专利名称：一种多功能穿梭表达载体及其构建方法
技术领域：
本发明涉及一种多功能穿梭表达载体及其构建方法，特别是一种适用于产甘油假丝酵母的穿梭载体。
背景技术：
产甘油假丝酵母是野生型的甘油高产菌株。与酿酒酵母相比，它具有生长速度和发酵速度快，耐高渗透压，甘油产率高，转化率和耗糖转化率世界领先等较多优势(王正祥，诸葛健.耐高渗压高压甘油的一个假丝酵母新种产甘油假丝酵母[J].微生物学报.1999,39(001) :68-74)。应用于基因工程技术中的宿主细胞具有较大前景。另一方面， 在大规模生产生物柴油过程中会产生较多的副产物甘油，在一定程度上削弱了发酵法生产甘油的优势，以甘油为原材料或底物生产高附加值的生物产品越来越受到重视，那么以产甘油假丝酵母作为宿主通过代谢工程构建基因工程菌株生产高附加值生物产品具有潜在的前景。但是该菌株的遗传知识和分子生物学信息远远落后于酿酒酵母等模式菌株。该菌株有很多独有的性质，其他酵母适用的载体大多不能在该酵母中使用。如对潮霉素、G418等真菌抗生素具有很强的抗性，不能使用这些抗生素作为遗传工程技术中的筛选标记。遗传转化体系的缺乏已经严重限制了该工业菌株的研究和应用，所以构建适用于该酵母的表达载体迫在眉睫。2008年，本实验室陈献忠(Chen X，Fang H, Rao Ζ, Shen W, Zhuge B，Wang Z and Zhuge J. (2008)An efficient genetic transformation method for glycerol producer Candida glycerinogenes. Microbiol. Res. 163 :531-553)描述了电转化是该菌株的比较合适的转化方法，并且构建了以kocin为筛选标记的整合载体。2010年沈微(Shen W, Wang ZX, Rao ZM, Zhuge J and Zhuge B. (2010)A genetic transformation system based on trpl complementation in C. glycerinogenes. World J. Microbiol. Biotechnol. 27 :1005-1008)构建了基于Trpl互补的以18s rDNA为整合位点的整合载体， 使用的也是^ocin筛选标记。抗药性是最方便的筛选标记，使用药物筛选酵母转化子比使用其他的方法如营养缺陷型，都要简单易行。但是产甘油假丝酵母对潮霉素、G418、放线菌酮等药物的抗性较强，不能使用这些作为筛选酵母转化子的筛选条件。kocin可以用于筛选酵母转化子，但是其价格昂贵，大大限制了对该优良菌株的深入研究。把铜抗性筛选标记应用于产甘油假丝酵母这一工业菌株不仅操作简单，而且大大降低了科研和工业生产成本。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供一种多功能穿梭表达载体，能大大降低生产和科研成本。所述表达载体，以pGAP^为骨架，含有URA3整合位点、多克隆位点、CUPl铜抗性蹄选标记表达盒。所述URA3整合位点5’端有HindIILHpaI酶切位点，能将铜抗性筛选标记表达盒
3插入其中。所述多克隆位点包括Asp718I、KpnI、PmlI、&icII、SfiI、XhoI。所述铜抗性筛选标记表达盒包括上游GAP启动子及下游AOXl终止子。所述URA3序列如SEQ ID NO. 1所示。所述铜抗性筛选标记序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种构建多筛选标记表达载体的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案包括如下步骤1)克隆产甘油假丝酵母的URA3序列到pGAPZB，构建表达载体pGAPZU ；2)克隆酿酒酵母的CUPl序列到pGAPZB，构建载体pGAPZC ；3)以pGAPZC质粒DNA为模板，设计引物扩增酵母筛选标记表达盒，将酵母筛选标记表达盒克隆到pGAPZU的URA3序列5’端HindIILHpaI酶切位点之间，获得pGUGCA穿梭载体。