>[0122] C)是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0 :7具 有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和/或
[0123] 编码SEQIDN0:9表示的异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0:9具有至 少60%序列同一性的SEQ ID N0:9功能同源物的一个或多个核苷酸序列；
[0124] 第5项.根据第4项所述的细胞，其中
[0125] C)是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0 :7具 有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列。
[0126] 第6项.根据第1-5项中任一项所述的细胞，其中
[0127] d)是编码SEQ ID N0:11表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID NO: 11具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 11功能同源物的 一个或多个核苷酸序列，和/或
[0128] 编码SEQ ID N0: 13表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7. 1.28或 E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID N0:13具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:13功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。
[0129] 第7项.根据第6项所述的细胞，其中
[0130] d)是编码SEQ ID N0:13表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID NO: 13具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 13功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。
[0131] 第8项.根据第1-7项中任一项所述的细胞，其中
[0132] a)是编码SEQ ID N0:1表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQ ID N0: 1具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 1功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和/或
[0133] 编码SEQ ID N0:2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQ ID N0: 2具 有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 2功能同源物的一个或多个核苷酸序列，和/或
[0134] 编码SEQ ID N0:3表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQ ID N0: 3具 有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:3功能同源物的一个或多个核苷酸序列。
[0135] 第9项.根据第8项所述的细胞，其中
[0136] a)是编码SEQ ID N0:1表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10) 或与SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 1功能同源物的一个或多个核苷 酸序列;和/或
[0137] 编码SEQ ID N0:2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶江.(：.1.2.1.10)或与 SEQ ID N0: 2具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0: 2功能同源物的一个或多个核苷酸序 列。
[0138] 第10项.根据第9项所述的细胞，其中
[0139] a)是编码SEQ ID N0: 2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶或与SEQ ID N0: 2具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:2功能同源物的一个或多个核苷酸序列。
[0140] 第11项.根据第1-10项中任一项所述的细胞，其中
[0141] a)是编码SEQ ID N0:3表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10) 或与SEQ ID N0:3具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:3功能同源物的一个或多个核苷 酸序列；
[0142] b)是编码SEQ ID N0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQ ID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列；
[0143] C)是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)或与SEQIDN0 :7具 有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和
