对麸质不耐受以及相关病症的治疗的制作方法
【技术领域】
[0001]本文提供用于治疗麸质不耐受以及相关病症（例如，乳糜泻）的组合物、食品和方 法。本文进一步提供包含猪笼草蛋白酶或其衍生物的药物组合物以及使用猪笼草蛋白酶或 其衍生物治疗胃肠道细菌(例如，艰难梭状芽胞杆菌或幽门螺旋杆菌)感染的方法。本文还 提供在氢/氘交换中使用猪笼草蛋白酶或其衍生物的方法。本文进一步提供包含重组猪笼 草蛋白酶I或猪笼草蛋白酶II或同源蛋白质的组合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 在麸质不耐受的个体体内，对含有麸质的小麦、大麦、黑麦以及可能的燕麦的消化 可能会引起异常自体免疫反应，例如，乳糜泻、小麦过敏症和疱疹样皮炎。麸质是富含谷氨 酰胺和脯氨酸的麦谷蛋白分子和醇溶蛋白分子的混合物。大多数具有异常自体免疫反应的 个体表达人白细胞抗原(HLA)DQ2或DQ8分子。自体免疫反应引起小肠粘膜绒毛萎缩的发生， 并伴有隐窝增生和粘膜炎症。乳糜泻的症状可因个体差异而不同并且所述症状可包括疲 劳、慢性腹泻、便秘、营养素吸收不良、体重降低、腹胀、贫血中的一种或多于一种并且大大 提高发展成骨质疏松和肠恶性肿瘤(淋巴瘤和癌）的风险。
[0003] 治疗麸质不耐受通常涉及终生严格的不含麸质的膳食。然而，不含麸质的膳食并 不方便，会受到限制并且麸质很难避免。因此，本领域亟需对麸质不耐受的有效备选治疗方 法。
[0004] 本领域已知多种细菌会导致胃肠道感染。虽然目前对这些感染的治疗大大依赖于 抗生素，但是已发现越来越多的细菌感染对至少一些抗生素具有耐受性。此外，一些细菌种 类形成内生孢子，该内生孢子使得这些细菌种类特别难以根除。诸如胃蛋白酶之类的胃部 蛋白酶通常无法杀死内生孢子，例如，因为无法分解保护内生孢子的蛋白质包被。因此，本 领域亟需有效治疗细菌感染的备选方法。
【发明内容】
[0005] 本发明涉及如下发现:酶猪笼草蛋白酶具有较高的裂解蛋白质和寡肽(包括麸质） 的蛋白水解活性，尤其是在低pH(例如，约2-3)条件下。猪笼草蛋白酶(EC 3.4.23.12)是起 源于植物的天冬氨酸蛋白酶，该天冬氨酸蛋白酶可从多种植物来源中分离或浓缩，所述植 物例如猪笼草（肉食性猪笼草植物，carnivorous pitcher plant，在热带地区通常称为瓶 子草(monkey cups))的瓶状叶分泌物。T〇k0S等人的文章 "Digestive Enzymes Secreted by the Carnivorous Plant Nepenthes macferlanei L·''，Planta(Berl ·) 119，39-46 (1974)。在本领域中目前已发现猪笼草蛋白酶的活性比胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)的活性高 约1000倍，胃蛋白酶是存在于人类胃部的酶，其部分负责将食物蛋白质降解成肽。目前已发 现，猪笼草蛋白酶具有比胃蛋白酶松弛得多的特异性(relaxed specificity)，其高效裂解 除了氨基酸残基6,3，1'，￥，1和1之外的大部分氨基酸残基之后的位点。值得注意的是，猪笼 草蛋白酶裂解氨基酸残基K，R和P之后的位点。通过比较，胃蛋白酶对疏水氨基酸残基F，L和 Μ表现出高效裂解，但是基本不能对氨基酸残基P，Η，K和R之后的位点进行裂解。
[0006] 猪笼草蛋白酶具有两种已知的同种型:猪笼草蛋白酶1(已知其具有两种变体:猪 笼草蛋白酶la和猪笼草蛋白酶lb)和猪笼草蛋白酶II。本领域已发现这两种同种型对氨基 酸P和氨基酸D这两者的裂解亲和性均高于胃蛋白酶对氨基酸P和氨基酸D这两者的裂解亲 和性。出乎意料地是，本领域已发现猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的组合相对于单独的 猪笼草蛋白酶I具有略微不同的裂解亲和性。具体而言，包含猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白 酶II的提取物相对于单独的猪笼草蛋白酶I更加有效地裂解麦胶蛋白的N-末端侧氨基酸Q 之后的位点以及麦胶蛋白的C-末端侧的氨基酸P之后的位点。
[0007] 麸质不耐受以及相关病症和症状(例如，乳糜泻和/或疱疹样皮炎）由患者对小肠 粘膜内的麸质的异常免疫反应引起。一些麸质成分耐受胃肽酶和胰腺肽酶的裂解，所述胃 肽酶和胰腺肽酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶，等等。虽然不受任何理论的限制，本发 明涉及在麸质到达患者的肠道之前由猪笼草蛋白酶将麸质降解成无毒肽，从而降低进入小 肠的毒性麸质蛋白质或肽的水平。因为猪笼草蛋白酶是酸稳定的，所以其与胃部pH具有相 容性并且其消化麸质，从而调节患者的麸质不耐受或相关病症或症状。
