一种具有核-壳结构的有机分子探针材料及其制备方法

专利名称：一种具有核-壳结构的有机分子探针材料及其制备方法
一种具有核-壳结构的有机分子探针材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及荧光成像技术中的分子探针材料，尤其是一种具有核壳结构的有机分子 探针材料及其制备方法。
背景技术：
分子成像技术的出现，归功于分子生物学和细胞生物学的发展、高特异性的荧光分子 标记探针以及细胞成像设备的发展等诸多因素。近年来，由于荧光成像技术具有直观、 标记靶点多样、费用低廉和操作简单等优点，已经成为当前研究细胞生物学的一个热点。 许多传统有机染料，如荧光素衍生物、罗丹明、青蓝素、氟硼荧(B0DIPY)系列衍生物 以及一些稀土配合物和无机量子点己经作为化学标记方法的荧光探针分子被广泛应用于 细胞成像的研究中。但这些材料在化学荧光标记及活体成像方面都存在一些难于克服的 缺陷，比如有机染料在生物体内易于被漂白和氧化代谢，其激发光谱往往处于高能量 区而导致穿透力弱和背景发光干扰严重；无机镉类量子点由于最终要代谢出镉和硒等毒 性离子也存在一定的应用局限性。因此开发具有发光性能稳定、细胞穿透力强、生物相 容性强及靶向明确的新型分子探针材料成为荧光成像技术必须解决的根本问题。
近年来，基于过渡金属配合物具有发光稳定性强、发光带窄、吸收和发射波长处于 红外和近红外等特点，已经作为荧光分子探针进行化学标记用于荧光细胞成像技术的研 究。将过渡金属配合物作为细胞荧光成像材料具有如下一些优势1)其发光稳定性强, 便于对研究的目标进行长时间的原位和时空分辨跟踪，并在该过程中不断提取相关的目 标信息；2)其发光带仄有利于排除标记成像材料的发光与生物自发光的背景干扰；3) 其激发谱宽，便于采用生物透光'窗口'区的激发光对标记成像材料进行激发，从而排 除对组织的伤害和增强激发光的穿透力，从而有利于跟踪细胞内部的相关情况。

发明内容
本发明的目的在于针对上述存在问题，提供一种发光性能稳定、细胞穿透力强、生物 相容性强及靶向明确且制备方法简单易行的具有核-壳结构的有机分子探针材料及其制 备方法。
本发明的技术方案
一种具有核-壳结构的有机分子探针材料，形成核壳结构的核心为过渡金属配合物， 壳层为双亲聚合物；所述过渡金属配合物的金属离子为Ru2+ (钌)、0s2+ (锇)或Re+ (铼)， 配体为单取代或多取代的啡啰啉以及单取代或者多取代的2， 2'-联吡啶，其取代基为4-{9，9' -(二取代荷基)}-苯基或4-{9，9' -[N，N' -(二咔唑基烷基)]芴基}-苯基；双亲 聚合物为聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)与甲基丙烯酸二甲胺基乙酯(DMAEMA)形成的共 聚物，其结构式为DMAEMA51-b-PEG,5-b-DMAEMA51。
一种如上述具有核-壳结构的有机分子探针材料的制备方法，其步骤如下1)按常 规合成方法分别制备所述过渡金属配合物和双亲聚合物；2)将上述制备的双亲聚合物和 过渡金属配合物溶解在二氯甲烷中，然后蒸出溶剂，再加入pH为7.1的PBS缓冲溶液， 采用超声波分散体系，然后用孔径为0. 20um 0. 75咖的聚碳酸酯膜过滤，即可制得具 有核-壳结构的有机分子探针材料的球形纳米粒子。
所述双亲聚合物和过渡金属配合物的摩尔比为l: 1 10。 所述双亲聚合物和过渡金属配合物与二氯甲烷的重量比为1: 100 500。 所述双亲聚合物和过渡金属配合物与PBS缓冲溶液的重量比为1: 1000 5000。 一种如上述具有核-壳结构的有机分子探针材料，用于对细胞进行红外荧光标记，方 法是将制备的具有核-壳结构的有机分子探针材料的纳米粒子与293T细胞和常见癌细胞 一起培养不超过1小时，在360 800 nm光激发下，该纳米粒子在580 900 nm波长范 围发射单一红外/近红外荧光，即可对细胞进行红外荧光标记，所述纳米粒子的直径小于 100 nm。
