专利名称：一种用于人白细胞抗原基因分型的液相基因芯片系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及人白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)基因分型的检测方法和试剂。
背景技术：
HLA基因位于人染色体6p21.3，全长约4000kb，是人类基因中遗传多态性最复杂的系统。HLA为迄今已知基因中多态性最高的基因复合体，现已知的约有2000多个等位基因。根据结构和分布特点，HLA复合物可分为三类，分别称之为I、II、III类基因。I类基因包括HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H、-J、-K、-L共十种。II类基因有DR、DP、DQ系列等27种，其分子主要分布于抗原呈递细胞表面。另外，还有一些构成补体成分的III类基因。这些基因的不同组合构成千差万别的的个体HLA基因型和对应的特异性。HLA基因的多态性与疾病的遗传易感性有明显关系。HLA基因产物控制着对病原的免疫反应、对移植物的耐受或排斥以及肿瘤监视。故在临床上尤其移植医学上，必须对供受体进行HLA分型。传统的HLA分型技术主要有三类血清学、细胞学和分子生物学检测方法。血清学、细胞学HLA分型方法在分型准确性、分辨率和实验操作上有许多不足之处。近年来国内外已将血清学和细胞学的方法逐渐淘汰，主要发展分子生物学的方法来分型。目前分子生物学的方法有多种，主要包括限制性片段多态性(RFLP)检测技术、PCR/SSO(sequence specific oligonucleotide probetyping)技术、PCR/SSP技术，其中反相SSO是应用最广泛的基因分型技术。
90年代以来，基因芯片(genechip)技术发展很快。所谓基因芯片是指将各种特定序列的DNA片段(或称探针，probe)，通过微点样或分子操纵和微电子芯片技术等手段集成至固相载体如玻璃芯片或硅芯片上。应用时，这种集成有众多探针的芯片按DNA碱基配对原则(A与T、G与C配对)与处理后的待测样品DNA杂交。如果样品DNA的序列与探针完全配对，这种精确的配对结合将可通过标记信号探测出来。如果不配对，意味着有突变，这种突变可为分型软件识别。基因芯片在基础研究中可应用于基因鉴别、快速DNA序列测定、基因突变多态性的研究和基因表达活性测定等重要领域。它在医学中可作为分子遗传病的综合诊断，应用于法医学和癌症研究等。
基因芯片的主要特点是在很小的区域内集成了大量的探针。传统的基因芯片是通过固相载体上的点样位置给探针编码，而软件根据该地址分析样品的检测信号。这种基因芯片的优点是可以高度集成探针，即利用一张芯片可同时检测多达数十万个信号。由于DNA样品的高度复杂性，传统基因芯片的检测结果重复性一般不是很好。此外，传统基因芯片由于是固-液相杂交，对杂交的控制要求很高，探针相互间也会影响杂交的结果，进而干扰检测信号。在实现高通量检测时，传统基因芯片还需要昂贵的检测仪器系统。
中国专利CN1185353C，表述了一种基因芯片的设计方法，将针对人白细胞抗原基因复合体等位基因的探针固定在各种膜基质上，以酶联底物显色法检测信号。这种方法的稳定性和重复性不理想，实现高通量检测也较困难。
因此，本领域迫切需要高通量、稳定性好、重复性、特异性较佳的HLA基因分型检测方法和试剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供一套用于人白细胞抗原基因分型的特异性探针；本发明的另一目的是提供一种由上述探针和载体组成的基因芯片，以克服现有技术不能实现高通量以及稳定性、重复性、特异性不足的问题；本发明的另一目的是提供一套用于人白细胞抗原基因分型的特异性引物；本发明的另一目的是提供一种用于人白细胞抗原基因分型检测的试剂盒；本发明的再一目的是提供一种检测人白细胞抗原基因分型的方法。
本发明的构思是这样的选择人白细胞抗原基因复合体中多态性最丰富的HLA-A、-B、-DRB1三个基因位点进行基因分型。根据三个基因位点已经报道的等位基因序列，选择每个等位基因的主要变异区设计、合成一套探针，再将探针连接到载体，组成一套用于人白细胞抗原基因分型的基因芯片。
在HLA-A、-B、-DRB1三个基因探针设计位点的5‘端和3’端，分别设计、合成用于PCR扩增的上下游引物，组成一套用于扩增待检标本HLA-A、-B、-DRB1等位基因的PCR引物，引物的5‘端均可进行生物素标记。使用该引物，对HLA-A、-B、-DRB1等位基因的主要变异区进行PCR扩增。
将扩增得到的待检测基因片段加到上述基因芯片中，在适当的条件下进行杂交，分析杂交结果，即可确定待检标本的基因型。
本发明的第一方面，公开了一组用于人白细胞抗原基因分型的探针，序列见下表表1a、区分HLA-A等位基因的探针
表1b、区分HLA-B等位基因的探针
表1c区分HLA-DRB1等位基因的探针
在本发明一个优选的方案中，探针进行如下修饰X-(5’-探针-3’)其中X＝NH2-(CH2-CH2)n-O-；n为3～6的整数，优选n＝3；本发明的第二方面，提供一套由上述探针与载体结合的基因芯片，所说的载体包括表面经羧基修饰的聚苯乙烯微球、玻璃芯片或各种膜基质。
在一个优选的方案中，载体为荧光微球，即一种表面经羧基修饰的聚苯乙烯微球，微球内部包埋荧光物质，不同的荧光物质发出的荧光用于识别微球的种类。5’端氨基修饰的探针与荧光微球表面的羧基通过缩合反应，使探针共价结合于微球表面。每种荧光微球耦联一种探针，荧光微球的种类与探针种类一一对应。将结合不同探针的荧光微球等量混合在一起，就组成了一套液相基因芯片。该类荧光微球可通过商业途径购买，例如，可以购买美国Luminex Corporation的产品。
本发明的第三方面，公开了一组用于人白细胞抗原基因分型的PCR引物，序列见下表表2a、HLA-A基因的第二外显子及第三外显子的PCR引物序列