[0144] d)是编码SEQ ID N0:11表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID NO: 11具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 11功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。
[0145] 第12项.根据第1-10项中任一项所述的细胞，其中
[0146] a)是编码SEQ ID N0:2表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10) 或与SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:2功能同源物的一个或多个核苷 酸序列；
[0147] b)是编码SEQ ID N0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQ ID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列；
[0148] c)是编码SEQIDN0:9表示的异源甘油3-磷酸脱氢酶(E.C.1.1.1.8)或与SEQID N0:9具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:9功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和
[0149] d)是编码SEQ ID N0:11表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID NO: 11具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 11功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。
[0150]第13项.根据第1-10项中任一项所述的细胞，其中a)是编码SEQ ID N0:2表示的异 源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)或与SEQIDN0:2具有至少60%序列同一 性的SEQ ID N0:2功能同源物的一个或多个核苷酸序列；
[0151] b)是编码SEQ ID N0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQ ID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列；
[0152] C)是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油3-磷酸脱氢酶(E.C.1.1.1.8)或与SEQID N0:7具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和
[0153] d)是编码SEQ ID N0:13表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID NO: 13具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 13功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。
[0154] 第14项.根据第1-10项中任一项所述的细胞，其中
[0155] a)是编码SEQ ID N0:1表示的异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10) 或与SEQ ID NO: 1具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 1功能同源物的一个或多个核苷 酸序列；
[0156] b)是编码SEQ ID N0:6表示的同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)或与SEQ ID N0:6具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:6功能同源物的一个或多个核苷酸序列；
[0157] C)是编码SEQIDN0:7表示的异源甘油3-磷酸脱氢酶(E.C.1.1.1.8)或与SEQID N0:7具有至少60%序列同一性的SEQ ID N0:7功能同源物的一个或多个核苷酸序列；和
[0158] d)是编码SEQ ID N0:13表示的同源或异源二羟基丙酮激酶（E.C.2.7.1.28S E.C.2.7.1.29)或与SEQ ID NO: 13具有至少60%序列同一性的SEQ ID NO: 13功能同源物的 一个或多个核苷酸序列。
[0159] 可通过修饰宿主细胞而制备根据本发明所述的细胞，例如引入多核苷酸和/或表 达蛋白质，例如对应以上特征a)到d)的核苷酸。
[0160] 多核苷酸或蛋白质可对于宿主细胞的基因组为同源或异源的。术语"异源"，就宿 主细胞而言，意指多核苷酸并非自然出现在宿主细胞的基因组中或多肽并非由该细胞自然 产生。"同源"，就宿主细胞而言，意指多核苷酸自然出现在宿主细胞的基因组中或多肽由该 细胞自然产生。同源蛋白质表达可以是例如在不同启动子的控制下表达或过表达。异源蛋 白质表达涉及并非在宿主细胞中自然产生的蛋白质的表达。
[0161] 图1中说明了根据本发明所述的细胞。图1给出了参与将甘油和乙酸（乙酸盐/酯） 转化成乙醇的酶促反应的示意图。乙酸盐/酯首先通过酵母酶AcsUcsl和/或Acs2,分别由 基因4031和六032编码)转化成乙酰-(：(^。然后乙酰-(：(^通过1111^^基因转化成乙醛，或通过来 自于E.coli的双功能adhE酶(或催化相同转化的类似酶)直接转化成乙醇。引入甘油消耗途 径之后，转化外部添加的甘油，产生额外的NADH流。如图1和第2项中所示，GPD1和GPD2基因 可被缺失以避免细胞内生成甘油和NADH被这些酶利用。
