，具体如表5所示。

利用taxondna软件中“bestmatch”和“bestclosematch”2个指标鉴别树种，结果表明，matk+its2和matk+ndhf-rpl32+its2能够识别以上6种紫檀属木材树种(图1)；应用mega软件基于邻接法构建系统发育树，matk+ndhf-rpl32+its2和matk+rbcl+its2对6种紫檀属木材有100％的物种识别成功率(图2)。

综合利用taxondna法与系统进化树法两种方法，对单一条形码及11个条形码组合进行筛选，确定识别6种紫檀属木材的最优dna组合条形码为matk+ndhf-rpl32+its2(seqidno.9-14)。

表5单一及dna组合条形码的种内及种间距离

实施例3：未知木材样品dna鉴别

(1)1块木材样品取自木材市场，通过对其进行解剖构造鉴定，鉴定为紫檀木类木材，但无法判定到檀香紫檀树种。因此基于dna方法鉴别木材。

(2)制备木粉并研磨至200目及以上。

(3)木材dna提取。

在消毒处理的超净工作环境中，参照实施例2中的dna提取方法，对木材进行dna提取。所述dna还需进行纯化，dna终浓度为1-200ng/μl。

(4)pcr扩增反应与测序。

木材dna提取物为模板进行pcr扩增，扩增引物如seqid1-6所示。反应体系为30μl：其中premixextaq15μl(包括l.25uextaqdna聚合酶，2mmmgcl2，200μm单一dntp)，0.2μm单一引物和约20ng模板dna。所有pcr反应均在pcr扩增仪上进行。反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性15s，52℃(matk)、47℃(ndhf-rpl32)及51℃(its2)分别退火30s，72℃延伸20s，循环40次；72℃终延伸7min，即可获得高效扩增的dna目的片段。将扩增产物纯化后进行双向直接测序。

(5)序列比对分析与树种鉴别。

对matk、ndhf-rpl32及its2三个序列的测序结果进行组合，采用组合序列matk+ndhf-rpl32+its2构建系统发育进化树，如图3所示。分析结果表明该样品能够与檀香紫檀样品聚类，而与其他紫檀属树种区分开。聚类结果证明该样品为檀香紫檀。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>中国林科院木材工业研究所

<120>一种鉴别6种紫檀属木材的dna组合条形码及其鉴别方法和应用

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<213>安哥拉紫檀组合序列

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<213>印度紫檀组合序列

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<213>大果紫檀组合序列

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<213>檀香紫檀组合序列

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<213>非洲紫檀组合序列

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<213>染料紫檀组合序列

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