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产甘油假丝酵母的多筛选标记穿梭载体的应用方法。所述的表达载体URA3序列内部有多个单酶切位点，可使用SspI、BstXI等单酶切线性化转化酵母感受态细胞。所述的表达载体能够在大肠杆菌和产甘油假丝酵母中复制，能够应用于构建产甘油假丝酵母表达体系。所述的表达载体能够应用于克隆目的基因，在大肠杆菌中使用低浓度kocin为筛选标记，在酵母中使用铜筛选标记。所述的表达载体应用于整合表达，能实现目的基因在产甘油假丝酵母中稳定复制和表达。本发明提供的表达载体适用于产甘油假丝酵母，能稳定复制、表达，此外还适用于在大肠杆菌中扩增。对于产甘油假丝酵母来说，使用^ocin作为筛选标记的成本为7 元 /L，而使用CuSO4 ·5Η20作为筛选标记的成本仅为1. 1元/L，与之前在酵母中使用kocin为筛选标记相比大大降低了成本，此外本专利克服了大多数抗生素在产甘油假丝酵母无法使用的缺陷。
图1穿梭载体pGUGGA物理图谱。图2转化酵母细胞中绿色荧光蛋白的检测。
具体实施例方式本发明所用PCR相关试剂，限制性内切酶，CIAP购自TaKaRa公司。质粒小量提取试剂盒和胶回收试剂盒购买自博大泰克。质粒PGAP^购自^witrogen公司，所用分子生物学方法都均按照分子克隆进行操作。实施例1 pT-URA3的构建根据产甘油假丝酵母URA3基因序列(GenBank序列号为No. AY623794)，使用 DNAMAN设计引物URA3U1和URA3R1。为了利于将PCR片段连接到质粒pGAP^上，在上游引物URA3U1的5'端添加BglII酶切位点。下游引物URA3R1的5'端含有BglII酶切位点， 所以不用额外添加BglII酶切位点。上游引物URA3U15' -GAAGATCTGTTCCGCGTATTCTAAGTG-3 ‘，下游引物URA3R15' -GCTTTGGTGGTTTGGTTACCGTGAGG-3 ‘，下划线“_”表示引入的酶切位点。PCR程序为95°C预变性 5min ；94°C变性 50s，55°C退火 2min，72°C延伸 lmin，30 个循环；72°C再延伸IOmin。产物回收后，与T载体连接，转化感受态JM109，使用100ug/mL的 LB平板筛选阳性转化子。提取质粒，验证得质粒构建正确。实施例2 pGAPZU的构建将上述获得的pT-URA3使用BglII进行酶切，于一个500ul的离心管中进行，酶切体系为质粒DNA30ul，10XbufferH 5ul，BglIMul，用水补足50ul。然后放于37°C水浴锅中，酶切证。PGAP^质粒DNA使用同样的酶同样的方法进行酶切。pGAP^质粒酶切产物放于65°C水浴锅中处理半小时，使BglII酶失活，加入CIAP 3ul,CIAP buffer 6ul，然后将离心管放于37°C水浴锅中处理一小时进行去磷酸化，防止酶切片段自连。按8 1的比例往待纯化体系中加入结合缓冲液，充分混勻，混勻后，将溶液加入离心吸附柱中，再将吸附柱套入废液收集管中，8000r/min离心30s。(反应体系不足50 μ 1的，用水补足50 μ 1后再加结合缓冲液)。倒回柱子再离心30s，去废液。在吸附柱内加入500 μ 1漂洗液，SOOOr/ min离心lmin，洗去杂质，重复漂洗一次。倒弃收集管内液体，8000r/min离心2min，除去残留液体。将质粒纯化柱放在一干净的1. 5ml离心管中，加入35μ 1洗脱缓冲液至管内柱面上，放置5min。8000r/min离心lmin，取出吸附柱，样品4°C保存。取已灭菌的500μ1离心管一支，用记号笔标上组号，依次加入DNA片段1 μ 1，质粒酶切片段7 μ 1，T4DNA Iigase 1 μ 1，10XT4DNAligase bufferl μ 1混勻。将上述溶液于16°C水浴过夜。转化大肠杆菌， 在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取转化子，PCR和酶切验证得出质粒构建正确。