[0162] 由于甘油生成的消除，从培养基中（并且一直存在于木质纤维素水解产物中）的乙 酸盐/酯/乙酸和外部添加到培养基(或水解产物）中的甘油产生乙醇，每消耗糖(葡萄糖或 其它糖）的乙醇产量增加。
[0163] 本说明书和所附权利要求全篇中，词语"包含"和"包括"及变型如"含有"将包括性 地解释。即，这些词旨在表达情况允许时，可能包括未具体指出的其它要素或整体。不使用 数量词修饰时在本文中用于指一个或多于一个（即一个或至少一个)对象。举例而言，"要 素"可意为一个要素或多于一个的要素。
[0164] "功能"多肽"在本文中也称为"多肽"功能""或"多肽"，功能多肽多聚核苷酸"在 本文中是编码"功能"多肽的多核苷酸。本发明还涉及编码此类多肽的多核苷酸，包含编码 多肽的多核苷酸的核酸构建体及用于异源多肽在(酵母)细胞中功能性表达的载体，所述表 达载体包含与在细胞中具功能性的启动子可操作性连接的异源核酸序列并且所述异源核 酸序列编码在所述细胞(的细胞溶质）中具有"功能"酶活性的多肽。本文的"功能"多肽可具 有除"功能"活性外的一种或多种替代和/或附加活性。
[0165] 本文提到的E.C.代码仅用于阐明"功能"，但不应以任何方式视为对"功能"的限 制。
[0166] 本文中编码酶的任何外源基因均包含编码与任何SEQ ID Ν0:Χ具有至少50%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，其中 SEQ ID Ν0:Χ是本申请的序列表中的任何蛋白质序列。尤其对于全部SEQ ID N0:1-14。编码 酶的外源基因还可包含编码与任何SEQ ID Ν0:Χ的氨基酸序列相比具有一个或几个替换、 插入和/或缺失的氨基酸序列的核苷酸序列。尤其对于全部SEQ ID N0:1-14。优选地，氨基 酸序列与SEQ ID Ν0:Χ相比具有不超过420、380、300、250、200、150、100、75、50、40、30、20、 10、9、8、7、6、5、4、3、2或l个氨基酸替换、插入和/或缺失。尤其对于全部SEQIDN0 :l-14。
[0167] 本文中编码酶的任何外源基因均包含与任何SEQ ID NO: Y具有至少40%、50%、 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%、 99%或100%核苷酸(DNA)序列同一性的核苷酸序列，其中SEQ ID NO: Y是本申请的序列表 中的任何核苷酸(DNA)序列。尤其对于SEQ ID NO:48-61全部而言。
[0168] 现将在以下更详细地描述第1项的特征a)到d)。
[0169] 特征a)编码NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶的一个或多个核苷酸序列:
[0170]本发明的细胞包含编码能够将乙酰CoA还原成乙醛的酶的外源基因，该基因赋予 细胞将乙酰CoA (和/或乙酸)转化成乙醇的能力。能够将乙酰CoA还原成乙醛的酶在本文中 被理解为催化以下反应的双功能酶(adhE):
[0171]乙醛+NADH〇 乙醇-fN AD (1)
[0172]和/或
[0173] NAD++辅酶 A+乙醛〇NADH+乙酰-CoA (2)
[0174] 因此，该酶催化乙醛转化成乙醇（并且反之亦然）并且也称为乙醛脱氢酶(NAD+依 赖型）。该酶是进一步催化辅酶A和乙醛转化成乙酰- C〇A(并且反之亦然）的双功能酶，也命 名为乙醛脱氢酶。当由生长培养基中存在的乙酸盐/酯生成乙酰-辅酶A时，这种酶允许NADH 再氧化，并且因此对于氧化还原辅因子平衡而言不再需要甘油合成。编码NADH依赖型乙酰 化乙醛脱氢酶(E.C. 1.2.1.10)的核酸序列原则上可来源于包含编码所述脱氢酶的核酸序 列的任何生物。
[0175] 可以催化乙酰-辅酶A向乙醛的NADH依赖性还原的已知NAD+依赖型乙酰化乙醛脱 氢酶可一般地分成三类NADH依赖型乙酰化乙醛脱氢酶功能同源物：
[0176] 1)催化乙酰-辅酶A向乙醛的可逆转化以及随后乙醛向乙醇的可逆转化的双功能 蛋白质。这类蛋白质的一个实例为E. col i中的AdhE蛋白（基因库编号:NP-415757)。AdhE似 乎是基因融合的进化产物。AdhE蛋白的NH2-末端区域与醛:NADH氧化还原酶高度同源，而 C00H-末端区域与Fe2+-依赖型乙醇:NADH氧化还原酶家族同源(Membrillo-Hernandez等， (2000)11101.0^111.275:33869-33875)^.(3011 AdhE经受金属催化的氧化并因此对氧敏 感（Tamarit等（1998)J.Biol.Chem.273:3027-32)。
[0177] 2)在严格或兼性厌氧微生物中催化乙酰-辅酶A向乙醛的可逆转化但不具有醇脱 氢酶活性的蛋白质。这类蛋白质的一个实例在Clostridium kluyveri中已有报道(Smith等 (1980) Arch.Biochem.Biophys.203:663_675)。乙酰化乙酸脱氢酶在Clostridium kluyveri DSM 555的基因组中已有注解（基因库编号：EDK33116)。在Lactobacillus plantarum的基因组中鉴定出同源蛋白AcdH(基因库编号:NP-784141)。这类蛋白质的另一 实例是Clostridium beijerinckii NRRL B593中的所述基因产物（Toth等（1999) Appl · Environ .Microbiol · 65:4973-4980，基因库编号：AAD31841) 〇