表2a中，AE2F1、AE2R2及AE2R1为扩增HLA-A基因第二外显子的引物；AE3F1、AE3F2、AE3R1及AE3R2为扩增第三外显子的引物，对本领域一般技术人员而言，上述PCR引物的适当组合均可使第二及第三外显子扩增。
表2b、HLA-B基因的第二外显子及第三外显子的PCR引物序列
表2b中，BE2F1、BE2R1及BE2R2为扩增HLA-B基因第二外显子的引物BE3F1、BE3R1为扩增第三外显子的引物，对本领域一般技术人员而言，上述PCR引物的适当组合均可使第二及第三外显子扩增。
表2c、HLA-DRB1基因的第二外显子的PCR引物序列
表2c中，DE2F1、DE2F2、DE2F3、DE2R1及DE2R2为扩增HLA-DRB1基因第二外显子的引物；对本领域一般技术人员而言，上述PCR引物的适当组合均可使第二显子扩增。
本发明的第四方面，提供了一种用于人白细胞抗原基因分型检测的试剂盒，包含HLA-A、-B、-DRB1三个基因位点的探针与耦联载体组成的基因芯片；扩增HLA-A、-B、-DRB1等位基因的PCR引物。
其中HLA-A、-B、-DRB1三个基因位点的探针序列见表1，优选5‘端氨基修饰的探针，更优选带有聚合度为3～6的聚乙二醇臂的探针，最优选带有聚合度为3的聚乙二醇臂的探针。
其中与探针耦联的载体优选美国Luminex Corporation公司生产的表面经羧基修饰的荧光聚苯乙烯微球，微球直径约5.5um。
其中扩增HLA-A、-B、-DRB1等位基因的PCR引物序列见表2。
本发明的第五方面，公开了一种检测人白细胞抗原基因分型的方法，包括如下步骤(1)标本处理待检样品用常规方法提取基因组DNA，作为PCR扩增模板；(2)多重PCR扩增HLA-A基因的第二外显子及第三外显子的PCR扩增PCR的引物体系为AE2F1∶AE2R2∶AE2R1∶AE3F1∶AE3R1∶AE3F2∶AE3R2＝1∶2∶0.1∶1∶2∶0.1∶0.1，其中AE2R2及AE3R1两条引物的5‘端进行生物素标记，引物AE2F1的浓度为0.1～0.4uM，最适为0.2uM；HLA-B基因的第二外显子及第三外显子的PCR本发明实现了同时均衡扩增第二、三两个外显子，PCR的引物体系为BE2F1∶BE2R1∶BE2R2∶BE3F1∶BE3R1＝1∶2∶0.1∶1.5∶3，其中BE2R1及BE3R1两条引物的5‘端进行生物素标记，而引物BE2F1的浓度为0.1～0.4uM，最适为0.2uM；HLA-DRB1基因的第二外显子的PCRPCR的引物体系为DE2F1∶DE2F2∶DE2F3∶DE2R1∶DE2R2＝1∶0.5∶0.5∶2∶0.1，其中引物DE2R1的5‘端进行生物素标记，而引物DE2F1的浓度为0.1～0.2uM，最适为0.15uM；引物序列见表2；(3)杂交将HLA-A、-B、-DRB1三个基因位点的探针与Luminex Corporation荧光微球体耦联组成的基因芯片悬浮于杂交液中；将PCR扩增产物加入杂交体系，60℃温育15min.，再将反应后的微球与streptavidin修饰的藻红蛋白(SAPE)孵育；探针种类及序列见表1；(4)结果判读用Luminex仪器读取数据信息，用HLA分型软件分析结果。
本发明的有益效果体现在(1)本发明的PCR体系为多重PCR，即可同时扩增多个DNA片段。通过引物序列设计、扩增的DNA片段的长度设计、引物体系中各种引物的配比，实现了多个基因片段的均衡扩增。
(2)本发明的引物系统中选择关键的下游引物进行末端标记，使得扩增得到的每个DNA片段都带有生物素标记，方便检测。
(3)本发明探针系统包括三个基因位点的多个等位基因。目前已确证的HLA-A、B、DRB1三类等位基因的数量分别为324个、587个及389个。由于人类每个个体有两个等位基因，因此HLA-A、B、DRB1可能的等位基因组合分别有324×(324-1)/2＝52326种、589×(589-1)/2＝173166种、389×(389-1)/2＝75466种组合。另外，由于HLA等位基因的DNA序列并不是随机的，所以如何提高探针的工作效率并不是一个简单的数学问题。本发明通过大量的实验研究，调整探针的种类、位点、长度，设计出一套杂交效率高、相对均衡的探针系统。
(4)本发明采用Luminex技术，耦联于荧光微球的探针与PCR扩增得到的等位基因片段在液相环境中杂交，相对于传统基因芯片的液-固相杂交，杂交效率更高，效果更好。另外，杂交过程可在普通96孔板上进行，可使用多通道如8通道或12通道排枪进行移液操作，因此整个杂交过程便捷快速，可有效实现高通量检测。
具体实施例方式
液相基因芯片传统的基因芯片是指将各种特定序列的DNA片段(或称探针，probe)，通过微点样或分子操纵和微电子芯片技术等手段集成至固相载体如玻璃芯片或硅芯片上，通过固相载体上的点样位置给探针编码，而软件根据该地址分析样品的监测信号。
液相基因芯片是把探针以共价方式耦联到起支持作用的微球上，微球的直径一般为5.5um左右，材料包括聚苯乙稀等惰性材料；微球表面以羧基进行修饰；微球内部包埋有荧光物质，且根据荧光的比例可以区分微球的种类。其技术核心是微球包含荧光物质，将微球分别染成不同的荧光色，可通过微球内部的荧光给探针编码。把标记不同探针的荧光微球等量混合，即可组成一套液相基因芯片。
探针、引物设计本发明设计探针的基因序列数据取自EMBL(http://www.ebi.ac.uk/)，采用PrimerPrimer5.0软件设计。
本发明设计引物的基因序列取自GENBANK(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，采用Primer Primer5.0软件设计，具体如下HLA-A基因的第二外显子及第三外显子的PCR引物设计的参考序列取自GENBANKAJ278305；HLA-B基因的第二外显子及第三外显子的PCR引物设计的参考序列取自GENBANKAJ309047；HLA-DRB1基因的第二外显子的PCR引物设计的参考序列取自GENBANKAF142465，AJ556173 AF489519。