实施例3穿梭载体pGAP^C的构建根据NCBI上所查到得酿酒酵母W303-1A中CUPl基因序列(GenBank序列号为 No. 856450)设计引物。所用引物为CUPF 1CCGGAATTCATCTGTTGTACTATCCGCTTCUPRl :ATTTCCGCCGCTATACGTGCATATGTTC为了利于克隆，分别在CUPFl、CUPRl中添加了 EcoRI和NotI限制性酶切位点。以酿酒酵母染色体DNA为模板，以⑶PF1、CUPRl为引物进行PCR扩增。PCR 反应程序95°C预变性 5min。94°C变性 50s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 30个循环。72°C再延伸lOmin。将上述获得的PCR片段使用EcoRI和NotI进行酶切，克隆到pGAP^构建质粒 pGAP^C，转化大肠杆菌，在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取转化子。酶切验证得出质粒构建正确。实施例4穿梭载体pGUGCA的构建根据pGAPZBC质粒序列设计引物GAPUl和A0XR1，为了利于将PCR片段连接到质粒 pGAPZU上，在上游引物GAPUl的5'端添加HpaI酶切位点。在下游引物A0XR1的5'端添加HindIII酶切位点。
GAPUl 5' -GGGTTAACGGATCTCAAGAAGATCCTTTG-3‘AOXRl 5' -CCCAAGCTTGTGGTACGGCGATGCGCGG-3‘，下划线“_”表示引入的酶切位点。PCR程序为95°C预变性 5min ；94°C变性 50s，55°C退火 2min，72°C延伸 lmin，30 个循环；72 °C再延伸IOmin。将上述获得的PCR片段通过HpaI和HindIII进行酶切，克隆到pGAPZU构建质粒 pGUGCA(图1)，在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取转化子。酶切验证得出质粒
构建正确。实施例5载体pGUGCA的酵母转化子铜抗性结果穿梭载体pGUGCA经BstX I酶切线性化后，电转化至产甘油假丝酵母中，使用 150ug/ml的hoc in平板筛选阳性转化子。任意挑取产甘油假丝酵母WL2002-5电转化获得的20株kocin抗性酵母转化子， 接种于新鲜的YEPD培养基中培养过夜，收集菌体后在无菌水中饥饿处理2h，以野生型产甘油假丝酵母作为对照，然后划线于含17 22mmol/l Cu2+的YEPD平板上，30°C培养3天。 结果显示野生型产甘油假丝酵母的铜离子最低抑制浓度为18mmol/L，而产甘油假丝酵母转化子的铜离子最低抑制浓度为21mmol/L。铜抗性可以作为基因工程技术中的筛选标记。
实施例6使用pGUGCA载体表达绿色荧光蛋白将GFP编码序列插入pGUGCA载体的多克隆位点，然后电转化至产甘油假丝酵母中，使用铜离子筛选阳性转化子。具体实验如下根据pCAMBIA1302质粒中GFP编码基因(GenBank序列号为No. AAF65344. 1)设计两个引物GFPUl和GFPR1。为了利于将PCR片段连接到质粒pGUGGC上，在上游引物GFPUl 的5'端添加Kpn I位点。在下游引物GFPRl的5'端添加Β ο I酶切位点。GFPUl 5' -CGGGGTACCATGGTAGATCTGACTAG-3‘，GFPRl 5' -CCGCTCGAGCCCGATCTAGTAACATAG-3‘，下划线“_”表示引入的酶切位点。PCR 反应程序为95°C预变性 5min ；94°C变性 50s，57°C退火 2min，72°C延伸 lmin， 30个循环；72 °C再延伸IOmin。将上述获得的PCR片段使用Kpn I和Bio I进行酶切，克隆到pGUGCA以验证表达载体的功能，在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取大肠杆菌转化子。