一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物发酵技术领域，特别设及一种W重组运动发酵单胞菌利用賴杆 产乙醇的方法。
【背景技术】
[0002] 賴杆的能源化是新形势下賴杆的一种利用方式。世界其他一些国家已较早的尝试 了賴杆能源化的探索。丹麦是世界上首先用賴杆发电的国家之一。在美国，部分賴杆通过 较为传统的方法利用；一部分賴杆作为原料，通过发酵的方式产生燃料乙醇来代替传统液 体能源。同时，日本、加拿大可开始了賴杆能源化的研究，并在利用賴杆提取酒精方面取得 了进展。
[0003] 賴杆的主要成分是纤维素，要想利用賴杆必须将纤维素降解。纤维素酶不是单纯 的某一种酶，而是一系列酶的总称，能将纤维素降解为短链纤维素分子、纤维二塘和葡萄 糖。纤维素酶主要包括Ξ种成分，能分别降解特定的糖巧键。（l)ci酶（简称CBH)。它是 一种外切酶，作用于无取代基的还原端，依次水解β-1，4糖巧键（2)Cx酶（简称EG)。它是 一种内切酶，作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1,4糖巧键，产生大量非还 原末端的小分子纤维素；（3)β-葡萄糖巧酶（简称βG)。它水解纤维二糖和短链的纤维 寡糖，生成葡萄糖，对纤维二糖和纤维Ξ糖的水解速度较快，随着葡萄糖聚合度的增加水解 速度下降。
[0004] 很多微生物均可产生纤维素酶，如真菌，细菌，放线菌。但细菌产纤维素酶的产量 较低，目前主要用于产纤维素酶的微生物为真菌，如木霉属，曲霉属，青霉属。本章节利用里 氏木霉和黑曲霉混合发酵制备纤维素酶。
[0005] 里氏木霉纤维素酶产量高，并且产生的纤维素酶是胞外酶，易与菌体分离纯化从 而得到所需的酶。里氏木霉产生的纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶（C1酶）、纤维二糖酶 (Cx酶）及β-葡萄糖巧酶。
[0006] 里氏木霉菌株虽然产生的内切型和外切型葡聚糖酶活力较高，但是β-葡萄糖巧 酶的活力比较低，分解纤维二糖的能力不够强。而黑曲霉产生的β-葡萄糖巧酶具有较高 的酶活力，通过加入产自黑曲霉的β-葡萄糖巧酶，或者通过使用里氏木霉和黑曲霉共同 培养，可W有效地缓解纤维素酶降解纤维素过程中因纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑 制现象。
[0007] 运动发酵单胞菌Ζ.mobilis是一种革兰氏阴性菌，是发酵单胞菌属的一个种，因 具有很强的运动性而得名。大多呈直杆状，尾端呈圆形或卵圆形，常成对存在，但很少集结 成短链状。兼性厌氧条件生长，在无氧条件下生长最佳，有氧条件下也可生存，高度耐酸，能 在抑3. 5~7. 5之间生长。运动发酵单胞菌利用化tner-Doudomff途径代谢生产乙醇，运 种途径耗能较少，产量较高。Z.mobilis作为乙醇生产菌株具有一定优良的特性：如较高 的乙醇产率，较强的乙醇耐受性，W及高度发酵底物专一性。与酵母相比，运动发酵单胞菌 乙醇产量比酵母要高5%~10%，可达理论值的97%，乙醇转化率是酵母的5倍。但是，Z. mobills也有自身的局限性，底物利用范围较窄，只能利用葡萄糖、果糖和薦糖。近来已有人 利用基因工程的方法对其不利因素进行了改造，使其能够利用多种底物。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种W重组运动发酵单胞菌利用賴杆产乙醇的方法。该方法 W賴杆为基质，利用黑曲霉和木霉混合发酵，制作粗酶液，产生纤维素酶，用粗酶液对賴杆 进行处理，将賴杆中的纤维素分解产生还原糖。最后用重组运动发酵单胞菌发酵酶解后的 还原糖，产生乙醇。
