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[0037] (1)溫度对糖得率的影响 选取酶解的溫度梯度为40°C、45°C、5(rC、55°C、6(rC。按料液比为12,即12ml粗酶液 歷对应Ig的賴杆，酶解时间为3d。用DNS法测还原糖浓度，计算糖得率。
[003引（2)时间对糖得率的影响 选取酶解的时间梯度为ld、2t3d、如、5d。按料液比为12,即12ml粗酶液歷对应Ig的賴杆，酶解溫度为50°C。用DNS法测还原糖浓度，计算糖得率。
[0039] (3)料液比对糖得率的影响 选取酶解的料液比梯度为4:1、8:1、12:1、16:1。在55°C酶解3d。用DNS法测还原糖浓 度，计算糖得率。
[0040] 4、结果 (1)几种粗酶液酶活的比较 接种里氏木霉得到的粗酶液标记为M，接种黑曲霉得到的粗酶液标记为H，里氏木霉和 黑曲霉混合发酵的标记为H/M，将发酵结束后得到的粗酶液Μ和粗酶液Η按体积比为1:1进 行混合得到的粗酶液即为歷。测量运四种粗酶液的CMC酶活和FPA酶活。单独接种黑曲霉 和里氏木霉的酶活都较低。而用分开接种的粗酶液按1:1混合得到的粗酶液HM，CMC酶活 和FPA酶活都是最高的。其中CMC酶活为67IU/ml，FPA酶活为2. 3IU/ml。
[0041] ( 2)溫度对糖得率的影响 在不同溫度下的糖得率，溫度由40°C升高至50°C时，糖得率逐渐升高，当由50°C升高 到60°C时，糖得率开始降低。运可能是因为水解溫度越高，越利于纤维素的糖巧键断裂，越 利于水解过程的进行，化学反应越充分。但在5(TCW后，可溶性糖产量有所下降，运可能是 因为随着水解溫度不断升高，高溫使部分酶失活导致预处理过程中降解的纤维素量减少所 致。因此，最佳的酶解溫度为50°C。
[0042] (3)时间对糖得率的影响 时间对糖得率的影响。酶解过程中，随着碱水解时间增加，糖得率提高，呈逐渐升高的 趋势。当酶解时间为4d时，糖得率达到最高，为12%左右，随着时间的逐渐增加，糖得率逐 渐基本不再变化。因此，最佳的酶解时间为4d。
[0043] (4)料液比对糖得率的影响 料液比对糖得率的影响。酶解过程中，随着料液比增加，糖得率呈逐渐升高的趋势。当 料液比为12:1时，即12ml的粗酶液添加Ig賴杆，糖得率达到最高，为13%。再增加料液比， 糖得率逐渐基本不再变化。 根据上述方法，用里氏木霉发酵得到的纤维素酶粗酶液和黑曲霉发酵得到的纤维素酶 粗酶液按1:1混合，将混合后的粗酶液，按料液比为12:1，即12ml的粗酶液添加Ig的賴杆， 在50°C的条件下，酶解4d。接种重组运动发酵单胞菌，发酵产乙醇。得到乙醇浓度为5g/L。 賴杆转化为乙醇的转化率为5%，即lOOg賴杆产生5g的乙醇。
【主权项】
1. 一种以重组运动发酵单胞菌利用秸杆产乙醇的方法，其特征在于：步骤如下：一、 氨爆预处理秸杆：将秸杆粉碎至200目细微粉末状，将粉碎后的秸杆与水按照重量比为 秸杆：水=5:2的比例混匀，在密封条件下加热搅拌，使其在温度为130-150°C之间，压力在 0. 4Mpa条件下反应6-8min，反应结束后，瞬间放气，待其冷却后，即得到预处理的秸杆； 二、 纤维素粗酶液的制备：（1)分别对里氏木霉菌和黑曲霉菌进行培养、活化、发酵后 得到里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液；（2)将里氏木霉发酵液和黑曲霉菌发酵液按照体 积比为1:1的条件进行混合，将两者的混合液在4°C下，于SOOOrpm的转速下离心lOmin，取 其上清液并将其转移到另一离心管中在相同条件下进行第二次离心，取上清液，即得纤维 素酶粗酶液； 三、 酶解秸杆：将上步所得纤维素酶粗酶液加入到预处理的秸杆中，在50°C的条件下， 酶解4天后接种重组运动发酵单胞菌，在32°C的摇床中厌氧、静置发酵，发酵时间60h即得； 所述纤维素酶粗酶液：秸杆=12ml:lg。2. 