探针与载体的耦联探针与荧光微球的耦联在0.1mM的MES缓冲液(pH4.5)中进行，以EDC(1-enthyl-[3dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrchloride)作为缩合剂，使探针5’端的氨基与微球表面的羧基共价结合。
待检测基因PCR扩增本发明对三类HLA基因的PCR扩增体系是一样的。反应体积为10～100ul，一般用20～25ul反应体系。而模板DNA的用量取2ul(模板DNA浓度为20～100ng/ul)。Taq酶加量为1U。每种dNTP的浓度为200uM。Mg2+浓度为1.5mM。循环条件为94℃，5分钟。95℃，20秒；60℃，30秒；72℃，15秒；10个循环。95℃，15秒；60℃，15秒；72℃，15秒；30个循环。72℃，10分钟。
通过采用生物素标记的PCR引物，待检标本(基因组DNA)经过PCR扩增的扩增产物带有生物素标记。
杂交生物素标记的PCR产物与悬浮在杂交液中的微球表面共价结合的探针进行杂交，杂交后洗涤，再将反应后的微球与streptavidin修饰的藻红蛋白(SAPE)孵育；杂交阳性的微球，通过探针与生物素标记的待检基因片段的特异性结合，生物素与亲和素streptavidin特异性结合，使得杂交阳性的微球带有藻红蛋白(SAPE)荧光报告分子。
检测及结果判定微球与荧光报告分子streptavidin修饰的藻红蛋白孵育后，把微球重悬于洗涤液中，转移到读数板上，直接用于Luminex仪器读取数据信息。检测时，以两束激光同时照射荧光微球，一束激光确定荧光微球种类，另一束激光测定荧光微球上的标记探针的杂交强度从而给被测物定量。检测读取的原始数据的处理及基因型判断过程，也可以通过计算机软件完成，例如，借助上海复旦张江生物医药股份有限公司登记注册的“基因分型专家软件(HLA-GT)”V1.0版(受理号为2005111554)完成。
样品来源A4008 A4009 A4010 A4011 A4012 A4013共6份样品来源于上海血液中心。
主要试剂及设备普通引物及生物素标记的引物，带有聚乙二醇臂的5‘端氨基修饰的探针均由上海生工生物工程技术服务公司合成；荧光微球(Luminex xMAP CarboxylatedMicrospheres，L100-C101～C200)购于Luminex Corporation公司；检测设备为Luminex检测仪，购于Luminex Corporation公司；Taq酶及其他PCR试剂购于Promega公司，MES购于SIGMA公司，EDC购于Pierce公司，streptavidin修饰的藻红蛋白(SAPE)购于Molecular Probe公司，其它试剂为国产分析纯试剂。
下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等著，《分子克隆实验室手册》(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一、基因组DNA的抽提A4008 A4009 A4010 A4011 A4012 A4013血液样品，用上海生工生物工程技术服务公司的DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，浓度为20～100ng/ul，OD260/280＝1.5～1.8。
实施例二、HLA-A基因第二、三外显子的PCR扩增配制10X缓冲液100mM Tris-HCl，pH9.0，100mM KCl，80mM (NH4)2SO4，0.5％NP-40，20mM MgSO4，0.22um膜过滤。甘油加双蒸水，121℃，15分钟，高压灭菌备用。
配制P Mix溶液引物AE2F1、AE2R2、AE2R1、AE3F1、AE3R1、AE3F2及AE3R2分别加无菌双蒸水溶解成浓度为10uM的溶液。将已配好的引物溶液，按以下比例AE2R2∶AE3R1∶AE2F1∶AE3F1∶AE2R1∶AE3F2∶AE3R2＝2∶2∶1∶1∶0.1∶0.1∶0.1(V/V)混合，混匀。
配制D Mix溶液以无菌双蒸水配制5mM dNTP溶液(含dATP、dTTP、dGTP及dCTP各5mM)。
实施例一所述标本提取的DNA，各取2ul于PCR反应管中，置冰浴。加入10X缓冲液2ul；50％甘油5ul；加入D Mix溶液1ul；加入P Mix溶液2ul加入无菌双蒸水9.7ul；加入Taq酶0.3ul。离心13000rpm，10秒。
PCR反应程序如下94℃，5分钟。95℃，20秒；60℃，30秒；72℃，15秒；10个循环。95℃，15秒；60℃，15秒；72℃，15秒；30个循环。72℃，10分钟。
实施例三、HLA-B基因第二、三外显子的PCR扩增配制P Mix溶液引物BE2F1∶BE2R1∶BE2R2∶BE3F1∶BE3R1分别加无菌双蒸水溶解成浓度为10uM的溶液。将已配好的引物溶液，按以下比例BE2F1∶BE2R1∶BE2R2∶BE3F1∶BE3R1＝1∶2∶0.1∶1.5∶3(V/V)混合，混匀。
实施例一所述标本提取的DNA，按实施例二的方法进行加样及PCR扩增。
实施例四、HLA-DRB1基因第二外显子的PCR扩增配制P Mix.溶液引物DE2F1、DE2F2、DE2F3、DE2R1及DE2R2分别加无菌双蒸水溶解成浓度为10uM的溶液。将已配好的引物溶液，按以下比例DE2F1∶DE2F2∶DE2F3∶DE2R1∶DE2R2＝1∶0.5∶0.5∶2∶0.1(V/V)混合，混匀。
实施例一所述标本提取的DNA，按实施例二的方法进行加样及PCR扩增。
实施例五、HLA-A基因分型基因芯片设计和检测寡核苷酸探针5’端氨基修饰，共65条，其具体序列序列见表1a。第二外显子有34个探针，分别是探针编号PA01～PA33及APC2；第三外显子有31个探针，分别是探针编号PA34～PA362及APC3和ANC。APC2和APC3为阳性对照，分别可指示PCR扩增第二、三外显子的量，另外还可应用于第二、三外显子探针阈值的计算。ANC为阴性对照，可指示PCR扩增及后续杂交反应是否被污染，另外还可应用于第二、三外显子探针阈值的计算。