一种如上述具有核-壳结构的有机分子探针材料，用于荧光蛋白转染标记，方法是将 制备的具有核-壳结构的有机分子探针材料的纳米粒子与植入荧光蛋白基因的质粒结合 后，与293T细胞和常见癌细胞共同培养24 72小时，即可实现荧光蛋白转染标记，同 时还保留该纳米粒子的红外/近红外发光性能。
本发明所述的有机分子探针材料的结构说明
本发明所述的有机分子探针材料具有核壳结构，其核心为过渡金属配合物，壳层为 双亲聚合物；过渡金属配合物的配体为单取代或多取代的啡喂啉以及单取代或者多取代 的2，2'-联吡啶，其取代基为4-{9，9' _(二取代芴基)}-苯基或4-{9，9' -[N，N' -(二咔 唑基烷基)]芴基}-苯基，其中以啡啰啉为配体的过渡金属配合物的结构为
<formula>formula see original document page 4</formula>
以2，2'-联吡啶为配体的过渡金属配合物的结构为M = Ru， n = 3， n, = 2， X- = anion M = Os， n = 3， n' = 2， X_ = anion M = Re(C03Cl)， n = 1 ， n， = 0， X墨=0
其取代基4-{9，9' -(二取代芴基)}-苯基的结构为
m = 0-10
4-{9，9' -[N，N， -(二咔唑基烷基)]芴基}-苯基的结构为
m = 0-10 ，
双亲聚合物为聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)与甲基丙烯酸二甲胺基乙酯(DMAEMA)形成 的共聚物，结构式为DMAEMAs「b-PEGMAa5-b-DMAEMA51，其结构为
R = CH3; CH2CH3
本发明的优点是，该有机分子探针材料具有核-壳结构，其将过渡金属配合物荧光材 料包结于双亲聚合物中，有利于加强荧光材料抵抗复杂细胞环境中的配体交换以及细胞
对荧光材料的快速氧化代谢，从而稳定配合物的荧光发光性能；该材料的制备方法简单 易行、成本低；同时，由于这类球形发光纳米粒子对植入荧光蛋白基因质粒的转染功能 而实现了快速适时跟踪标记和长期跟踪标记的双标记功能，因此使其应用更加广泛。
具体实施方式
实施例l:
1) 过渡金属配合物Re(phen)(C0)3Cl即3-{2-[9, 9-双[6-(N-咔唑基己基)荷基]]}-苯基-邻啡罗啉氯化三羰基合铼的合成
将3-{2-[9,9-双[6-(N-昨唑基己基)荷基]]}-苯基-邻啡罗啉422 mg (0.5 mmol)和 Re (CO) 3C1 181 mg (0.5rnmo1)加入50mL甲苯中，回流反应12小时，蒸除溶剂,然后 将残余物用硅胶柱色谱层析，二氯甲烷为洗脱计，即可制得过渡金属配合物 Re(phen) (C0)3C1 390毫克，产率68%。
腿(400 MHz, CDC13, TMS) 5=9.59 (d, J=1.6 Hz， 1H), 9. 40 (d， J=4. 4 Hz， 1H), 8. 52 (t, J=3. 4 Hz, 2H), 8. 03 (dd, J=3. 6 Hz, 7. 6 Hz, 4H), 7.95 (dd, /=8. 8 Hz， 15. 2 Hz, 2H)， 7.86 (d, J=7. 6 Hz, IH)， 7.83 (t, J=8. 0 Hz， IH)， 7.76 (d, /=7.2Hz， 1H), 7.68 (d， J=8.0 Hz, 1H), 7.64 (s, IH)， 7.38 (t, J=8.0Hz, 5H), 7.32 (t， J=7.2 Hz, IH)， 7.28 (d, J=8.4 Hz， 5H)， 7.16 (t， J"=7.4 Hz， 4H)， 4.15 (t, J"=7.2 Hz， 4H)， 2.10-1.93 (m， 4H), 1.68 (t, J=6.4 Hz, 4H), 1.20-1.12 (m， 8H), 0.65-0.61 (m， 4H), 