如权利要求1所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸杆产乙醇的方法，其特征在于： 所述里氏木霉菌和黑曲霉菌培养、活化和发酵的操作方法一样，方法如下：将里氏木霉菌或 黑曲霉菌接种在PDA固体培养基中，在28°C恒温条件下密封培养3-5天后，用灭菌处理过 的生理盐水将其生成的孢子从培养基上洗涤下来，并用移液枪将成团状存在的孢子打碎， 使之完全分散，并稀释至至1〇 7个/ml的浓度，得到里氏木霉孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬 浮液；然后将里氏木霉孢子悬浮液或黑曲霉孢子悬浮液以10%的接种量接种于种子培养基 中，在摇床中培养48h后得到活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液；所述培养条件为： 温度28°C，转速150rpm; (2)将上述活化的里氏木霉菌液或活化的黑曲霉菌液按10%的接 种量接种到发酵培养基中发酵7天得到里氏木霉发酵液或黑曲霉菌发酵液，所述发酵条件 为：温度28°C，转速150rpm。3. 如权利要求2所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸杆产乙醇的方法，其特征在于： 所述重组运动发酵单胞菌的培养方法如下：用普通ZM种子培养基活化运动发酵菌：将运动 发酵菌按10%的接种量接入种子培养基，置于32°C的恒温摇床中，静置活化10h，取生长10h 后的种子液1. 4ml按10%的接种量（v/v)接种ZM种子培养基，置于32°C的恒温摇床中，二 次静置活化，生长24h，测量0D600吸光度，当0D600吸光度达到10时，即得到活化运动发酵 菌，取活化运动发酵菌菌种，依次采用离心、水洗的方式去除含有的葡萄糖以及乙醇，同时 用不含葡萄糖的普通ZM种子培养基将离心、水洗后的活化运动发酵菌菌种悬起并混匀即 得到重组运动发酵单胞菌。4. 如权利要求2或3所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸杆产乙醇的方法，其特征在 于：所述种子培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的秸杆10g/L，麸皮5g/L，酵 母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液lml/L， Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4. 8的浓度为lmol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。5. 如权利要求2或3所述的以重组运动发酵单胞菌利用秸杆产乙醇的方法，其特征在 于：所述发酵培养基包括下述质量浓度的原料：氨爆预处理的绝干秸杆30g/L，麸皮25g/ L，酵母提取物10g/L，蛋白胨3g/L，吐温-80为40滴/L，Mandles微量元素盐溶液lml/ L，Mandles营养盐浓溶液100ml/L，pH为4. 8的浓度为lmol/L的柠檬酸缓冲液50ml/L。
【专利摘要】本发明提供一种以重组运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的方法。该方法以秸秆为基质，利用黑曲霉和木霉混合发酵，制作粗酶液，产生纤维素酶，用粗酶液对秸秆进行处理，将秸秆中的纤维素分解产生还原糖。最后用重组运动发酵单胞菌发酵酶解后的还原糖，产生乙醇。本发明将黑曲霉和木霉分别发酵得到的纤维素酶粗酶液按1:1混合，有效地控制了产物反馈抑制，从而得到活性和产量更高的纤维素酶粗酶液。将运动发酵单胞菌接种于酶解后的含还原糖的发酵液中，大大提高了运动发酵单胞菌利用秸秆产乙醇的效率，解决了运动发酵单胞菌底物利用范围狭窄，不能有效利用秸秆的弊端，本发明中利用秸秆转化为乙醇的转化率为5%，即100g秸秆产生5g的乙醇。
【IPC分类】C12R1/01, C12P7/10
【公开号】CN105368882
【申请号】CN201510966172
【发明人】邓颖
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月22日