按实施例五的方法进行探针标记和计数。
实施例二PCR扩增产物取5ul置96孔板一孔中，加入上述65种标记的荧光微球每种5000个，加35ul 1.5 X TMAC杂交液(pH8.0)，总体积50ul。95℃，3分钟。60℃，15分钟。加入80ul洗涤液(50Mm Tris-HCl，pH8.0，0.1％TritonX-100，0.1M NaCl)，混匀，1300g离心5分钟，弃上清。加入50ul SAPE溶液(以1 x TMAC溶液配制，链亲素-藻红蛋白偶联物浓度为4ug/ml)，重悬沉淀，60℃，6分钟。加入80ul洗涤液，混匀，1300g离心5分钟，弃上清。加入80ul洗涤液，重悬沉淀，置Luminex检测仪读数。
用上海复旦张江生物医药股份有限公司登记注册的基因分型软件(HLA-GT)V1.0版判读，该标本的基因型为HLA-A标本号 基因型1 特异性1 基因型2 特异性2A4008 A*11 A11 A*31 A31A4009 A*01 A1 A*02 A2A4010 A*11 A11 A*11 A11A4011 A*11 A11 A*30 A30A4012 A*02 A2 A*30 A30A4013 A*11 A11 A*24 A24SSP方法验证使用美国ONE LAMBDA公司产品的Micro SSPTMHLA试剂盒，按试剂盒说明书操作，分析上述标本，结果相同。
实施例六、HLA-B基因分型基因芯片设计和检测寡核苷酸探针以5’端氨基修饰，共99条，其具体序列序列见表六。第二外显子有51个探针，分别是探针编号PB01～PA50及BPC2；第二外显子有48个探针，分别是探针编号PB51～PB96及PC3和BNC。BPC2和BPC3为阳性对照，分别指示PCR扩增第二、三外显子的数量，另外还可应用于第二、三外显子探针阈值的计算。BNC为阴性对照，可指示PCR扩增及后续杂交反应是否被污染，另外还可应用于第二、三外显子探针阈值的计算。
按实施例五的方法进行探针标记和计数。
实施例三PCR扩增产物取5ul置96孔板一孔中，加入上述99种标记的荧光微球每种5000个，加35ul 1.5 X TMAC杂交液(pH8.0)，总体积50ul。95℃，3分钟。60℃，15分钟。加入80ul洗涤液(50Mm Tris-HCl，pH8.0，0.1％TritonX-100，0.1MNaCl)，混匀，1300g离心5分钟，弃上清。加入50ul SAPE溶液，重悬沉淀，60℃，6分钟。加入80ul洗涤液，混匀，1300g离心5分钟，弃上清。加入80ul洗涤液，重悬沉淀，置Luminex检测仪读数。
用上海复旦张江生物医药股份有限公司登记注册的基因分型软件(HLA-GT)V1.0版判读，该标本的基因型为HLA-B标本号 基因型1 特异性1 基因型2 特异性2A4008 B*40 B60 B*58 B58A4009 B*40 B60 B*57 B57A4010 B*15 B75 B*56 B56A4011 B*13 B13 B*13 B13A4012 B*13 B13 B*46 B46A4013 B*15 B62 B*35 B35SSP方法验证
使用美国ONE LAMBDA公司产品的Micro SSPTM HLA试剂盒，按试剂盒说明书操作，分析上述标本，结果相同。
实施例七、HLA-DRB1基因分型芯片设计和检测寡核苷酸探针以5’端氨基修饰，共92条，其具体序列序列见表七。第二外显子有92个探针，分别是探针编号PD01～PA90及DPC和DNC。DPC为阳性对照，其一可指示PCR扩增第二外显子的量，另外还可应用于第二外显子探针阈值的计算。DNC为阴性对照，其一可指示PCR扩增第二外显子及后续杂交反应是否被污染，另外还可应用于第二外显子探针阈值的计算。
按实施例五的方法进行探针标记和计数。
实施例四PCR扩增产物取5ul置96孔板一孔中，加入上述92种标记的荧光微球每种5000个，加35ul 1.5 X TMAC杂交液(pH8.0)，总体积50ul。95℃，3分钟。60℃，15分钟。加入80ul洗涤液(50Mm Tris-HCl，pH8.0，0.1％ TritonX-100，0.1MNaCl)，混匀，1300g离心5分钟，弃上清。加入50ul SAPE溶液，重悬沉淀，60℃，6分钟。加入80ul洗涤液，混匀，1300g离心5分钟，弃上清。加入80ul洗涤液，重悬沉淀，置Luminex检测仪读数。
检测数据如下用上海复旦张江生物医药股份有限公司登记注册的基因分型软件(HLA-GT)V1.0版判读，该标本的基因型为HLA-DRB1标本号基因型1 特异性1 基因型2 特异性2A4008 DRB1*11 DR11 DRB1*13 DR13A4009 DRB1*07 DR7 DRB1*14 DR14A4010 DRB1*13 DR13 DRB1*13 DR6A4011 DRB1*07 DR7 DRB1*15 DR15A4012 DRB1*04 DR4 DRB1*07 DR7A4013 DRB1*04 DR4 DRB1*08 DR8SSP方法验证使用美国ONE LAMBDA公司产品的Micro SSPTM HLA试剂盒，按试剂盒说明书操作，分析上述标本，结果相同。
权利要求
