一种酶法生产l-酪氨酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶法生产L?酪氨酸的方法，包括：采用发酵法生产丙酮酸，在丙酮酸发酵后期加入β?酪氨酸酶、苯酚和NH4Cl，将生成的丙酮酸转化为L?酪氨酸，得含L?酪氨酸的发酵液；取含L?酪氨酸的发酵液，加热至70℃?90℃，加酸至L?酪氨酸晶体完全溶解；加入活性炭进行脱色，脱色后先用陶瓷膜过滤，除去菌体、蛋白和活性炭，所得清液再经耐酸液体保安过滤器进行第二次过滤；第二次过滤后的清液调整pH至5.0?7.0，降温结晶、离心，得L?酪氨酸。本发明简化了工艺，提高了生产效率，所得L?酪氨酸纯度高、收率高，得到的酪氨酸的纯度比传统提取法显著提高，达到98.0%以上，符合各项酪氨酸药品质量标准。
【专利说明】
一种酶法生产L-酪氨酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种酶法生产L-酪氨酸的方法，属于L-酪氨酸制备和提取技术领域。
【背景技术】
[0002]L-酪氨酸是芳香族氨基酸，属于氨基酸的一种，人体不能合成，是人体非必需氨基酸。在医药上，L-酪氨酸用作治疗甲状腺功能亢进，此外，L-酪氨酸还是合成多肽类激素、抗生素、L-多巴等药物的主要原料。
[0003]L-酪氨酸的制备方法有三种，一种是提取法，该方法是利用天然蛋白资源如人发、猪毛、猪血粉等为原料，经水解、提取、精制等步骤分离制得L-酪氨酸。由于蛋白原料水解液中含有多种氨基酸，其中L-酪氨酸和L-胱氨酸的等电点和溶解度相近，分离得到高纯度的L-酪氨酸非常困难，而且该方法造成原辅料的消耗和产品的流失，所得到的酪氨酸产品的纯度、比旋光度和透过率指标较低，产品质量较难达标从而限制了产品的销售和经济效益。如果进行产品的二次精制，那么酪氨酸的收率明显下降，成本提高。第二种是发酵法，通过菌种发酵直接生产酪氨酸，但是由于发酵液中酪氨酸单位产量低(8-15mg/L)的原因无法进行大规模生产。例如，专利201410706579.3利用花椒内生耐寒短杆菌发酵生产L-酪氨酸，但是其产量很低，仅为8_15mg/L。第三种是催化制备法，以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用酶催化制得，该方法是采用发酵法或其他方法制得丙酮酸，将丙酮酸发酵液或粗提液与酶、苯酚、NH4Cl混合，氨水调节pH至中性进行反应，得到酪氨酸。该方法酪氨酸的提取方法也是采用等电点提取法，产品收率高、纯度高。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种酶法生产L-酪氨酸的方法，该方法通过对酶反应步骤和提取工艺条件的改进和优化，解决了酪氨酸提取纯度低、收率低的问题。
[0005]本发明对丙酮酸制备酪氨酸的方法进行了改进，在丙酮酸发酵后期即加入反应原料，并且纯化方法进行了改进，提高了酪氨酸的收率和纯度。具体的，本发明酶法生产L-酪氨酸的方法包括以下步骤:
[0006](I)采用发酵法生产丙酮酸，在丙酮酸发酵后期加入β-酪氨酸酶、苯酚和NH4Cl,将生成的丙酮酸转化为L-酪氨酸，得含L-酪氨酸的发酵液；
[0007](2)取含L-酪氨酸的发酵液，加热至70°C-90°C，加酸至L-酪氨酸晶体完全溶解。
[0008](3)加入活性炭进行脱色，脱色后先用陶瓷膜过滤，除去菌体、蛋白和活性炭，所得清液再经耐酸液体保安过滤器进行第二次过滤；
[0009](4)第二次过滤后的清液调整pH至5.0-7.0，降温结晶、离心，得L-酪氨酸。
[0010]本发明对L-酪氨酸制备过程进行改进，在丙酮酸发酵过程中即加入其它反应物制备L-酪氨酸，而非在发酵结束后再加入β_酪氨酸酶、苯酚和NH4Cl,发酵液中丙酮酸含量的减少能降低对丙酮酸生产通路的反馈抑制作用，同时也有效的避免了丙酮酸在提取过程中的损失，克服了现有生产方法反应时间长、生产效率低的不足，提高了生产效率和收率。
[0011]上述步骤(I)中，丙酮酸发酵方法可以采用现有技术中公开的任意丙酮酸发酵方法，本领域技术人员可以从现有技术中随意选择，只要在发酵后期按照本发明的思路加入β-酪氨酸酶、苯酚和NH4C I即可。例如，丙酮酸可以采用专利CNO 3 I O 9 2 I 4.4、CN201310009709.3、CN200410056957.4、CN201510205724.4等中的方法进行发酵。
