乙酸转化提高的甘油和乙酸转化酵母细胞的制作方法
【专利说明】乙酸转化提高的甘油和乙酸转化酵母细胞 发明领域
[0001] 本发明涉及在微生物如酵母中的代谢工程。具体而言，本发明涉及乙酸转化提高 的甘油和乙酸转化酵母细胞。本发明还涉及其中所述酵母细胞生成发酵产物如乙醇的方 法。
[0002] 发明背景
[0003] 第二代生物乙醇由例如水解成游离单体糖如己糖和戊糖以发酵成乙醇的植物生 物质的木质纤维素级分生产。除生物质预处理和水解期间的糖释放外，还形成一些有毒副 产物。例如，糠醛和HMF就是这些产物中的两种。它们形成的量取决于几个预处理参数，如温 度、压力和预处理时间。木质纤维素水解产物也含有大量的乙酸，乙酸是微生物如酵母发酵 能力的强抑制剂。
[0004] 甘油是糖发酵成乙醇期间的主要副产物，其主要由于重氧化反应消耗在厌氧条件 下的生物合成期间形成的过量NADH而形成（van Dijken和Scheffers，1986)。因此，在工业 发酵期间，酵母细胞消耗的约5至10%的糖被转为甘油。降低这种多元醇的量被认为是增加 乙醇产量的有前景的途径。这可以通过调节分批补料过程中的进料速率，或通过选择生成 更少甘油的菌株而实现。
[0005] 然而，在文献中，已经报道几种不同的方法，它们可以帮助减少乙酸对水解产物中 糖发酵的抑制作用，以及通过缺失甘油生成中涉及的基因（例如通过酵母的遗传工程）（部 分)解决氧化还原平衡问题。
[0006] Sonderegger等（2004)公开了在发酵木糖的Saccharomyces cerevisiae菌株中磷 酸转乙酰酶和乙醛脱氢酶的异源表达。结合天然磷酸酮酶，Sonderegger等由此生成了功能 磷酸酮酶途径，其能够净重氧化通过用于该特定菌株中的木糖利用的木糖还原酶和木糖醇 脱氢酶的异源表达所产生的NADH。
[0007] Guadalupe等（2009)描述了一种Saccharomyces cerevisiae菌株，其中通过破坏 内源性NAD依赖型甘油3-磷酸脱氢酶基因（GPD1和GPD2)而消除副产物甘油的生成。编码乙 酰化NAD依赖型乙醛脱氢酶的E. col i mhpF基因的表达通过为培养基补充乙酸恢复了 gpdlgpd2双缺失菌株厌氧生长的能力。
[0008] Yu等(2010)构建了经代谢工程化以通过甘油脱氢酶（由GCY1编码）、二羟基丙酮激 酶（DAK1)和甘油摄取蛋白（GUP1)的同时过表达提高由甘油生成乙醇的Saccharomyces cerevisiae菌株。在同一团队的后来报告中（Yu等，2011)，描述到分别编码醇脱氢酶和丙酮 酸脱羧酶的ADH1和roci的额外过表达引起在发酵条件下的生长速率和甘油消耗增加，导致 最终乙醇产量略有增加。
[0009] Lee和Dasilva(2006)公开了经工程化以通过引入Escherichia coli mgs和gldA 基因的表达等由甘油生成1，2_丙二醇的酵母Saccharomyces cerevisiae。
[0010] Guadelupe等（并且还在专利申请W0 2011/010923中）描述的技术提供了用于在生 物质糖发酵和前述乙酸发酵成例如乙醇期间降低水解产物的乙酸含量的方法。
[0011]通过引入额外的NADH生成途径，例如通过另外(过)表达甘油消耗途径，进一步增 强转化乙酸的能力是有潜在可能性的。在表达厌氧乙酸转化途径的酵母菌株(例如Medina 等，2009所描述）中引入前述⑶P1-、GCY1-和DAK1-基因（Yu等，2010)后，乙酸转化应增加以 维持氧化还原平衡，导致水解产物的去毒进一步增加且乙醇产量更高。然而Yu等的解决方 案不起作用，因为酵母甘油脱氢酶（由GCY1编码)使用NADP+作为辅因子，由于辅因子再生不 足而导致辅因子不平衡。替代性甘油脱氢酶(来自于E.coli的gldA)结合乙酸还原途径一起 被测试并且的确提高了在厌氧生长(发酵)条件下乙酸的转化(专利申请W02013/081456)。
[0012] 发明概述
[0013] 因此，本发明的一个目的是提供能够由乙酸或乙酸盐/酯(acetate)生成乙醇并同 时保持其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等）以及戊糖如木糖的能力的酵母，以及其中使用 这些菌株生成乙醇和/或其它发酵产物的方法。一个目的是提供能够由甘油和/或甘油和乙 酸生成乙醇并同时保持其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等）以及戊糖如木糖的能力的细 胞，例如酵母细胞。另一个目的是增加发酵产物的生成(产量、生产速率(production rate) 或两者）。
