123] mL =毫升
[0124] 禮=毫摩尔
[0125] MS =质谱
[0126] nM =纳摩尔
[0127] pM =皮摩尔
[0128] s.d.=标准偏差
[0129] yCi=微居里
[0130] yg 微克
[0131] yL =微升
[0132] μΜ=微摩尔
[0133] ym =微米
[0134] °C =摄氏度
[0135] 这些单个字母标识在代表氨基酸时具有下列含义：
[0136] A =丙氨酸 [0137] R =精氨酸
[0138] N=天冬酰胺
[0139] D =天冬氨酸
[0140] C =半胱氨酸 [0141] E =谷氨酸 [0142] Q =谷氨酰胺 [0143] G =甘氨酸
[0144] H=组氨酸
[0145] 1 =异亮氨酸
[0146] L =亮氨酸
[0147] K =赖氨酸
[0148] Μ =蛋氨酸
[0149] F =苯丙氨酸 [0150] P =脯氨酸 [0151] S =丝氨酸 [0152] T =苏氨酸
[0153] W=色氨酸
[0154] Y =酪氨酸
[0155] V =缬氨酸
[0156] 实施例1
[0157] 猪笼草蛋白酶提取物的制备
[0158] 化学品
[0159] 来自Burdick和Jackson的HPLC级的水和乙腈，购自VWR。甲酸、Tris、甘氨酸购自 Sigma Aldrich。
[0160] 植物培养
[0161] 莱佛士猪笼草(Nepenthes rafflesiana)、苹果猪笼草(Nepenthes ampularia)、 奇异猪笼草(Nepenthes mirabilis)和海盗猪笼草(Nepenthes globosa)的移植株购自 Keehns Carnivores(http: //www. keehnscarnivores · ca)。这些移植株用木皮、珍珠岩、泥 煤苔和腐殖土栽培（分别为40 %、35 %、10 %、5 % )。生长条件包括每天14小时光照，80 %湿 度和23°C至28°C的温度以及每周浇水两次至三次。在猪笼草的瓶状叶成熟之后，以每个瓶 状叶一只或两只果蝇的条件供养植株，并且一周之后收获瓶状叶液体。对瓶状叶及其分泌 物进行回收持续一周，随后进行第二轮供养和提取。
[0162] 提取物的制备
[0163] 从所有四种植物中收集瓶状叶液体并将其合并。粗瓶状叶液体首先通过0.22μπι的 过滤器进行净化，随后使用Amicon Ultra离心10kDa分子量截留过滤器(均来自Millipore) 使液体浓缩80倍至100倍。在用于消化之前，用100mM甘氨酸HC1 (pH 2.5)酸活化浓缩液持续 3小时，随后在过滤设备中用100mM甘氨酸-HC1 (pH 2.5)洗涤3次，每次洗涤使用10X液体体 积。最后的分离物随后基于瓶状叶液体的原始采样再次稀释至11倍浓度。
[0164] 猪笼草瓶状叶液体提取物的表征
[0165] 浓缩猪笼草植物的液体分泌物并且通过降低pH(pH 2.5)活化消化酶。富集过程的 影响和对流体蛋白质组的活化通过使用蛋白质组学方法来确定。首先，为了确认猪笼草蛋 白酶的存在，由SDS-PAGE分离无活性的浓缩物。带有非常弱的考马斯亮蓝染色的七个连续 凝胶区域由胰蛋白酶消化并且使用标准方法通过nanoLC-MS/MS分析。虽然并不预期这是活 化的流体蛋白质组的完整目录，但是该分析确认了天冬氨酸蛋白酶猪笼草蛋白酶1/11，和 葡聚糖酶，壳多糖酶，羧肽酶和植物来源的过氧化物酶的存在以及适度水平的果蝇和细菌 污染。流体蛋白质组的低复杂性与最近的分析（Hatano N，Hamada T(2012)Proteomic analysis of secreted protein induced by a component of prey in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata.Journal of Proteomics 3;75(15):4844-52(Epub Jun. 15,2012))-致，但是发现猪笼草蛋白酶-I在该分析中分布在宽得多的质量 范围内（40-70kDa)。