1.一组用于人白细胞抗原基因分型的探针，其特征在于，探针序列如下第一组HLA-APA01TGAGGTATTTCTTCACATCCGCATCGCCGTGGGCPA02GAGGTATTTCTACACCTCTTCATCGCCGTGGGCPA03CGGTTCGACAGCTGGAGGGGCCGGAGTTACCGAGTGGACCTPA04GCAGGAGAGGCCTGAGTATTGPA05AGGAGGGGCCGGAGTAAGGCCCACTCACAGPA06TATTGGGACCTGCAGACACGGPA07GACACGGAATATGAAGGCCCAPA08GGAATGTGAAGGCCCAGTCACPA09GGCCCACTCACAGACTGACCGPA10TCACAGATTGACCGAGTGGACPA11ACAGACTGACCGAGTGGACCTPA12GAGAGCCTGCGGATCGCGCTPA13ACCGAGCGAACCTGGGGACCPA14CGAGCCAGAGGATGGGGCCCAGTCACAGACPA15TCACAGACTCACCGAGTGGACPA16GACGAGGAGACAGGGAAAGTGPA17AGGTATTTCTACACCTCCGTGATCGCAGTGGGCTACPA18CGGAACACACGGAATCGGATCGCGCTCCGCPA19TGGGACCAGGAGACATTTTTGGCCCAGTCACAGACPA20TTGGGACCGGAACACACGGAPA21AAGGCCCAGTCACAGCGAGTGGACCTGGGPA22CCTGCGGATCGCGCTCCGCTAPA23ACACGGAAAGTGAAGGCTTTCGAGTGGACCTGGGPA24TGGGACCAGGAGACATTTTTCCTGGGGACCCTGCGPA25GCGGTTCGACAGCCGCGCTCCGCTACTAPA26TCATCGCAGTGGGCTGTTCGACAGCGACGCPA27CTACACCTCCGTGTCGGCCCACTCACAGACPA28GGACCGGAACACACGCGAGCGAACCTGGPA29CTGACCGAGAGAACCTGGGGAPA30AGCAGGAGGGTCCGGAGTATTPA31TTTCTACACCTCCGTGTCTTTAGGCCCAGTCACAGAPA32GCCCACTCACAGACTCACCGPA33GGAGACACGGAAAGTGAAGGCPA34CAGCTCAGACCACCAAGCPA35GAGGCGGCCCGTGTGGCGGAPA36CCTACCTGGATGGCACGTGCGPA37CTGGAGGGCCGGTGCGTGGAPA38CTGGAGGGCACGTGCGTGGAPA39CCTGCGCTCTTGGTAGCAGCAGAGAGCTGGAGTGGCTCCPA40GCGGAGCAGCAGAGAGCCTACPA41CAAGTGGGAGACGGCCCATGPA42GGGTCGGACTGGCGCTTCCTPA43TCGCCCTGAAAGAGGACCTGCPA44GAGCAGTTGAGAGCCCGTGGAGTGGCTCPA45GAGCAGTTGAGAGCCTACCTPA46ACATGGCGGCTCAGAAAGTGGACGGGCTCCGCPA47GAGCAGTGGAGAGCCTACCTPA48CGTGGGGTCGGACTTTGGTACCAGCAGGACGCPA49TACCAGCAGGACGCTTACGACPA50GTGCGTGGACGGGCTCCGCAGPA51TACCACCAGTACGCCAGTGGGAGGCGGCCCPA52GGAGCAGTTGAGAGCGCGTGGACGGGCTCCPA53TCAGATCACCCAGCGCAAGTGPA54GGTACCGGCAGGACGAGCACAAGTGGGAGGPA55TCTCACACCATCCAGAGAGCAGTGGAGAGCCPA56GGGTACCGGCAGGACGCCTAPA57CATCGCCCTGAAAGAGGGCGGCTCAGATCACPA58CGGCCCATGAGGCGTGGAGGGCACGTGCPA59ACCTGCGCTCTTGGAGACATGGCAGCTGTGGAGTGGCTCPA60TCTCACACCATCCAGATGATGTATPA61ACCACCAGTACGCCTACTTTGATCACCAAGCGCAAPA62CCCATGTGGCGGAGTTTTTCGTGGAGTGGCTCCGAPC2GCTACTACAACCAGAGCGAGGAPC3GACGGCAAGGATTACATCGCCANC GACGGCAAGCATTACATCG第二组HLA-BPB01TGCAAGGCCAAGGCACAGACTPB02CTGCGCACCGCGCTCCGCTACTACPB03ACTGACCGAGAGAGCCTGCGGPB04CTGCGGATCGCGCTCCGCTACPB05CAGATCTCCAAGACCAACACAPB06ACACAGATCTACAAGGCCCAGGCAPB07ACACAGATCTTCAAGACCAACPB08ACACAGATCTGCAAGACCAACPB09GCCACGAGTCCGAGGAAGGAGPB10AGACTTACCGAGAGAGCCTGCGGPB11CGGACCCTGCTCCGCTACTACPB12GCCGCGAGTCCGAGAGAGGAGPB13CGGAACACACAGATCTCCAAGACCPB14TGGGACCGGGAGACACAGATCPB15ATGAAGGCCTCCGCGCAGACTPB16CGGGAGACACAGATCTCCAAGACCPB17CCGAGGACGGAGCCCCGGGCGPB18GAGGTATTTCCACACCGCCATPB19ACACCGCCATGTCCCTCCTGCGGAACCTGCGPB20CGTGGATAGAGCAGGTTTGGCCCAGGCACAGACPB21AGACCAACACACAGACTGACCPB22ACGACACCCAGTTCGATTCGAGAGAGGAGCCGCPB23CTTCATCGCAGTGGGTTACCGAGAGAGGAGCCGPB24GACGACACCCAGTTCGATTCCGGGAGACACAGATPB25ACGACACCCAGTTCGATACCGAGGATGGCGCCCPB26TGCGGAACCTGCGCGGCTACPB27ACGACACGCAGTTCGAATGCGGATCGCGCTCCPB28ACACAGATCTGCAAGCGGATCGCGCTCCGCPB29GCTTCATTGCAGTGGTTTTTCGGATCGCGCTCCGCPB30CGGAACACACAGATCCGGATCGCGCTCCGCPB31CGGGAGACACAGATCCGGATCGCGCTCCGCPB32GTATTTCCACACCGCCAAGCCTGCGGAACCTGPB33ACGACACCCAGTTCGCAAGGCCCAGGCACAPB34GCCGTGGGTGGAGCAGGAGPB35AGAAGTACAAGCGCCAGGCACPB36CAGATCTCCAAGACCAACATCGCGCTCCGCPB37GACGCCACGAGTCCGATGGCGCCCCGPB38CCGAGGATGGCGCCCCCGGAACACACAGATPB39AGTCCGAGGATGGCGCCCCTGCGGATCGCGCTCPB40GACTTACCGAGAGAACCTGCPB41ATTTCTACACCTCCGTGTTGCGGAACCTGCGCGPB42GTCCGAGAGAGGAGCTTTGACCGGGAGACACAGPB43GCTTCATCTCAGTGGTTTCAAGGCCCAGGCACAPB44ACACCTCCGTGTCCTCATCACCGTGGGACTACAACCAGPB45ACCGGGAGACACAGAATTCCTGCGGAACCTGCGPB46GTCCGAGGAAGGAGCTTATGCGGAACCTGCGCGPB47CCGAGAGAGGAGCTTCCGGAACACACTGGAACCTGCGCGPB48CCGAGAGAGGAGCTTCGGAACACACTGGAACCTGCGCGPB49TTCATCGCAGTGGCCGGAACACACATCTACAACCAGPB50CAGATCTACAAGTTTCCAACACACAGAGCTACAACCAGAGCPB51GGCGAGTGCGTGGAGTGGCTCPB52GTGCGTGGACGGGCTCCGCAPB53CAGAGGATGTCTGGCTGCGACPB54GAGCAGCTGAGAACCTACCTGPB55GGGCATGACCAGTACGCCTACPB56GTGGCGGAGCAGGACAGAGCCTACPB57CGGAGCAGCGGAGAGCCTACCPB58ATCTCCCAGCGCAAGTTGGAGPB59CGCGGGTATGACCAGGACGCCPB60CGCGGGTACCACCAGGACGCCPB61CGCGGGCATAACCAGTTCGCCTACPB62AAGGACACGCTGGAGCGCGCGPB63CGTGAGGCGGAGCAGTGGAGAPB64CTGGAGGGCACGTGCGTGGAGPB65CGGCTGCGACCTGGGGCCGGAPB66GGGCATGACCAGTCCGCCTACGACPB67GGGTCTCACACCCTCCAGAGGATGPB68CGTGAGGCGGAGCAGCTGAGAPB69TGCGTGGAGTCGCTCCGCAGAPB70CGCGGCGGACACGGCGGCTCPB71CAGAGGATGTACGGCTGCGACPB72ACCAGTTAGCCTACGGGACCTGAGCTCCTGPB73GGACCTGAGCTCCTGTTTGTGGAGTGGCTCCGCPB74CGGACACGGCGGCTCTGGGAAGGAGACGCTGPB75CTCCAGAGCATGTACGGGCATAACCAGTACGCCPB76GCGGGCATGACCAGTGACGGACACCGCGGCTCPB77CATGACCAGTCCGCCTTTTCGCAGATACCTGGAGPB78GGGCATAACCAGTACGCCTACPB79CGGAGCAGGACAGAGATAGGAGTCGCTCCGCAGPB80GATGTATGGCTGCGACTGACCAGTCCGCCTAPB81CACACTTGGCAGACGTTAGGAGGGCCTGTGCGTPB82CATCGCCCTGAACGTTTGACCTGCGCTCCTGPB83CACCCTCCAGAGGATGTGAGGGCACGTGCGTGPB84AGCAGCTGAGAGCCTTTTCGCAGACACCTGGAGPB85GAGCAGCTGAGAGCCTACCTGPB86GAGGGCCTGTGCGTGTTTCGCAGACACCTGGAGPB87CCTCCAGAGCATGTACGTTTGCTCAGATCTCCCAGCGPB88GGTCTCACACTTGGCAGAATTCTGCGACCTGGGGCCPB89TCCAGGTGATGTATGGCTGCGPB90CATGACCAGTTCGCCTACGACPB91GCGGACACGGCGGCTGAGCAGCGGAGAGCCPB92ACATCATCCAGAGGATGACCCTGAACGAGGACCPB93GTGAGGCGGAGCAGCGGAGAPB94CTGCGACCTGGGGCTACATCGCCCTGAATCCCGTGTGGCGGAGPB95CAGCTGAGAGCCTACAAAAGGGCCTGTGCGTGGPB96TCCAGAGCATGTACGGCTGCGBPC2ACTACAACCAGAGCGAGGCCGBPC3ATTACATCGCCCTGAACGAGGACBNC CATCGCCGTCAACGAGGAC第三组HLA-DRB1PD01AGCTTAAGTTTGAATGTCATTTCTPD02GAGCAGGTTAAACATGAGTGTCATPD03GTGGCAGGGTAAGTATAAGTGPD04GAAGCAGGATAAGTTTGAGTGPD05GGAGGAGGTTAAGTTTGAGTGPD06ATAACCAGGAGGAGTCCGTGCPD07CAGAAGGACATCCTGGAAGACPD08GCGGTGACGGAGCTTTTCTGCTGCGGAGCACTPD09GAGTACTCTACGTCTGTTTTGGAGCAGAAGCGGGPD10GGGCCCTGGTGGACTTTGTTGTG