[0014] -个或多个目的根据提供经遗传修饰的酵母细胞的本发明实现，所述酵母细胞包 含：
[0015] a)编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C. 1.2.1.10)的一个或多个核苷酸 序列；
[0016 ] b)编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E. C. 6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列；
[0017] c)编码异源甘油脱氢酶(E.C. 1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和
[0018] d)编码同源或异源二羟基丙酮激酶(E. C. 2.7.1.28或E. C. 2.7.1.29)的一个或多 个核苷酸序列。
[0019] 在一个实施方案中，所述细胞具有编码甘油3-磷酸磷酸水解酶和/或编码甘油3-磷酸脱氢酶基因的一个或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏。
[0020] 以上一个或多个目的根据本发明实现。
[0021] 从实施例明显看出，根据本发明可以实现提高的发酵产物生产（乙醇）。
【附图说明】
[0022] 图1.甘油和乙酸（乙酸盐/酯)转化成乙醇所涉及的酶促反应的示意图。乙酸盐/酯 首先通过酵母酶Acs(Acsl和/或Acs2,分别由基因 ACS1和ACS2编码)转化成乙酰-CoA。然后 乙酰-CoA通过mhpF基因转化成乙醛，或通过来自于E. col i的双功能adhE酶(或催化相同转 化的类似酶)直接转化成乙醇。引入甘油消耗途径之后，转化外部添加的甘油，产生额外的 NADH流。GPD1和GPD2基因的缺失是任选的，以避免细胞内生成甘油和NADH被这些酶利用。
[0023] 由于甘油生成的消除、从培养基中（并且一直存在于木质纤维素水解产物中）的乙 酸盐/酯/乙酸和外部添加到培养基(或水解产物）中的甘油的乙醇产生，每所消耗糖(葡萄 糖和/或其它糖）的乙醇产量增加。
[0024]图2.菌株构建方法的示意图展示。使用PCR扩增INT(整合)侧翼和表达盒(CAS)(包 括选择标记)并转移到酵母中。将在接头之间（在图1中分别指定为5、a、b、c和3)进行重组， 导致所述途径整合在酵母基因组中的期望位置(在这种情况下为INT1)。目标基因的数量可 扩大，如实施例中所述。使用独特的接头以促进独立表达盒的重组并整合到受体细胞的基 因组中。
[0025]图3.筛选结果。根据残留的乙酸盐/酯浓度绘制残留的乙酸浓度。
[0026]图4.根据残留的乙酸盐/酯浓度绘制残留的乙酸浓度。基于残留的乙酸盐/酯和甘 油浓度以及由甘油和乙酸盐/酯的乙醇产生，用暗灰色显示150个表现最佳的菌株。
[0027] 图5.新产生的转化株(R1-R8)和参考菌株(RN1069、RN1189和YD01247)的再筛选结 果。每次转化挑选8个独立转化株。同样，以8倍接种参考菌株。在上图中，描绘了孵育72小时 后残留的乙酸（乙酸盐/酯)浓度。在下图中，绘制了残留的甘油浓度。
[0028] 图6.筛选结果。总共筛选2592个菌株，包括参考菌株RN1189。参考菌株RN1189被包 括27次。在下图中描绘了参考菌株RN1189相对于其它菌株(总共2592个）的性能。如前所述 为菌株评级，其中表现最佳的菌株用较浅的颜色表示(并且更靠近图的左下角）。表现较不 好的菌株用较深的颜色表示;颜色变化是渐进的。参考菌株RN1189例外，其用最深的颜色表 7Jn 〇
[0029]图7.筛选结果。这里;^出了表现最佳的前五个菌株：1)表;^YD01247,2)是 YD01248,3)是YD01249,4)是YD01250。菌株5既未命名也未进一步试验。
[0030] 序列表简述
[0031 ] SEQ ID NO: ladhE Escherichia coli双功能乙醛-CoA/醇脱氢酶（蛋白质）；
[0032] SEQ ID N0:2acdH Lactobacillus plantarum乙酸脱氢酶（蛋白质）；