13C NMR (75 MHz, CDC13, TMS) 5=196.9， 189.6， 153.0， 152.2， 150.9， 147.1， 145.3， 143.0， 140.3， 140.2, 139.9, 137.9， 134.7, 133.7: 130.7， 130.5， 128.2, 127.8， 127.7， 125.5， 122.9, 122.8， 122.7, 121.9， 121.0, 120.4: 120.2， 118.6， 118.5， 108.6, 55.4， 42.9， 40.2， 29.6， 28.7， 26.7， 23.6.元素分 析理论值C64H54ClN403Re: C， 66.91: H， 4.74; N, 4.88.实际值C, 67.45: H， 4.88; N， 4. 75。上述分析数据表明配合物的结构为3- {2- [9, 9-双[6_ (N-昨唑基己基)芴基]]} -苯基 -邻啡罗啉氯化三羰基合铼Re(phen) (C0)3C1。
2) 双亲聚合物DMAEMA51-b-PEGMA65-b-DMAEMA51的合成
采用原子转移自由基聚合法(ATRP)，以N， N-双(2-溴异丁酰基)丙二胺为引发剂， 在500毫升的圆底反应瓶中，加入单体聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA) 9.5 mL (21.6 mmol)， CuBr 51.6 mg (0.36 mmol)和四氢呋喃200 mL，该反应混合物用氮气置换30 分钟；然后再加入六甲基四胺98 u L (0.36 mmol)和N, N-双(2-溴异丁酰基)丙二胺 73. 6 mg (0.18 mmol)，该反应混合物在40'C反应6小时；再加入第二个单体甲基丙烯酸 二甲胺基乙酯(DMAEMA) 6 mL (35.6 mmol)，在40。C继续反应12小时；反应液以丙酮为 淋洗溶剂，采用硅胶色谱柱层析分离出去催化剂CuBr,蒸出溶剂后用石油醚沉淀得到产 物，过滤后将其真空干燥24小时，即可制得12克双亲聚合物。'HNMR (400 MHz, D20， TMS): 8=4.19 (-OXK%-C//2-A^C//;^, _C00~O/2-O/2-0-) ， 3,72 (-0-0/厂0/2-O-) ， 3.36 (-0~C//3)， 2.76 (-0-C/ZHV(tE入)，2.36 HV(C//J2). GPC: Mn = 47,113， Mw/Mn = 1.14.根据 DMAEMA和PEGMA的甲基数确定双亲聚合物的结构为DMAEMA51-b-PEGMAes-b-DMAEMA51。
3) 将上述制得的双亲聚合物30 mg (0. 64 umol)和过渡金属配合物Re(phen) (C0)3C1 2.78 mg (2.5 umol)溶解在lmL 012(:12中并充分混合溶解成为均一的溶液，然后将溶剂(:恥12在45'C下蒸出，得到一黄色透明凝胶；然后加入pH值为7.1的PBS缓冲液30 mL， 超声振荡30分钟，采用孔径为0. 45 um的聚碳酸酯膜过滤后，即可制得具有核-壳结构 的有机分子探针材料的球形纳米粒子。紫外吸收在368 nm;在380 nm波长激发下，发射波 长为580 nm;采用透射电子显微镜测得粒子直径为40 nm~55 nm。
将17 ul非活性牛血清和151 uL上述制得的球形纳米粒子混合均匀，然后均匀滴加 到预置有人类肾细胞HEK293T(井细胞密度8 X 104)的24孔酶联检测板中，在标准细胞 培养箱中共同培养1小时，然后用PBS缓冲液将细胞清洗3次，采用TE 2000-U (Nikon, Japan)荧光显微镜在380nm波长激发下观察球形发光纳米粒子作为荧光标记材料进入 细胞的情况。结果证明，共同培养1小时时细胞被标记为红色，共同培养2小时时细胞 被标记的红色更深。
实施例2:
1) 过渡金属配合物1^0^7)3( ^)2即三{5-[2-[9，9-双[6-(^咔唑基己基)荷基]]]-苯基-2，2' _联吡啶}合二价钌的六氟磷酸盐的合成
将5- [2- [9, 9-双[6- (N-咔唑基己基)芴基]]]-苯基-2, 2 ，-联吡啶169. 5 mg( 0. 3 mmol) 和[Ru(DMS0)4]Cl2 48. 5 mg(O. 1 mmol)加入20 mL乙醇溶液中，在避光条件下回流24小 时；然后加入80 mg KPF6 (80 mg)继续回流2小时；冷却到室温后加入30毫升水，过 滤出沉淀产物，并用5毫升水洗涤两次；然后采用硅胶柱层析，用含3%丙酮的二氯甲烷 淋洗出产物，真空干燥后即可得到104 mg红色固体粉末状的过渡金属配合物 Ru(bpy)3(PF6)2。 MS (MALDI—ToF) : m/z 1941. 2. 'H NMR (500 MHz, CDC13) : 8.62 (bs, 3H， PyH)， 8.55 (bs， 3H， PyH), 8.01 (bs， 3H， PyH), 7.97 (bs， 3H， PyH), 7.91 (d， 6H, /=7.4Hz， PhH)， 7,86 (bs， 3H, PyH)， 7.83 (d， 6H, / = 7.4 Hz， PhH)， 7.81 (bs， 3H， PyH), 7.75 (d， 3H, / = 7.7 Hz, fluo-H)， 7.71 (d， 3H， J" = 7.7 Hz， fluo-H)， 7.60 (3， 3H， fluo—H)， 7.58 (d， 3H， J= 7. 7 Hz， fluo-H), 7.51 (bs, 3, PyH)， 7.36-7.31 (m, 9H, fluoreneH), 2.01 (t， 12H， J = 8.0 Hz， CH2), 1.09—1.04 (m, 36Hz， CH2), 0.73 (t, 18H, J = 7.0Hz, CH3)， 0.67(s， 12H, CH2). 13C NMR (125 MHz, CDC13): 157.04， 156.90, 151.81, 151.16, 149.86， 144.03， 141.45， 140.57, 138.49， 138.21， 134.09， 128.32， 127.91， 127.47， 127.00, 126.13， 125.75, 124.42， 124.28， 123.07, 121.47， 120.23， 120.04， 55.36， 40.49， 31.58， 29.79, 23.91, 22.67， 14.10。上述分析结果 表明配合物的结构式为三{5-[2-[9，9-双[6-(N-昨唑基己基)荷基]]]-苯基}_2，2，-联吡 啶}合二价钌的六氟磷酸盐[Ru (bpy) 3 (PF6) 2]。
2) 聚合物DMAEMA5「b-PEGMA65-b-DMAEMA^的合成与实施例1相同；
3) 将上述制得的双亲聚合物30 mg (0. 64 umol)和过渡金属配合物Ru(bpy)3(PF6)29. 2 mg (3.0 umol)溶解在5 raL CH2C12中并充分混合溶解成为均一的溶液，然后将012(:12溶 剂在35'C下蒸出得到一黄色透明凝胶；然后加入pH值为7.1的PBS缓冲液30mL，超声振荡30分钟，采用孔径为0. 20 um的聚碳酸酯膜过滤后，即可制得具有核-壳结构的有 机分子探针材料的球形纳米粒子。紫外吸收在465 nm;在465 nm波长激发下，发射波长在 650 nra:采用透射电子显微镜测得粒子直径在65-85 nm之间。