酸活化的流体随后以类似的方式处理和分析。活化过程降低了总蛋白 质产量并且还看起来简化了组合物。除了猪笼草蛋白酶I之外，仅证实了来自角蛋白和肌动 蛋白的少量污染。这些分析意味着富集的流体的低复杂性，其中，猪笼草蛋白酶是主要成 分。活化的且80倍富集的流体的总蛋白质浓度由BCA分析测量为22ngAiL。该值与描述流体 富集的较早的研究一致。Tokes ZA，e t a 1 ·，Diges t i ve Enzymes Seere ted by Carnivorous Plant Nepenthes-Macferlanei-L.Planta 119(1):39-46(1974)〇
[0166] 实施例2
[0167] 胃蛋白酶和猪笼草蛋白酶提取物的蛋白质消化绘图
[0168] 通过质谱绘制猪笼草蛋白酶的消化图
[0169] 如实施例1制备猪笼草蛋白酶提取物。
[0170]蛋白质的消化使用LEAP HTX-PAL自动进样仪和设计为氢/氘交换(HDX)应用的分 配系统在溶液中进行，并且使用AB Sciex Triple-TOF 5600 QqTOF质谱仪收集数据。使用 Mascot (v2.3)通过MS/MS数据识别肽。简言之，在10°C，将8yL，8μΜ蛋白质(XRCC4，XLF，连接 酶IV-串联BRCT结构域，ΡΝΚ，肌红蛋白或细胞色素 C)与10yL，11倍浓缩的液体混合2分钟。肌 红蛋白和细胞色素 C购自Sigma。在稀释至ΙμΜ底物浓度之后，注射15yL至冷冻反相LC系统中 (4°C)，该系统连接至质谱仪。肽被捕获在5cm，200ym i .d.Onyx C18整体式柱(Phenomenex Inc.)上并且在10分钟内用梯度为3%至40%的乙腈洗脱。选择这些分析中检测到的肽的 MS/MS光谱的多信息依赖性获得物中的CID片段，类似于气相分馏策略。Blonder J，等人， Proteomic investigation of natural killer cell microsomes using gas-phase fractionation by mass spectrometry.Biochimica Et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 1698(1): 87-95(2004)。根据包含所有六个蛋白质序列的小型数据库搜索光 谱。测序结果由人工核实。
[0171] 结果
[0172] 在适于HDX-MS实验的条件下由富集的流体消化一系列蛋白质。浓缩物的消化特异 性在P1和ΡΓ位置(图1)表征，从而支持了与应用于胃蛋白酶的类似研究的比较。Hamuro Y， et al.,Specificity of immobilized porcine pepsin in H/D exchange compatible conditions.Rapid Communications in Mass Spectrometry 22(7):1041-1046(2008)〇在 该实施例中，基于如下假设:在富集的流体中所有测量的蛋白质均为猪笼草蛋白酶（即便明 显存在一些污染蛋白质），酶和底物的比例为1:85。
[0173] 猪笼草蛋白酶数据代表了 1612个残基的评估，虽然这没有对应的胃蛋白酶数据 (13,766个残基)那么广泛，但是蛋白质组中的序列多样性足够高，从而确保了在P1和ΡΓ位 置的水平上的比较。胃蛋白酶的最大特异性看起来位于P1位置。它对于疏水残基F，L和Μ表 现出高效裂解，但是对于Ρ，Η，Κ和Ρ之后的位点的裂解基本被禁止。猪笼草蛋白酶裂解除了 G，S，T，V，I和W之外的大多数残基之后的位点。它不仅支持了预期的胃蛋白酶Ρ1残基之后的 位点的高速裂解，还在胃蛋白酶消化中禁止的残基处也发生高速裂解，尤其是在K，R和P位 点。在ΡΓ位置，胃蛋白酶总体上显示出对疏水残基的倾向性，包括任何带有芳香性的残基。 相反，猪笼草蛋白酶表现出在ΡΓ位置几乎没有选择性，除了可能针对G，P和Η具有选择性。 总体上，猪笼草蛋白酶在Ρ1位置相对于胃蛋白酶显示出显著松弛的特异性，并且提供了非 常高效的迹象。