[0033] SEQ ID N0:3eutE Escherichia coli乙醇胺利用蛋白（蛋白质）；
[0034] SEQ ID N0:4Linll29Listeria innocua酸脱氢酶（蛋白质）；
[0035] SEQ ID N0:5adhE Staphylococcus aureus双功能乙酸-CoA/醇脱氢酶（蛋白质）；
[0036] SEQ ID N0:6ACS2Saccharomyces cerevisiae乙酰-CoA连接酶（蛋白质）；
[0037] SEQ ID N0:7gldA Escherichia coli甘油脱氣酶（蛋白质）；
[0038] SEQ ID N0:8gldA Klebsiella pneumoniae甘油脱氢酶（蛋白质）；
[0039] SEQ ID N0:9gldA Enterococcus aerogenes甘油脱氣酶（蛋白质）；
[0040] SEQ ID NO: lOgldA Yersinia aldovae甘油脱氣酶（蛋白质）；
[0041 ] SEQ ID NO: llDAKISaccharomyces cerevisiae二羟基丙酮激酶（蛋白质）；
[0042] SEQ ID NO: 12dhaK Klebsiella pneumoniae二羟基丙酮激酶（蛋白质）；
[0043] SEQ ID NO: 13DAKlYarrowia lipolytica二羟基丙酮激酶（蛋白质）；
[0044] SEQ ID NO: 14DAKlSchizosaccharomyces pombe二羟基丙酮激酶（蛋白质）；
[0045] SEQ ID NO: 15含TDH3-启动子的片段；
[0046] SEQ ID NO: 16含TDH1-启动子的片段；
[0047] SEQ ID奶：17含?61(1-终止子的片段；
[0048] SEQ ID奶：18含卩61(1-启动子的片段；
[0049] SEQ ID奶：19含卩1^3-启动子的片段；
[0050] SEQ ID N0:20含PGI1-终止子的片段；
[0051 ] SEQ ID N0:21 含EN01-启动子的片段；
[0052] SEQ ID N0:22含ACT1-启动子的片段；
[0053] SEQ ID N0:23含CYC1-终止子的片段；
[0054] SEQ ID N0:24含TPI1-启动子的片段；
[0055] SEQ ID从)：25含八了67-启动子的片段；
[0056] SEQ ID N0:26含EN01-终止子的片段；
[0057] SEQ ID N0:27kanMX标记和侧翼区的序列；
[0058] SEQIDN0:28基因破坏盒GPDl::hphMX的序列；
[0059] SEQIDN0:29基因破坏盒GPD2::natMX的序列；
[0060] SEQ ID NO:30正向引物5'INTI片段（INT5-f);
[0061] SEQ ID NO:31 反向引物5'INTI片段（INT5-r);
[0062] SEQ ID N0:32正向引物表达盒l(con5-f);
[0063] SEQ ID NO :33反向引物表达盒 1(conA-r);
[0064] SEQ ID从)：34正向引物标记（。〇1^矸）；
[0065] SEQ ID 从)：35反向引物标记（(：〇1^1);
[0066] SEQ ID NO:36正向引物表达盒2(conB-f);
[0067] SEQ ID NO:37反向引物表达盒2(conC-r);
[0068] SEQ ID NO:38正向引物表达盒3(conC-f);
[0069] SEQ ID NO:39反向引物表达盒3(conD-r);
[0070] SEQ ID NO :40正向引物表达盒4(conD-f);
[0071] SEQ ID N0:41 反向引物表达盒4(con3-r);
[0072] SEQ ID NO:42正向引物3'INTI片段（INT3-f);
[0073] SEQ ID NO:43反向引物3'INTI片段（INT3-r);
[0074] SEQ ID 勵:44质粒口5厶131311的序列；
[0075] SEQ ID 从):45质粒口80*11的序列；
[0076] SEQ ID 从):46质粒口001*11的序列；
[0077] SEQ ID 从):47质粒口031*11的序列；