将160 uL上述制得的球形纳米粒子的PBS溶液和植入绿色荧光蛋白基因的质粒 (pEGFP-C2， 2.0 ug)混合均匀，然后加入15 ul非活性牛血清并混合均匀；再将该溶 液均匀滴加到预置有人类肾细胞HEK293T (井细胞密度8 X 104)的24孔酶联检测板中， 在标准细胞培养箱中共同培养36小时，然后用PBS缓冲液将细胞清洗3次，采用TE 2000-U (Nikon, Japan)荧光显微镜在465 nm波长激发下观察球形发光纳米粒子作为 荧光标记材料进入细胞的情况；并采用490 nm波长激发来观察荧光蛋白基因的转染情 况。结果证明，共同培养36小时后，在465 nm波长激发下细胞为红色，说明球形发光 纳米粒子仍然稳定存在于细胞中；当采用490 nm波长激发时，部分细胞为绿色，说明荧 光蛋白基因的转染成功。
权利要求
1.一种具有核-壳结构的有机分子探针材料，其特征在于；形成核壳结构的核心为过渡金属配合物，壳层为双亲聚合物；所述过渡金属配合物的金属离子为Ru2+(钌)、Os2+(锇)或Re+(铼)，配体为单取代或多取代的啡啰啉以及单取代或者多取代的2，2’-联吡啶，其取代基为4-{9，9’-(二取代芴基)}-苯基或4-{9，9’-[N，N’-(二咔唑基烷基)]芴基}-苯基；双亲聚合物为聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)与甲基丙烯酸二甲胺基乙酯(DMAEMA)形成的共聚物，其结构式为DMAEMA51-b-PEGMA65-b-DMAEMA51。
2. —种如权利要求1所述具有核-壳结构的有机分子探针材料的制备方法，其特征在于步骤如下1)按常规合成方法分别制备所述过渡金属配合物和双亲聚合物；2)将上述制备的双亲聚合物和过渡金属配合物溶解在二氯甲烷中，然后蒸出溶剂，再加入pH 为7. 1的PBS缓冲溶液，采用超声波分散体系，然后用孔径为0. 20um 0. 75 um的聚碳 酸酯膜过滤，即可制得具有核-壳结构的有机分子探针材料的球形纳米粒子。
3. 根据权利要求2所述具有核-壳结构的有机分子探针材料的制备方法，其特征在于 所述双亲聚合物和过渡金属配合物的摩尔比为1: 1 10。
4. 根据权利要求2所述具有核-壳结构的有机分子探针材料的制备方法，其特征在于所述双亲聚合物和过渡金属配合物与二氯甲烷的重量比为1: 100 500。
5. 根据权利要求2所述具有核-壳结构的有机分子探针材料的制备方法，其特征在于所述双亲聚合物和过渡金属配合物与PBS缓冲溶液的重量比为1: 1000 5000。
6. —种如权利要求1所述具有核-壳结构的有机分子探针材料，其特征在于用于对细胞进行红外荧光标记，方法是将制备的具有核-壳结构的有机分子探针材料的纳米粒子与293T细胞和常见癌细胞一起培养不超过1小时，在360 800 nm光激发下，该纳米 粒子在580 900 nra波长范围发射单一红外/近红外荧光，即可对细胞进行红外荧光标记， 所述纳米粒子的直径小于100 nm。
7. —种如权利要求1所述具有核-壳结构的有机分子探针材料，其特征在于用于 荧光蛋白转染标记，方法是将制备的具有核-壳结构的有机分子探针材料的纳米粒子与植 入荧光蛋白基因的质粒结合后，与293T细胞和常见癌细胞共同培养24 72小时，即可 实现荧光蛋白转染标记，同时还保留该纳米粒子的红外/近红外发光性能。
全文摘要
一种具有核-壳结构的有机分子探针材料，核心为过渡金属配合物，壳层为双亲聚合物，金属离子为Ru²⁺(钌)、Os²⁺(锇)或Re⁺(铼)，配体为单或多取代的啡啰啉以及单或多取代的2，2’-联吡啶；双亲聚合物为聚乙二醇甲基丙烯酸酯与甲基丙烯酸二甲胺基乙酯形成的共聚物。本发明的优点是具有核-壳结构，其将过渡金属配合物荧光材料包结于双亲聚合物中，有利于加强荧光材料抵抗复杂细胞环境中的配体交换和细胞对荧光材料的快速氧化代谢，从而稳定配合物的荧光发光性能；由于这类球形发光纳米粒子对植入荧光蛋白基因质粒的转染功能而实现了快速适时跟踪标记和长期跟踪标记的双标记功能，因此使其应用更加广泛。
文档编号G01N21/64GK101602942SQ200910069818
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月22日 优先权日2009年7月22日
发明者磊 刘, 曾宪顺 申请人:天津理工大学