[0008] 考虑到猪笼草蛋白酶在低pH条件下具有高活性并且具有宽活性谱，猪笼草蛋白酶 在胃部消化麸质蛋白的过程中尤其有用。麸质降解为无毒肽也被称为麸质的解毒。尽管不 希望受任何理论的限制，本发明发现猪笼草蛋白酶相对于诸如胃蛋白酶之类的胃酶更加有 效地实现将麸质降解为无毒肽，所述麸质由富含脯氨酸和谷氨酰胺的蛋白质构成。
[0009] 本发明进一步涉及诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白 酶及其衍生物在治疗胃肠道细菌感染中的应用。考虑到猪笼草蛋白酶在低pH条件下具有高 活性并且具有宽活性谱，猪笼草蛋白酶在治疗胃肠道的细菌感染方面有用。不受理论限制， 猪笼草蛋白酶被认为比胃酶在破坏细菌细胞壁和内生孢子包被方面更加有效。
[0010] -方面，本发明提供调节患有麸质不耐受的患者体内的麸质不耐受的方法，所述 方法包括将有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其 衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将 猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II 或其衍生物的混合物给药于所述患者。
[0011] 在一种实施方式中，诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白 酶或其衍生物作为食品添加剂施用，这样，猪笼草蛋白酶或其衍生物与含有麸质的食物结 合从而调节或抑制与麸质不耐受相关的病症。猪笼草蛋白酶或其衍生物可单独使用或与上 述食物联合使用。一方面，使用猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，使用猪笼草蛋白酶II或 其衍生物。一方面，使用猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。
[0012] 另一方面，本发明提供调节患者体内由麸质不耐受介导的病症的方法，所述方法 包括将有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生 物给药于所述患者。所述病症包括，例如，乳糜泻、小麦过敏、麸质敏感和/或疱疹样皮炎。一 方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生 物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药 于所述患者。
[0013] 在任何事件中，可在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食物之前将诸如猪笼草蛋白 酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于患者，在食用含有麸质或 怀疑含有麸质的食物的同时将诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶Π 之类的猪笼草蛋 白酶或其衍生物给药于患者，或在食用含有麸质或怀疑含有麸质的食物之后立即将诸如猪 笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋白酶或其衍生物给药于患者。一方面， 将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药 于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药于所述 患者。
[0014] 另一方面，本发明提供用于调节有此需要的患者体内的麸质不耐受或相关病症的 方法，所述相关病症例如乳糜泻、小麦过敏、麸质敏感或疱疹样皮炎，所述方法包括在患者 进食之前用有效量的猪笼草蛋白酶处理含有麸质或怀疑含有麸质的食品。一方面，用有效 量的猪笼草蛋白酶I或其衍生物处理所述食品。一方面，用有效量的猪笼草蛋白酶II或其衍 生物处理所述食品。一方面，用有效量的猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混 合物处理所述食品。
[0015] 另一方面，本发明提供包含诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼 草蛋白酶或其衍生物的食品或组合物。一方面，所述食品或组合物包含猪笼草蛋白酶I或其 衍生物。一方面，所述食品或组合物包含猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，所述食品或 组合物包含猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。