[0078] SEQ ID N0:48含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的adhE(E.coli)DNA 序列的序列；
[0079] SEQ ID N0:49含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的acdH (L.plantarum)DNA 序列的序列；
[0080] SEQ ID N0:50含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的eutE(E.coli)DNA 序列的序列；
[0081 ] SEQ ID N0:51含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的Linll29 (L. innocua)DNA序列的序列；
[0082] SEQ ID N0:52含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的adhE(S.aureus) DNA序列的序列；
[0083] SEQ ID N0:53含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的ACS2 (S. cerevisiae)DNA 序列的序列；
[0084] SEQ ID N0:54含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的gldA(E.coli)DNA 序列的序列；
[0085] SEQ ID N0:55含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的gldA (Κ· pneumoniae) DNA序列的序列；
[0086] SEQ ID N0:56含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的gldA (E.aerogenes)DNA 序列的序列；
[0087] SEQ ID NO:57含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的gldA(Y.aldovae) DNA序列的序列；
[0088] SEQ ID N0:58含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的DAK1 (S. cerevisiae)DNA 序列的序列；
[0089] SEQ ID N0:59含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的dhaK (Κ· pneumoniae) DNA序列的序列；
[0090] SEQ ID N0:60含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的DAK1 (Υ· lipolytica)DNA序列的序列；
[0091] SEQ ID N0:61含有经密码子对优化以在S.cerevisiae中表达的DAKl(S.pombe) DNA序列的序列；
[0092] 发明详述
[0093] Saccharomyces cerevisiae在厌氧条件下由糖如葡萄糖生成乙醇。这个过程是氧 化还原中性的。然而在酵母生长时，产生过剩的NADH。为了恢复氧化还原平衡，酵母将生成 甘油。在这个过程期间，NADH再次转化为NAD+。乙醇工业将甘油视为不期望的副产物。去除 厌氧条件下的甘油形成是乙醇工业长期以来的期望。如上所述，几个不同的团队已经做出 若干尝试以使碳通量从甘油形成重定向到乙醇，从而增加乙醇产率。
[0094] 防止甘油形成最直接的方法会是缺失编码参与甘油生物合成的蛋白质的基因。然 而，当GPD1和GPD2基因被破坏时，酵母不能在厌氧条件下生长，因其不能恢复其氧化还原平 衡。16虹11 &等(2〇〇9)证明在引入祖〇!1依赖型乙酰-(：(^脱氢酶基因0耶.(3〇1丨1111^?-基因，如 Medina等所述)后，如果向发酵培养基中供给乙酸，则gpdlgpd2双缺失菌株在厌氧条件下生 长的能力恢复。乙酸通过ACS 1 /ACS2基因产物转化为乙酰-CoA。乙酰-CoA通过mhpF和ADH1基 因产物转化为乙醛并随后转化为乙醇(Medina等，2009)。这样，消除了不希望的副产物(甘 油）的形成，产生更高的乙醇产率。