[0009] 本发明的目的通过如下技术方案实现： 一种W重组运动发酵单胞菌利用賴杆产乙醇的方法，步骤如下： 一、 氨爆预处理賴杆：将賴杆粉碎至200目细微粉末状，将粉碎后的賴杆与水按照重 量比为賴杆：水=5:2的比例混匀，在密封条件下加热揽拌，使其在溫度为130-15(TC之间， 压力在0. 4Mpa条件下反应6-8min，反应结束后，瞬间放气，待其冷却后，即得到预处理的賴 杆； 二、 纤维素粗酶液的制备：（1)分别对里氏木霉菌和黑曲霉菌进行培养、活化、发酵后 得到里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液；（2)将里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液按照体 积比为1:1的条件进行混合，将两者的混合液在4°C下，于8000巧m的转速下离屯、lOmin，取 其上清液并将其转移到另一离屯、管中在相同条件下进行第二次离屯、，取上清液，即得纤维 素酶粗酶液； Ξ、酶解賴杆：将上步所得纤维素酶粗酶液加入到预处理的賴杆中，在50°C的条件下， 酶解4天后接种重组运动发酵单胞菌，在32°C的摇床中厌氧、静置发酵，发酵时间6化即得； 所述纤维素酶粗酶液：賴杆=12ml:1邑。
[0010] 所述里氏木霉菌和黑曲霉菌培养、活化和发酵的操作方法一样，方法如下：将里氏 木霉菌或黑曲霉菌接种在PDA固体培养基中，在28Γ恒溫条件下密封培养3-5天后，用灭菌 处理过的生理盐水将其生成的抱子从培养基上洗涂下来，并用移液枪将成团状存在的抱子 打碎，使之完全分散，并稀释至至1〇7个/ml的浓度，得到里氏木霉抱子悬浮液或黑曲霉抱 子悬浮液；然后将里氏木霉抱子悬浮液或黑曲霉抱子悬浮液W10%的接种量接种于种子培 养基中，在摇床中培养4化后得到活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液；所述培养条 件为：溫度28°C，转速15化pm; (2)将上述活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液按10% 的接种量接种到发酵培养基中发酵7天得到里氏木霉发酵液或黑曲霉菌发酵液，所述发酵 条件为：溫度28°C，转速15化pm。
[0011] 所述重组运动发酵单胞菌的培养方法如下：用普通ZM种子培养基活化运动发酵 菌：将运动发酵菌按10%的接种量接入种子培养基，置于32°C的恒溫摇床中，静置活化lOh， 取生长lOh后的种子液1. 4ml按10%的接种量（v/v)接种ZM种子培养基，置于32°C的恒溫 摇床中，二次静置活化，生长2地，测量0D600吸光度，当0D600吸光度达到10时，即得到活 化运动发酵菌，取活化运动发酵菌菌种，依次采用离屯、、水洗的方式去除含有的葡萄糖W及 乙醇，同时用不含葡萄糖的普通ZM种子培养基将离屯、、水洗后的活化运动发酵菌菌种悬起 并混匀即得到重组运动发酵单胞菌。
[0012] 所述种子培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的賴杆10g/l，教皮5g/ L酵母提取物5g/l，膜蛋白腺3g/l，吐溫-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液1ml/L，Mandles营养盐浓溶液lOOml/L，抑为4. 8的浓度为Imol/L的巧樣酸缓冲液50ml/L。
[0013] 所述发酵培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的绝干賴杆30g/l，教皮 25g/l，酵母提取物10g/l，蛋白腺3g/l，吐溫-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液 lml/L，Mandles营养盐浓溶液lOOml/L，抑为4. 8的浓度为Imol/L的巧樣酸缓冲液50ml/ L。
[0014] 本发明的作用机理为：运动发酵单胞菌作为乙醇生产菌株具有一定优良的特性：如较 高的乙醇产率，较强的乙醇耐受性，但是，运动发酵单胞菌也有自身的局限性，底物利用范 围较窄，不能直接作用于纤维素。本发明中利用黑曲霉和木酶水解混合发酵賴杆产生纤维 素酶粗酶液，并对賴杆进行酶解产生还原糖。并对纤维素酶粗酶液的发酵过程进行优化。通 过将传统的黑曲霉和木霉混合发酵产纤维素酶改进为分别发酵再对粗酶液进行混合，有效 地改善了因纤维二糖的积累而产生的产物反馈抑制现象，提高纤维素酶的活性和产