[0016] 另一方面，本发明提供一种用于优化麸质蛋白质在脯氨酸残基处的裂解的组合 物，所述组合物包含重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。一方面，本发明 提供一种用于优化麸质蛋白质在谷氨酰胺残基处的裂解的组合物，所述组合物包含重组猪 笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白酶II的混合物。
[0017] 另一方面，本发明提供包含片段化的麸质的组合物，其中，所述组合物富含在麸质 的脯氨酸残基处裂解麸质产生的麸质片段。一方面，本发明提供包含片段化的麸质的组合 物，其中，所述组合物富含在谷氨酰胺残基处裂解麸质产生的麸质片段。
[0018] 另一方面，本发明提供消化包含麸质的蛋白质的方法，所述方法包括使所述蛋白 质与有效量的猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶11接触。
[0019] 另一方面，本发明提供生成重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的方法，所述猪笼草蛋 白酶例如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II，所述方法包括在所选择的宿主生物体内表 达编码所述猪笼草蛋白酶或其同源物的核酸序列，所述核酸序列已插入适当设计的载体 中，从而获得所述猪笼草蛋白酶或其同源物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I 或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是猪笼草蛋白酶II或其衍生物。一方面，重组猪笼 草蛋白酶是猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II或其衍生物的混合物。
[0020] 另一方面，本发明提供包含重组猪笼草蛋白酶或其衍生物的组合物。一方面，重组 猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶I或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是重组猪笼草 蛋白酶II或其衍生物。一方面，重组猪笼草蛋白酶是重组猪笼草蛋白酶I和重组猪笼草蛋白 酶II或其衍生物的混合物。
[0021] 另一方面，本发明提供预防或治疗患者体内胃肠道的细菌或寄生虫感染的方法， 所述方法包括将治疗有效量的诸如猪笼草蛋白酶I和/或猪笼草蛋白酶II之类的猪笼草蛋 白酶或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I或其衍生物给药于所述患者。 一方面，将猪笼草蛋白酶II或其衍生物给药于所述患者。一方面，将猪笼草蛋白酶I和猪笼 草蛋白酶II或其衍生物的混合物给药于所述患者。
[0022] 本发明的这些方面和其他方面在下文中进一步描述。
【附图说明】
[0023] 图1显示了猪笼草蛋白酶优先在(A)裂解位点的P1或N末端侧和(B)裂解位点的ΡΓ 或C末端侧裂解。根据氨基酸类型对数据进行分组，并且将数据与来自Hamuro等人的文章 "Specificity of immobilized porcine pepsin in H/D exchange compatible conditions"，Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046(2008)中 的胃蛋白酶数据的类似结果进行比较。黑色柱表示猪笼草蛋白酶消化，灰色柱表示胃蛋白 酶消化。裂解％表示相对于一组给定残基的总数量在给定残基处观察到的裂解数量。猪笼 草蛋白酶数据获自六种变性蛋白的消化物，如实施例2中所描述的。
[0024]图2显示了 XRCC4复合肽序列图谱，其根据结构域类型进行排布。所述肽在四种不 同的酶和底物的比例（65:1至520:1，浅灰色/顶部一系列柱)条件下使用胃蛋白酶消化获 得，以及在四种不同的酶和底物的比例(0.0075:1至0.38:1，深灰色/底部一系列柱)条件下 使用猪笼草蛋白酶消化获得。
[0025]图3显示了在猪笼草蛋白酶消化之后获得的肽的平均MASCOT分数，其由C-末端氨 基酸分组。用于每次计算的肽的数目与末端氨基酸有关，所述肽的数目位于柱的上方。肽获 自六种变性蛋白的消化物，如实施例2中所描述的。
[0026] 图4显示了在多种不同的酶和底物的比例（如图例所示)条件下用猪笼草蛋白酶 (A)和胃蛋白酶(B)消化的XRCC4的肽离子色谱图（PIC)。酶消化的PIC通过柱上相同的质量 负载的底物产生。
[0027] 图5显示了在37°C条件下，猪笼草蛋白酶对小麦中的麦胶蛋白消化1分钟、5分钟、 10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、130分钟、360分钟或810分钟之后，使用LC-MS/MS识别的所 有肽的平均长度。分数上的95%的置信度切割(p〈0.05)用于除去假阳性识别。肽长度的相 对标准偏差在插图中显示。