[0178] 3)作为参与4-羟基-2-酮戊酸酯/盐分解代谢的双功能醛缩酶-脱氢酶复合物的一 部分的蛋白质。此类双功能酶催化儿茶酚间位切割途径的最后两步，儿茶酚是许多细菌物 种中酚、甲苯酸盐/酯、萘、联苯和其它芳香族化合物降解期间的中间产物(Powlowski和 Shingler(1994)Biodegradation 5,219-236)。4_羟基-2-酮戊酸酯/盐首先被4-羟基-2-酮 戊酸醛缩酶转化为丙酮酸盐/酯和乙醛，随后乙醛被乙酰化乙醛脱氢酶转化为乙酰-CoA。这 类乙酰化乙醛脱氢酶的一个实例为Pseudomonas sp CF600中的DmpF蛋白（基因库编号： CAA43226) (Shingler等（1992) J. Bacteriol · 174:711-24) qE. coli MphF蛋白（Ferrandez等 (1997)J.Bacteriol · 179:2573-2581，基因库编号：NP-414885)与Pseudomonas sp·CF600中 的DmpF蛋白同源。
[0179] 尤其是在选自以下的生物中可以找到适合的核酸序列：Escherichia，尤其是 E. coli ;Mycobacterium，尤其是Mycobacterium marinum、Mycobacterium ulcerans、 Mycobacterium tuberculosis; Carboxy do thermus，尤其是Carboxy do thermus hy dr ogeno forman s ; Entamoeba，尤其是Entamoeba histolytica; Shigella，尤其是 Shigella sonnei ;Burkholderia，尤其是Burkholderia pseudomallei ;Klebsiella，尤其 是Klebsiella pneumoniae ;Azotobacter，尤其是Azotobacter uinelandii ;Azoarcus sp; Cupriauidus，尤其是Cupriauidus taiwanensis ; Pseudomonas，尤其是Pseudomonas sp · CF600;Pelomaculum，尤其是Pelotomaculum thermopropionicum。优选地，编码NADH依 赖型乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列来源于Escherichia，更优选地来自E. col i。
[0180] 特别适合的是来自于E. coli的mhpF基因或其功能同源物。这个基因在Ferrandez 等（1997) J.Bacteriol. 179:2573-2581中有描述。已经用S.cerevisiae获得好结果，其中已 经并入来自于E.coli的mhpF基因。
[0181]在另一有利实施方案中，编码（乙酰化）乙醛脱氢酶的核酸序列来自于，尤其是来 自于Pseudomonas sp · CF600的Pseudomonas dmpF〇
[0182] 原则上，编码NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶的核酸序列可为野生型核酸序列。优 选的核酸序列编码W02011010923中用SEQ ID N0:2、SEQ ID ^):29表示的嫩0+依赖型乙酰 化乙醛脱氢酶或W02011010923中SEQIDN0:2或SEQIDN0 :29的功能同源物。特别地，该核 酸序列包含根据W02011010923中的SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:28的序列或W02011010923中 SEQIDN0:1或SEQIDN0:28的功能同源物。
[0183] 进一步地，乙酰化乙醛脱氢酶（或编码此类活性的核酸序列）可例如选自E . col i adhEnEntamoeba histolytica adh2、Staphylococcus aureus adhE、Piromyces sp.E2adhE、Clostridium kluyveri EDK33116、Lactobaci1lus plantarum acdH和 Pseudomonas putida YP 001268189的组。对于这些酶的序列、编码这些酶的核酸序列和将 核酸序列整合入宿主细胞的方法，参考W0 20091013159,尤其是实施例3、表1(第26页)和其 中提到的序列ID编号，该公开中表1和所述表中提到的序列ID编号表示的序列通过引用并 入本文。
[0184]还应理解，在一个优选实施方案中，细胞具有允许被提供了乙醛脱氢酶活性的细 胞完成乙酰-CoA向乙醇的转化的内源醇脱氢酶活性。还进一步优选，宿主细胞具有允许被 提供了乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酸(经由乙酰-CoA)向乙醇的转化的内源乙酰-CoA合 成酶。
[0185] 编码具有乙醛脱氢酶活性的酶的外源基因优选包含编码与SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:5,优选SEQ ID N0:1 至SEQ ID N0:3,更优选SEQ ID N0:1 或SEQ ID N0:2中的任一个具 有至少 40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99% 氨基酸序列同 一性的氨基酸序列的核苷酸序列。编码具有乙醛脱氢酶活性的酶的外源基因也可包含编码 与SEQIDN0:1至SEQIDN0:5，优选SEQIDN0:1至SEQIDN0:3，更优选SEQIDN0:1或 SEQ ID N0:2中的任一个的氨基酸序列相比具有一个或几个替换、插入和/或缺失的氨基酸 序列的核苷酸序列。优选地，该氨基酸序列分别与SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:5相比，优选地 分别与SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 3相比，更优选地分别与SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2相 比，具有不超过420、380、300、250、200、150、100、75、50、40、30、20、10或5个氨基酸替换、插 入和/或