专利名称：一种酪氨酸酶抑制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于抑制剂及其制备领域，特别涉及一种酪氨酸酶抑制剂及其制备方法。
背景技术：
酪氨酸酶(EC1. 14. 18. 1)是一类含铜金属酶，广泛存在于细菌，真菌，裸子植物， 被子植物，哺乳动物等生物中，并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。在人体内，是参与黑色素合成的关键酶。抑制其活力即可抑制黑色素的生成，因此，寻找有效且对人体无不良反应的多肽酪氨酸酶抑制剂已成为医药和化妆品行业研究发展趋势。果蔬在采收、储存和加工过程中发生的褐变主要是酪氨酸酶作用的结果。从酪氨酸酶抑制角度研发果蔬保鲜技术是一种可取的方法。酪氨酸酶在形成色素，伤口愈合及寄生虫包裹和表皮硬化等方面均具有举足轻重的功能，因此，酪氨酸酶有可能作为害虫控制中的一个作用靶标，多肽酪氨酸酶抑制剂极有可能成为理想的环境友好的生物杀虫剂。目前，传统的酪氨酸酶抑制剂往往采用化学性物质，如过氧化氢，氯化氨基汞以及各种酚类衍生物。这些化合物能使黑色素组织迅速瓦解，但因其腐蚀性，细胞毒性和过敏性、细胞毒性和过敏性等因素，具有极大的危险性，在许多国家的卫生规范中已被禁用。所以，具有生物相容性的蛋白质、多肽类抑制剂已得到普遍关注。噬菌体表面展示技术作为一种新工具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质-蛋白质的相互作用及蛋白质-DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面的研究。直接将基因型和表型，分子结合活性与噬菌体的可扩增性联系在一起，通过配体的特异性亲和力，将所需的多肽筛选出来。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种酪氨酸酶抑制剂及其制备方法，该方法操作简单，耗时较少，纯化倍数和酶活性较高，筛选得到的抑制剂抑制效果较好，并且属于人体内源性物质，具有较好的生物相容性，较低的细胞毒性。本发明的一种酪氨酸酶抑制剂，其特征在于酪氨酸酶抑制剂的序列为 I1e-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。本发明的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，包括(1)将酪氨酸酶溶液置于微孔板内孵育过夜，倒出包被液，加入封阻液，然后用 TBS缓冲液清洗微孔板，加入10 μ 1 Μ13噬菌体室温下摇动30 60min，再用TBS缓冲液清洗微孔板板，加入含有酪氨酸酶的洗脱缓冲液进行竞争性洗脱10 35min，得洗脱物；(2)取上述一部分洗脱物进行滴度测试，将另外一部分的洗脱物加入到ER2738培养物中，37°C下摇动30 60min ；取菌液，离心，沉淀重悬于培养基中，摇动12-1 ；取菌液，再次离心，取上清；加入PEG/NaCl混合液，混勻并置于冰上，4°C下离心，取上清后用TBS 重悬，离心，取上清，即得单克隆扩增出的噬菌体；(3)用TBS缓冲液稀释的酪氨酸酶溶液包被微孔板，倒出包被液，加入封阻液，然后加入上述单克隆扩增出的噬菌体，分别稀释，加入300 μ 1抗M13生物素，温育Ih后洗涤， 加入300 μ 1辣根过氧化氢酶，温育后加入显色液，暗处显色30 40min，加入终止液，筛选出结合力最强的单克隆扩增出的噬菌体进行DNA测序，得最强结合序列，合成该序列，即得酪氨酸酶抑制剂。所述步骤(1)中的酪氨酸酶溶液浓度为100μ g/ml。所述步骤(1)中的封阻液组成为0. IM的NaHCO3, 5mg/ml的BSA和0. 02wt %的
NaN3O所述步骤(1)中的TBS缓冲液为0. 05M IM的Tris,0. 15M的NaCl、pH 7. 5 8. 0的Tris-HCl缓冲液。所述步骤O)中的ER2738以1 100稀释后接种于20ml LB/Tet培养基中培养 3-3. 5h后所得。所述步骤(2)中的PEG/NaCl混合液由质量体积百分比为20%的PEG-8000和2. 5M 的NaCl组成，加入PEG/NaCl溶液的体积为菌液体积的1/6 1/4。所述步骤O)中的最强结合序列为IIe-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。所述步骤(3)中的终止液为2M的硫酸。有益效果(1)本发明抑制效果较好，对于酪氨酸酶单酚酶，二酚酶均表现出来较强的抑制作用。由于其本身是小肽类化合物，属于人体内源性物质，因此具有比黄酮类，曲酸，熊果苷等常规抑制剂更低的细胞毒性。更适合于在美白化妆品，果蔬保鲜，生物杀虫剂等方面的应用；(2)本发明的制备方法操作简单，耗时较少，纯化倍数和酶活性较高。
图1为以L-DOPA(多巴)为底物，所测得不同抑制剂浓度下，溶液吸光度的变化；图2为以L-Tyrosine (酪氨酸)为底物，所测得不同抑制剂浓度下，溶液吸光度的变化；图3为以L-DOPA(SE)为底物，所测得的抑制率一抑制剂浓度的关系图；图4为以L-Tyrosine (酪氨酸)为底物，所测得的抑制率一抑制剂浓度的关系图及延滞时间一抑制剂浓度的关系图。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1以酪氨酸酶分子为靶向分子，筛选大量对其具有不同亲和力的噬菌体，具体步骤如下(1)将100 μ g/ml酪氨酸酶溶液置于微孔板内4°C孵育过夜，倾倒掉该包被液，并用封阻液进行封阻，然后用TBS缓冲液洗板6次，接着加入10 μ 1噬菌体室温摇动40min，再用TBS缓冲液洗板6次后，加入100 μ 1洗脱缓冲液进行竞争性洗脱35min ；(2)将洗脱下来的噬菌体转移到离心管内，4°C保存，可取1 μ 1进行滴度测试。其余用于噬菌体扩增。对筛选到的亲和性噬菌体进行扩增，具体步骤如下(1)将上一轮的洗脱物加入到50mlER2738培养物中，37°C下70rpm缓慢摇动Ih ； (2)取菌液，5000rpm离心lOmin，将沉淀重悬于IOOml LB/Tet新鲜培养基中，提高转速，剧烈摇动12h ；(3)取菌液，4°C 5000rpm再次离心lOmin，取上清，加1/4体积的PEG/NaCl，震荡混勻，置于冰上Ih ；(4)4°C下 12000rpm 离心 20min，去上清，将沉淀用 TBS 重悬，IOOOOrpm 离心 IOmin