GAGAGCTTCPD11GGACATCCTGGAAGACGAGCPD12AGTACTCTACGTCTGATTTCGGCCTGATGAGGAGPD13GGAGTACGTGCGCTTTTTGGCCCTGGTGGACAPD14GTGCGGTTACTGGAGAGACACPD15GCCTGATGCTGAGTACTGGAPD16CCTGATGAGGAGTACTTTTCTGGAAGACGAGCGGPD17GACATCCTGGAAGACAAGCGGPD18GGGAGTTCCGGGCTTACCTGGAAGACGAGCGPD19GAGGAGTTCGTGCGCATTCCTGATGAGGAGTACPD20TGATGAGGAGCACTGGAACAGPD21AGATACTTCTATCACCAAGAGGAGPD22GAGGAGAACGTGCGCATTGTGGACAACTACTGCPD23ACTCTACGGGTGAGTGTATTGGGAGTACCGGGCPD24GTTCCTGGACAGATACTATTCTGATGCCGAGTACTPD25CAGAAGGACCTCCTGGAAGACPD26GGAGTACTCTACGTCTGTTTGTGGACAATTACTGCAPD27TGGAGTACTCTACGTCTTTTGCCTG ACGCTGAGTAPD28GGGTGAGTGTTATTTCTTCAATGGPD29CCTGGACAGATACCTTCGACAGCGACCCTGATGCGGAGPD30CTACGTCTGAGTGCCTTCGACAGCGACTGGGTTGTGGAGAGPD31CTACGTCTGAGTGGGAGTTCCGGGCAAGGACCTCCTGGPD32GTACTCTACGTCTGAGTGCGGTACCTGGACPD33GACATCCTGGAGGACAGGCGPD34CTTGGAGTACTCTACGCTTCCATAACCAGGAGPD35CCTGGAGAGATACTTCGAGGAGAACGTGCGCPD36AGGAGAACGTGCGCTCCTGATGCCGAGTACTGPD37GAGGAGTTCGTGCGCTGCTGCGGAGCACTPD38GAAGACGAGCGGGCGGTTGGTGAGAGCTTCPD39GGTTCCTGGACAGATACGCCTAGCGCCGAGTPD40GGAGTACTCTACGGGTGAGTGPD41TCTACGTCTGAGTGTCCCTGGAAGACAGGCGPD42CCTGGAAGACAGGCGACGGGGTTGTGGAGAPD43CTGATGCCGAGTACTGCCTGGAAGACAGGCPD44TGGCAGCCTAAGAGGTCCTGGAAGACAGGCGPD45GAGGAGTCCGTGCGCGGGAGTTCCGGGCPD46GGCCTAGCGCCGATGGAGCAGAGGCGGGPD47GGTTCCTGGACAGATACGAAGGACTTCCTGGAPD48GGAGTACGTGCGCTTCCTGATGAGGAGTACTGPD49GGAGAGATACTTCCATAGTGGACACCTACTGCPD50CAGGAGGAGAACGTGCGCCTGGAAGACGAGCGGPD51TCCTGGAAGACGAGCGGGGGTTGGTGAGAGCPD52CGGCCTAGCGCCGAGCTGGAGCAGAGGCGGPD53CTGGAGCAGGCGCGGGGGGTTGGTGAGAGCPD54TTCTTCAATGGGACGGTTTTTGGACTTCCTGGAAGACPD55GGTGCGGTTCCTGTGAGTACGTGCGCCGACGTGGGGGAPD56GCGGTTCCTGGACAGTTTTTGGCCTGATGCCGAGTPD57GGAGTACGTGCGCATGATGAGGAGTACGAAGGACTTCCTGGAPD58CTTCGACAGCGAGCCGAGTACTGGACTGGAAGACGAGCPD59AGGAGTTCGTGCGCCCTGATGCCGAGAGGGTTGTGGAGAPD60TGGAGTACTCTACGATCGACAGCGACTGGGGCTGTGGAGAGPD61GTACTCTACGTCTGATTTGTGCGGTACCTGGACPD62AGGAGAACGTGCGCTATTCCTGATGCCGAGTACTGPD63TCCTGGACAGATACTATTCTGGAGCAGATTTGTGGACACCTACTGPD64GAGTACTCTACGTCTGTTTTTCTGGAGCAGAGGCGGPD65GTACTCTACGTCTGAGTTGATGAGGAGTACTGGPD66GGCCTGATGCCGAGTTTTTTGGGCCCTGGTGGACAPD67GTACTCTACGGGTGAGTCGCTTCGACAGCGACPD68CTCTACGTCTGAGTGTCTTACCTGGAAGACAGGCPD69CTGATGCCGAGTACTGTTACCTGGAAGACAGGCPD70CTGGACAGATACTTACTTCGACAGCGATAGGACATCCTGGAPD71AGAGGAGTACGTGCGTTCCTGGAAGACAGGCPD72GGTTCCTGGACAGATACATTGAAGGACTTCCTGGAPD73GAGTACTCTACGTCTGATTTTTCTGGAGCAGAAGCGGPD74TTCTTCAATGGGACGGGGACTTCCTGGAAGACPD75CCTGGAGAGATACTTCGGAAGACGAGCGGGCPD76CCTGGACAGATAAGAGCAGAAGCGGGTCACCTACTGCAGPD77GCTTCGACAGCGACTGGCCTGTCGCCGATGGAAGACAGGCGPD78TCTACGTCTGAGTGTCTTTTTCCGCGGTGGACACCTPD79CTGATGCCGAGTACTCTGGAAGACAGGCGGPD80CTAAGAGGGAGTGTGGGAGTACCGGGCAAGACAGGCGPD81GCTTCGACAGCGACTCTGATGCCGAGTGAGCAGAGGCGGGPD82AGCCTAAGAGGGACTTCGACAGCGACTGAGCAGGCGCGGGCPD83CCTGGAGAGATACGAGCAGAGGCGGGGACACCTACTGCPD84CCTGGACAGATACGATGCCGAGTACTAGGTTGGTGAGAGCPD85TGCGGTTCCTGTGAGGAGTACGTGCGTACGTGGGGGAPD86GCAGCCTAAGAGGGATTTGGGGAGTACCGGGCGPD87CTGGACAGATACATTCGACAGCGATCTGGAGCGGAGGCPD88TCGACAGCGACGTAGGGCCCTGGTGGAGGTTGTGGAGAGCPD89CTTCGACAGCGTGGGAGTTCCGGGCAAGGACTTCCTGGPD90TCTACGTCTGAGTTTCGACAGCGACTGAGCAGAAGCGGGDPC