酶切验证得出质粒构建正确。将上述构建的载体使用BstX I单酶切线性化后，电转化至产甘油假丝酵母细胞中，使用21mmol/l的Cu2+筛选产甘油假丝酵母转化子。将获得的阳性转化子使用荧光显微镜观察，可以观察到绿色荧光(图2)。实施例7使用pGUGCA表达目的基因的酵母转化子的稳定性将产甘油假丝酵母转化子在含有21mmol/lCU2+的YEPD选择性培养基中培养过夜后，按照10_3的稀释度接种于不含Cu2+的YEPD非选择性培养基中，30°C培养1 后，将菌液适当稀释涂布于非选择性培养基中，3天后，将平板复制到选择性平板中培养。经计数得具有铜抗性的酵母转化子为96%。所计数的总酵母菌落在300个以上。这说明酵母转化子较稳定。
实施例8载体pGUGCA在酿酒酵母、皱褶假丝酵母中的应用将GFP编码序列插入pGUGCA载体的多克隆位点，线性化后电转化至酿酒酵母、皱褶假丝酵母中，使用铜离子筛选阳性转化子。荧光显微镜观察发现了绿色荧光。
权利要求
1.一种多功能穿梭表达载体，其特征是以PGAP^为骨架，含有多克隆位点、产甘油假丝酵母的URA3序列及铜抗性筛选标记表达盒。
2.权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述多克隆位点包括ASp718I、KpnI、RiilI、 SacII、SfiI、XhoI0
3.权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述铜抗性筛选标记表达盒包括上游GAP 启动子及下游AOXl终止子。
4.权利要求1-3任一所述的表达载体，其特征在于所述URA3序列如SEQIDNO. 1所示。
5.权利要求1-3任一所述的表达载体，其特征在于所述铜抗性筛选标记表达盒如SEQ ID NO. 2 所示。
6.权利要求1所述表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤1)克隆产甘油假丝酵母的URA3序列到pGAPZB，构建表达载体pGAPZU；2)克隆酿酒酵母的CUPl序列到pGAPZB，构建载体pGAPZC；3)以pGAPZC质粒DNA为模板，设计引物扩增铜抗性筛选标记表达盒，将酵母筛选标记表达盒克隆到PGAPZU的URA3序列一端，获得pGUGCA穿梭载体。
7.权利要求6所述的表达载体构建方法，其特征在于URA3序列的5’端存在两个酶切位点HindIII、HpaI，能将铜抗性筛选标记表达盒插入其中。
8.权利要求1所述的表达载体应用于克隆目的基因，其特征在于在大肠杆菌中使用低浓度^ocin为筛选标记，在酵母中使用铜筛选标记。
9.权利要求1所述的表达载体应用于整合表达，其特征在于使用载体URA3序列内部的单酶切位点^pI、BstXI等酶切线性化，提高转化效率。
10.权利要求1所述的表达载体应用于整合表达，其特征在于该载体不仅能应用于产甘油假丝酵母，还能应用于酿酒酵母、皱褶假丝酵母等酵母属。
全文摘要
本发明公开了一种多功能穿梭表达载体及其构建方法，属于遗传工程领域。本发明构建的载体pGUGCA以pGAPZB为骨架，以产甘油假丝酵母URA3序列为整合位点，以低浓度Zeocin为大肠杆菌中的筛选标记，以铜离子为酵母筛选标记。本专利获得的穿梭载体pGUGCA可以在大肠杆菌中复制，在产甘油假丝酵母中复制和表达。该载体实现了在大肠杆菌中使用低浓度Zeocin为筛选标记，在酵母中使用铜筛选标记，大大降低了生产和科研成本，同时介导目的基因在产甘油假丝酵母这一优良宿主中进行稳定表达。该发明为对潮霉素、G418等真菌抗生素都有很强抗性的产甘油假丝酵母提供了方便易得又廉价的转化体系，同时该载体又能应用于酿酒酵母、皱褶假丝酵母等酵母属。为酵母的遗传改造提供了有力工具。
文档编号C12N15/65GK102286521SQ201110200440
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者方慧英, 诸葛健, 诸葛斌, 高晓娜 申请人:江南大学