本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测致病菌的方法，具体为一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记及其应用。
背景技术：
：荧光假单胞菌是属于假单胞菌属的嗜冷微生物，它是一种环境污染菌，能够广泛分布于各种环境中。它能够在低温环境下生长繁殖，冷藏的牛奶、高蛋白以及脂类丰富的食品一旦被荧光假单胞菌感染，该菌便会大量繁殖，逐渐演变为优势菌群。虽然经过巴氏杀菌以及超高温灭菌可以杀死荧光假单胞菌，但是它的胞外酶如蛋白酶和脂肪酶能够耐高温，即便是巴氏杀菌法和超高温瞬时灭菌情况下这些酶也依然能够保留一部分活性，灭菌后剩余的酶活会被再次激发进而分解乳制品中的酪蛋白等底物。有临床研究表明，荧光假单胞菌自溶后会释放内毒素，内毒素中的磷脂成分若污染了血液制品，会导致病人输血后产生不可逆的休克。随着人类社会电冰箱的普及，冷冻食品在人类的饮食构成中占据了极大的比例，嗜冷的荧光假单胞菌对于人类而言便是一种潜在的威胁。目前尚未有关于荧光假单胞菌导致食品中毒事件的报道，但是随着人们生活质量的提高，食品安全越来越引起人们的重视。近年来，随着对基因组学和分子生物学的研究进一步加深，一些新型快速检测方法如聚合酶链式反应，实时定量pcr，荧光原位杂交，流式细胞术等技术已经得到开发和应用。其中荧光原位杂交，流式细胞等技术能快速检测嗜冷的荧光假单胞菌，并能对活菌计数，可以达到和传统检测方法一致的结果。pcr方法被认为是目前鉴定荧光假单胞菌最有效的方法。由于荧光假单胞菌的pcr检测尚处于初步探索这一阶段，且假单胞菌属是一个很大的群体，可以分为5个生物类群，因此pcr检测过程中特异性引物很难设计。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够特异性检测乳制品中荧光假单胞菌的方法，本发明提供了一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰。表1分子标记序列名称序列(5’-3’)seqidno.p1-fnh2-ggtacacgcttcagca1p1-ragcacagagtcgacaccacc2p2-fnh2-cggcagagtcaccttcca3p2-rggtcatctcacagaccaa4p3-fnh2-ccgatggcacaccttcgt5p3-rggttgctgaactgtctga6所述的分子标记在制备检测乳制品中荧光假单胞菌试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测乳制品中荧光假单胞菌的步骤包括：(1)取样：提取乳制品样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本发明所述分子标记具有特异性好、灵敏度高的优点；(2)本发明所述分子标记完全能够避免假阳性或假阴性的现象。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，m为分子量为2000bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测乳制品中荧光假单胞菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测乳制品中荧光假单胞菌的步骤包括：(1)取样：提取乳制品样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测乳制品中荧光假单胞菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测乳制品中荧光假单胞菌的步骤包括：(1)取样：提取乳制品样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释300倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例3一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰。所述的分子标记在制备检测乳制品中荧光假单胞菌试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测乳制品中荧光假单胞菌的步骤包括：(1)取样：提取乳制品样品的基因组dna；(2)以步骤(1)提取的dna作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述甘蔗叶片样品的基因组dna的提取方法是试剂盒法或改良ctab法。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。sequencelisting<110>苏州蔻美新材料有限公司<120>一种用于检测乳制品中荧光假单胞菌的分子标记及其应用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<400>1ggtacacgcttcagca16<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agcacagagtcgacaccacc20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3cggcagagtcaccttcca18<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4ggtcatctcacagaccaa18<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5ccgatggcacaccttcgt18<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列<400>6ggttgctgaactgtctga18当前第1页12