[0174] 实施例3
[0175]通过胃蛋白酶和猪笼草蛋白酶提取物绘制多结构域蛋白质XRCC4的消化图
[0176] DNA损伤修复中所涉及的络合物的HD交换
[0177] 如实施例1制备猪笼草蛋白酶提取物。
[0178] 含有BRCT的XRCC4(l-200)的母液以及含有BRCT的XRCC4(全长）的母液在缓冲液 (10mM Tris-HCl，pH7.5)中稀释至等摩尔浓度（10μΜ)并且在4°C下孵育最少30分钟以提升 络合作用。样品保持在4°C下直至进行HDX分析。等份样品在20°C下通过加入D 20(25%v/v) 进行氘化持续2分钟。随后以两种方式对等份样品进行消化。在第一消化策略中，蛋白质氘 化作用通过将样品加至冷冻的100mM甘氨酸-HC1 (pH2.5)中进行淬灭，并且淬灭的蛋白质溶 液被注入胃蛋白酶微反应器中。该微反应器安装在注射器阀和C18柱之间的HTX-PAL系统 中。蛋白质消化物捕获在整体式C18毛细柱上并且洗脱至质谱仪中。所有射流元件，包括微 反应器，冷冻在4°C下以在分析时间期间（<15min)最小化氘返回交换。在第二消化策略中， 在10°C下，等量的氘化蛋白质分别被3yL或5yL的11倍浓度的猪笼草液体同时淬灭和消化持 续3min或5min。样品被注入连接至质谱仪的冷冻LC-系统中。
[0179] 重复进行质量位移测量(4次或更多次)并且所述质量位移测量参考对照蛋白质状 态一游离XRCC4(l-200)，游离XRCC4(全长）以及游离LigIV-BRCT。每种肽的平均氘水平使用 Mass Spec Studio测定，Mass Spec Studio是Hydra vl .5重建的。Slysz GW，et al·， Hydra:software for tailored processing of H/D exchange data from MS or tandem MS analyses.Bmc Bioinformatics 10(2009) Ja)如果质量位移中的微小扰动使用来自每 种状态的分析结果的汇集的标准偏差通过了双尾t测试(p〈0.05)那么被认为是显著的；（b) 如果质量位移中的微小扰动通过了分配分析以防止光谱重叠那么被认为是显著的，以及 (C)如果质量位移中的微小扰动超过了基于位移噪音的测量值且假设其正常分配的临界位 移值（±2s.d.)那么被认为是显著的。Bennett MJ,等人，Discovery and Characterization of the Laulimalide-Microtubule Binding Mode by Mass Shift Perturbation Mapping.Chemistry & Biology 17(7):725_734(2010)〇
[0180] 结果
[0181] 为了确定松弛的特异性是否体现为对用于HDX-MS应用的序列绘图中的改进，分析 全长XRCC4,其是含有球状结构域和延长的螺旋状茎以及长的无序C-末端的蛋白质。Hammel Μ,等人，XLF Regulates F i lament Architecture of the XRCC4 . Li gase IV Complex.Structure 18(11):1431_1442(2010);和Junop MS,等人，Crystal structure of the Xrcc4DNA repair protein and implications for end joining.Embo J 19(22): 5962-5970 (2000)。将这些多结构域蛋白质包含在单一消化规程中具有挑战性，具体而言， 在体内，无序区域会导致胃蛋白酶消化不良，因为它们相对缺少疏水残基并且富含脯氨酸 和带电荷的残基 。Dunker AK,et al. Intrinsically disordered protein. Journal of Molecular Graphics & Modelling 19(1):26_59(2001)。