后取上清。对筛选到的多个单克隆进行亲和力测定，具体步骤如下(1)用100 μ ITBS缓冲液稀释的酪氨酸酶溶液包被微孔板，4°C静置过夜；(2)倒出包被液，加入封阻液，然后加入同样数量级的不同单克隆扩增出的噬菌体，依次稀释；(3)加入300 μ 1抗Μ13生物素，温育Ih后，洗涤，加入300 μ 1辣根过氧化氢酶 (HRP)，温育Ih后加显色液，暗处显色30min，加终止液；挑选结合力最强的单克隆进行DNA 测序，得到最强结合序列为dle-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe，合成该七肽；(4)用酶联免疫检测仪，495nm波长下，记录数值。验证该七肽对酪氨酸酶的抑制作用，具体步骤如下在ρΗ6· 8 的 Na2HPO4-NaH2PO4 缓冲液体系中，分别以 L-DOPA，L-tyrosine 为底物， 30°C恒温水浴中恒温lOmin，加入不同浓度的七肽和酪氨酸酶的水溶液，测定0D475，结果见图1-4。
权利要求
1.一种酪氨酸酶抑制剂，其特征在于酪氨酸酶抑制剂的序列为 I1e-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。
2.一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，包括(1)将酪氨酸酶溶液置于微孔板内孵育过夜，倒出包被液，加入封阻液，然后用TBS缓冲液清洗微孔板，加入10 μ 1 Μ13噬菌体室温下摇动30 60min，再用TBS缓冲液清洗微孔板板，加入含有酪氨酸酶的洗脱缓冲液进行竞争性洗脱10 35min，得洗脱物；(2)取上述一部分洗脱物进行滴度测试，将另外一部分的洗脱物加入到ER2738培养物中，37°C下摇动30 60min ；取菌液，离心，沉淀重悬于培养基中，摇动12-1 ；取菌液，再次离心，取上清；加入PEG/NaCl混合液，混勻并置于冰上，4°C下离心，取上清后用TBS重悬， 离心，取上清，即得单克隆扩增出的噬菌体；(3)用TBS缓冲液稀释的酪氨酸酶溶液包被微孔板，倒出包被液，加入封阻液，然后加入上述单克隆扩增出的噬菌体，分别稀释，加入300 μ 1抗Μ13生物素，温育Ih后洗涤，加入 300 μ 1辣根过氧化氢酶，温育后加入显色液，暗处显色30 40min，加入终止液，筛选出结合力最强的单克隆扩增出的噬菌体进行DNA测序，得最强结合序列，合成该序列，即得酪氨酸酶抑制剂。
3.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1) 中的酪氨酸酶溶液浓度为100μ g/ml。
4.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1) 中的封阻液组成为0. IM的NaHCO3, 5mg/ml的BSA和0.Na^。
5.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(1) 中的TBS缓冲液为0. 05M IM的Tris,0. 15M的NaCUpH 7. 5 8. 0的Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(2) 中的ER2738以1 100稀释后接种于20ml LB/Tet培养基中培养3_3. 5h后所得。
7.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(2) 中的PEG/NaCl混合液由质量体积百分比为20 %的PEG-8000和2. 5M的NaCl组成，加入 PEG/NaCl溶液的体积为菌液体积的1/6 1/4。
8.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(2) 中的最强结合序列为 11 e-Gln-Ser-Pro-Hi s-Phe-Phe。
9.根据权利要求2所述的一种酪氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于所述步骤(3) 中的终止液为2M的硫酸。
全文摘要
本发明涉及一种酪氨酸酶抑制剂及其制备方法，酪氨酸酶抑制剂的序列为Ile-Gln-Ser-Pro-His-Phe-Phe。制备方法包括(1)以酪氨酸酶分子为靶向分子，筛选大量对其具有不同亲和力的噬菌体；(2)对筛选到的亲和性噬菌体进行扩增，用于下一轮生物淘洗；(3)对筛选到的多个单克隆进行亲和力测定，挑选结合力最强的单克隆进行DNA测序及特异性配体的合成。本发明抑制效果较好，并且属于人体内源性物质，具有较好的生物相容性，较低的细胞毒性，更适合于在美白化妆品，果蔬保鲜，生物杀虫剂等方面的应用；制备方法操作简单，耗时较少，纯化倍数和酶活性较高。
文档编号C12Q1/26GK102336809SQ20111019959
公开日2012年2月1日 申请日期2011年7月18日 优先权日2011年7月18日
发明者朱利民, 汪雯, 聂华丽, 陈天翔 申请人:东华大学