[0095]因为乙酸常常被视为水解产物中（尤其是?財妾近或低于乙酸?1^(?1^说(3~4.76) 的水解产物中）存在的毒性最强的化合物，所以期望进一步降低水解产物中的乙酸盐/酯 (乙酸)浓度。增加酵母的乙酸盐/酯厌氧转化潜力的一种方式是通过引入甘油转化途径。通 过引入转化外部添加的甘油的甘油途径，由于gpdlgpd2细胞本身不生成甘油，所以产生甚 至更多NADH，迫使酵母细胞转化更多的乙酸以便维持氧化还原平衡（参见图1和W02013/ 081456)〇
[0096]甘油在生物提炼中可足够大量地获得。为了这个目的，使来自于E. coli的基因 gldA和来自于S.cerevisiae的DAK1过表达，以允许有毒乙酸向乙醇的转化进一步增加 (TO 2013/081456)。的确，获得了更高的乙醇产量。
[0097] 为了在速率和量上更进一步提高甘油和乙酸两者的厌氧(共)转化，试验了替代的 基因组合。对于所述途径中的多个酶，即甘油脱氢酶、二羟基丙酮激酶和乙醛脱氢酶，试验 了可以进一步增强酵母菌株在厌氧条件下除戊糖和己糖之外也将甘油和乙酸转化成乙醇 的能力的多个替代基因。
[0098] 因此，本发明提供了经遗传修饰的酵母细胞，其包含：
[0099] a)编码NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C. 1.2.1.10)的一个或多个核苷酸序列；
[0100] b)编码乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列；
[0101 ] c)编码甘油脱氢酶(E.C. 1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和
[0102] d)编码二羟基丙酮激酶(E. C. 2.7.1.28或E. C. 2.7.1.29)的一个或多个核苷酸序 列。
[0103] 下面描述了本发明的一些实施方案。下列项描述了本发明的几个实施方案，其中 详述了以上特征a)到d)等等：
[0104] 第1 项：
[0105] 经遗传修饰的细胞，其包含：
[0106] a)编码NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C. 1.2.1.10)的一个或多个核苷酸序列；
[0107] b)编码乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列；
[0108] C)编码甘油脱氢酶(E.C. 1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和
[0109] d)编码二羟基丙酮激酶(E. C. 2.7.1.28或E. C. 2.7.1.29)的一个或多个核苷酸序 列。
[0110] 第 la 项：
[0111] 经遗传修饰的细胞，其包含：
[0112] a)编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C. 1.2.1.10)的一个或多个核苷酸 序列；
[0113] b)编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E. C. 6.2.1.1)的一个或多个核苷酸序列；
[0114] c)编码异源甘油脱氢酶(E.C. 1.1.1.6)的一个或多个核苷酸序列;和
[0115] d)编码同源或异源二羟基丙酮激酶(E. C. 2.7.1.28或E. C. 2.7.1.29)的一个或多 个核苷酸序列。
[0116] 第2项·
[0117]根据第1项所述的细胞，其包含编码甘油3-磷酸磷酸水解酶(GPP1、GPP2)和/或编 码甘油3-磷酸脱氢酶基因(GH)1、GPD2)的一个或多个内源核苷酸序列的缺失或破坏；
[0118]第3项·
[0119]根据第1项或第2项所述的细胞，其中
[0120] b)是编码SEQ ID N0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQ ID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:6功能同源物的一个或多个异源核苷酸序 列；
[0121 ]第4项.根据第3项所述的细胞，其中