GCGCTTCGACAGCGACGTGGGDNC CGCTTCGACTCCGACGTGG
2.一种用于人白细胞抗原基因分型的基因芯片，由载体和与载体交联的探针组成，其特征在于，包含权利要求1所说的三组探针中的一组或其组合。
3.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所说的载体为玻璃片、硅片和膜基质。
4.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所说的载体为含有荧光物质的、直径4～7um的惰性高分子材料制成的微球。
5.如权利要求4所述的基因芯片，其特征在于，所说的载体是经羧基修饰的聚苯乙烯微球。
6.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所说的探针进行5’端修饰，用下式表示X-(5’-探针-3’)其中X＝NH2-(CH2-CH2)n-O-；n为3～6的整数。
7.权利要求4～6任一项所说的基因芯片，其特征在于，一种探针与一种特定荧光的载体微球共价交联，与一组探针交联的荧光微球等量混合，即组成一种基因芯片。
8.一组用于人白细胞抗原基因分型的特异性引物，其特征在于，引物选自下列三组中的一组或其组合第一组HLA-AAE2F1CGCCTCTGYGGGGAGAAGCAAAE2R1GCCCGTCCGTGGGGGATGAAE2R2GGGGATGAGGGGTCSTGACCTGCAE3F1GCCCAGGCGCCTTTACCCGGTTAE3F2GGGAGAGGCCCAGGCGCCTTAE3R1GGGAGGCCAGCCCGGGAGAYCTAAE3R2GTCCCAAWTGTCTCCCCTCCTT第二组HLA-BBE2F1GGGAGGAGCGAGGGGACCSCAGBE2R1CCCGGGCCGGGGTCACTCABE2R2GGGGGATGGGGAGTCGTGACCTBE3F1CCCGGTTTCATTTTCAGTTGAGGCCAABE3R1GGCCATCCCCGSCGACCTATAGGAGAT第三组HLA-DRB1DE2F1CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACGDE2F2CGTTCGTGTCCCCACAGCACGTTDE2F3CGTTCTTGTCCCCCCAGCACGTTDE2R1TCGCCGCTGCACTGTGAAGCTCDE2R2TgCTYACCTCgCCKCTgCAC
9.如权利要求8所述的引物，其特征在于，探针带有生物素标记。
10.一种用于人白细胞抗原基因分型检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所说的基因芯片和/或权利要求8所说的引物。
11.一种人白细胞抗原基因分型的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)标本处理待检样品用常规方法提取基因组DNA，作为PCR扩增模板；(2)多重PCR扩增HLA-A基因的PCR扩增PCR的引物体系为AE2F1∶AE2R2∶AE2R1∶AE3F1∶AE3R1∶AE3F2∶AE3R2＝1∶2∶0.1∶1∶2∶0.1∶0.1，引物AE2F1的浓度为0.1～0.4uM；HLA-B基因的PCR扩增PCR的引物体系为BE2F1∶BE2R1∶BE2R2∶BE3F1∶BE3R1＝1∶2∶0.1∶1.5∶3，引物BE2F1的浓度为0.1～0.4uM；HLA-DRB1基因的PCR扩增PCR的引物体系为DE2F1∶DE2F2∶DE2F3∶DE2R1∶DE2R2＝1∶0.5∶0.5∶2∶0.1，引物DE2F1的浓度为0.1～0.2uM；(3)杂交分别将HLA-A、-B、-DRB1探针与荧光微球体交联组成的基因芯片悬浮于杂交液中；将PCR扩增产物加入含有对应芯片的杂交体系，60℃温育15min.，再将反应后的微球与streptavidin修饰的藻红蛋白(SAPE)孵育；(4)结果判读用Luminex检测仪读取数据信息，用HLA分型软件分析结果。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及人白细胞抗原基因分型的检测方法和试剂。选择人白细胞抗原基因复合体中多态性最丰富的HLA－A、－B、－DRB1三个位点的主要变异区设计、合成一套探针，探针共价连接到荧光微球载体表面，每种不同荧光的微球耦联一种探针，结合不同探针的荧光微球等量混合，组成液相基因芯片。本发明实现了多个基因片段的均衡扩增，探针与目标基因片段杂交在液相环境中进行，相对于传统基因芯片的液－固相杂交，杂交效率更高。另外，杂交过程可在普通96孔板上进行，可方便地使用多通道排枪进行移液操作，整个杂交过程便捷快速，可有效实现高通量基因分型。
文档编号C12Q1/68GK1952170SQ20051003064
公开日2007年4月25日 申请日期2005年10月19日 优先权日2005年10月19日
发明者易进华, 李义良, 方剑武, 臧春霞, 闵伟伟 申请人:上海复旦张江生物医药股份有限公司