对这种蛋白质的胃蛋白酶和猪笼 草蛋白酶绘图在图2中显示。在该比较中，使用各种不同的蛋白酶的量和回归MS/MS实验对 这两种酶进行详尽绘图。相对于胃蛋白酶的187个肽(浅灰色柱），猪笼草蛋白酶提供更好的 全长蛋白质覆盖范围：猪笼草蛋白酶的357个肽(深灰色柱）。（两种酶的11个残基的平均肽 长度相同。）两种酶表现出带有大量重叠肽的球状和茎区域，但是由猪笼草蛋白酶提供的互 补性更加明显。例如，猪笼草蛋白酶在球状结构域(残基1-30)中提供显著更深的β-片区域 的覆盖。无序的C-末端区域也以大得多的程度被覆盖，并且以显著较高的冗余水平覆盖。使 用猪笼草蛋白酶的条件下，该无序尾部区域中的每个残基得到16倍的覆盖，使用胃蛋白酶 仅得到4.7倍的覆盖。
[0182] 肽检测中任何偏差的存在通过选择平均检索分数作为度量标准进行研究（图3)。 该方法强调了作为限定序列绘图的原则方式的序列识别中的置信度。一个柱形概括 (outliner)是R。末端在R的肽的较高的分数可能反映了较高的平均肽强度和较好的片段化 的组合，这与从基于胰蛋白酶的自下而上的蛋白质组学所获知的一致。Warwood S，et al.Guanidination chemistry for qualitative and quantitative proteomics.Rapid Communications in Mass Spectrometry 20(21):3245-3256(2006)〇
[0183] 实施例4
[0184] 不同酶-底物比例的XRCC4的消化
[0185] 更加详细地检测了酶效率。简单地通过改变酶-底物比例可使肽质量绘图发生改 变的程度或可调节的程度在图4中显示。对于溶液中消化而言，猪笼草蛋白酶载荷在50倍的 范围内发生改变。对于胃蛋白酶实验而言，使用浆状物形式的固定的胃蛋白酶，而非游离胃 蛋白酶，以避免大量胃蛋白酶自溶。酶载荷在8倍范围内发生改变，较低的量产生不良肽强 度，较高的量对绘图没有影响。已发现猪笼草蛋白酶产生非常低的自溶曲线，甚至在较高的 载荷条件下也产生非常低的自溶曲线。聚集肽离子色谱（PIC)用作有效消化的测量。在 〇.38:1(猪笼草蛋白酶:底物)与520:1(胃蛋白酶:底物)条件下相对类似的分布的比较代表 了在HDX-样应用中猪笼草蛋白酶相对于胃蛋白酶的效率显著提高了 1400倍。
[0186] 猪笼草蛋白酶消化物可通过改变酶载荷更加容易地从大片段调节至小片段，由此 产生可变的XRCC4表示。这通过图4A中在PIC中从低载荷条件下的长滞留时间转变至高载荷 条件下的短滞留时间来说明。这种转变与最丰富的肽的平均肽长度从低酶载荷条件下的大 于12转变至高酶载荷条件下的10相关。相反，改变胃蛋白酶载荷并未显著改变PIC或平均肽 长度（图4B)。强迫流动胃蛋白酶微反应器可改善调节，但不太可能产生较小的片段。
[0187] 实施例5
[0188] 通过猪笼草蛋白酶提取物消化麦胶蛋白
[0189]通过猪笼草蛋白酶消化麦胶蛋白使用LEAP HTX-PAL自动进样器和设计用于氢/氘 交换(HDX)应用的分配系统在溶液中执行。使用AB Sciex Triple-TOF 5600QqT0F质谱仪采 集数据。使用MasC〇t(v2.3)从MS/MS数据中识别肽。简言之，将12pmol粗麦胶蛋白（购自 Sigma Aldrich)与2yL实施例1生成的100倍浓缩的提取物混合。消化之后，将整体量注入与 质谱仪连接的反相LC系统。在7cm，150ym i.d.Magic C18柱上捕获肽并且在10分钟或30分 钟内用从10%至40%梯度的乙腈洗脱。选择在这些分析中所检测到的肽的MS/MS图谱的多 信息依赖性获得物的CID片段。在含有所有识别的小麦麦胶蛋白（α，β，γ，ω )蛋白质以及低 分子量和高分子量麦谷蛋白的序列的微小数据库中进行光谱检索。图5显示了 37°C下，对来 自小麦的麦胶蛋白进行猪笼草蛋白酶消化1分钟，5分钟，10分钟，15分钟，30分钟，60分钟， 130分钟，360分钟或810分钟之后，使用LC-MS/MS所识别的所有肽的平均长度。分数上