[0028] 图6显不了在37°C条件下，消化1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、130 分钟、360分钟或810分钟之后，由LC-MS/MS识别的肽的数目，根据长度分组。数据如图5所 不。
[0029]图7显示了与图5相同的数据，作为在37°C条件下，消化10分钟、60分钟、120分钟、 360分钟或810分钟之后获得一些长度的概率。
[0030] 图8显示了猪笼草蛋白酶优先在(A)P1或裂解位点的N末端侧以及(Β)ΡΓ或裂解位 点的C-末端侧裂解。每个残基的左侧柱表示由猪笼草蛋白酶提取物消化，中间柱表示由纯 化的猪笼草蛋白酶提取物消化，以及右侧柱表示由重组的猪笼草蛋白酶I消化。裂解％表示 相对于存在的肽总数在给定残基处所观察到的裂解数。猪笼草蛋白酶数据获自麦胶蛋白的 消化物，如实施例9所描述的。
[0031] 图9显示了猪笼草蛋白酶I和猪笼草蛋白酶II的蛋白质序列的比对，所述猪笼草蛋 白酶I来自奇异猪笼草(Nepenthes mirabilis)，小猪笼草(Nepenthes gracilis)，翼状猪 笼草(Nepenthes alata)，玉米(Zea mays)和水稻(Oryza sativa)，所述猪笼草蛋白酶II来 自奇异猪笼草（Nepenthes mirabilis)，小猪笼草（Nepenthes gracilis)，玉米（Zea mays) 和水稻(Oryza sativa)。
[0032] 图10显示了说明不同物种之间的猪笼草蛋白质相关性的系统树。
【具体实施方式】
[0033] I.释义
[0034] 除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常 理解的含义相同的含义。虽然可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的任何方法 和材料来实施或测试本发明，但是本文描述了优选的方法、设备和材料。本文引用的所有科 技出版物和专利出版物的全部内容通过引用并入本文。本文不被解释为承认由于在先发明 而无权优先于上述科技出版物和专利出版物公开的内容。
[0035] 除非另有说明，对本发明公开的内容的实施使用分子生物学(包括重组技术）、微 生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些常规技术在本领域技术人员的范 围内。这些技术例如在下列公开出版物中在文字上进行全面解释。参见，例如，Sambrook and Russell编辑.MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,第三版（2001);系列丛书 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BI0L0GY(F.M.Ausubel等人，编辑（2007));系列丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY(Academic Press , Inc .,Ν.Υ.)；PCR 1:A PRACTICAL APPROACH (M.MacPherson 等人，IRL Press at Oxford University Press(1991));PCR 2:A PRACTICAL APPR0ACH(M.J·MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑（1995)); ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL(Harlow和Lane编辑（1999));CULTURE OF ANIMAL CELLS:A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES I .Freshney第5版（2005)) ;0LIG0NUCLE0TIDE SYNTHESIS(M.J.Gait编辑（1984)) ;Mullis等人，美国专利第4,683,195号；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATI0N(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑（1984)) ;NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (M.L.M.Anderson(1999))TRANSCRIPTION AND TRANSLATI0N(B.D.Hames & S.J.Higgins 编辑（1984));IMM0BILIZED CELLS AND ENZYM