[0012]进一步的，苯酚和NH4Cl对丙酮酸发酵生产菌有一定的毒性，在丙酮酸发酵过程中如果一次性大量的加入会抑制丙酮酸的发酵，使丙酮酸产量明显降低，但是研究过程中发现，当苯酚和NH4Cl以流加的方式加入时，通过控制它们在发酵液中的浓度可以降低对丙酮酸产量的影响，达到既不影响发酵生产丙酮酸又能与丙酮酸反应生产L-酪氨酸的目的。因此，本发明确定了苯酚和NH4Cl以流加的方式加入时，通过控制流加速度减少它们对丙酮酸产量的降低。
[0013]进一步的，β-酪氨酸酶、苯酚和NH4Cl在发酵后期加入，何时加入可以通过苯酚和NH4Cl的流加速度进行调控。根据它们与丙酮酸的用量关系，它们的加入时间应该不低于丙酮酸完全转化为L-酪氨酸的时间。
[0014]优选的，经过试验发现，当苯酚和NH4Cl的流加速度满足以下条件时，L-酪氨酸的收率和纯度较高:控制流加速度，保持在反应体系中苯酚小于等于17.5g/L.h，NH4Cl小于等于2.5g/L.h(以反应体系体积计)。
[0015]优选的，根据苯酚和NH4Cl的流加速度和与丙酮酸的用量关系，可以计算出它们的流加时间，苯酚和NH4Cl开始流加至发酵完全结束持续的时间等于或稍大于苯酚和NH4Cl的流加时间为宜，也可以说，苯酚和NH4Cl流加结束后，再经0-1.5h整个发酵过程结束。这样既可以减少苯酚和NH4Cl对丙酮酸发酵的不良影响，还能减少反应时间，使丙酮酸的发酵和L-酪氨酸的制备同时进行，大大减少了设备用量和制备时间，提高了生产效率。
[0016]进一步的，β-酪氨酸酶、苯酚、NH4Cl的用量可以按照现有技术中公开的丙酮酸与苯酚、NH4Cl反应所需的用量进行选择。加入β-酪氨酸酶、苯酚和NH4Cl后，保持体系pH值稳定在 8_9 ο
[0017]本发明从含L-酪氨酸的发酵液中提取L-酪氨酸，发酵液中有部分L-酪氨酸以晶体的形式析出，有部分L-酪氨酸溶解在发酵液中。因发酵液中含有菌丝等固体，直接过滤会损失一部分L-酪氨酸，因此在提取时先在加热的情况下加酸将析出的L-酪氨酸溶解，一般酸加至pH=2-4时L-酪氨酸可以完全溶解。
[0018]上述步骤(3)中，L-酪氨酸溶解后，发酵液先加入活性炭脱色、然后通过陶瓷膜和保安过滤器的两次过滤，除去了发酵液中的细菌、蛋白、小分子肽等杂质，大大简化了除杂过程，简化了提取工艺。
[0019]上述步骤(3)中，活性炭用量为8-14g/L，脱色温度为70-80°C，脱色时间为30-60mino
[0020]上述步骤(3)中，陶瓷膜的平均孔径为180-220nm，活性炭脱色后先用陶瓷膜进行过滤，活性炭为粉末状，过滤时容易堵住滤孔，过滤时间慢，陶瓷膜接触面积大，比其他过滤装置过滤活性炭快，它们结合减少了传统酪氨酸提取繁琐的步骤，从发酵液直接出成品，减少了能耗和人力的使用。陶瓷膜的过滤条件为:温度60?90°C，压力0.2?0.35Mpa，发酵液流速60L/m2.h?150L/m2.h。
[0021]陶瓷膜过滤可以除去一些粒度比较大的杂质，例如菌体、蛋白、活性炭等，陶瓷膜过滤后发酵液中还有一些粒度比较小的杂质，例如小分子肽和小分子色素等，因此陶瓷膜过滤后再用耐酸液体保安过滤器进行过滤，可以进一步除杂，使产品中活性炭小颗粒数量明显减少，显著提高了产品质量。耐酸液体保安过滤器的平均孔径为0.8-1.2μπι，其具体可以采用乙烯树脂耐酸过滤器。进一步的，耐酸液体保安过滤器的过滤条件为:温度60?70°C，压力0.1?0.15Mpa，发酵液流速30L/m2.h?60L/m2.h。
[0022]进一步的，步骤(3)中，陶瓷膜过滤所得的菌体、蛋白和活性炭浓液经高压压滤机压滤后焚烧。
[0023]上述步骤(4)中，过滤后，将发酵液pH调节至5.0-7.0，然后降温结晶就可以将L-酪氨酸析出，一般的，降温至10_20°C进行结晶，结晶后离心分离即可得到纯度高的L-酪氨酸，且L-酪氨酸损失少、收率高，更易于工业化应用。进一步的，离心分离时，离心机转速为2000_2500rpm。
[0024]进一步的，步骤(4)中，离心分离后的母液减压浓缩后加入下批次发酵液中脱色，浓缩所得蒸馏水用于清洗陶瓷膜、耐酸液体保安过滤器。这些操作大大降低了废液排放量，更为环保。母液减压浓缩条件是:温度80_90°C，真空度-0.06?-0.1Mpa。
[0025]本发明的有益效果是:
[0026]1、本发明利用丙酮酸发酵液为原料，在发酵后期加入β-酪氨酸酶以及酪氨酸合成底物，简化了以往酶法生产酪氨酸中丙酮酸提取的步骤，提高了生产过程中丙酮酸的收率。
[0027]2、本发明酪氨酸提取过程中把活性炭脱色和陶瓷膜过滤结合在一起，减少了传统酪氨酸提取繁琐的步骤，从发酵液直接出成品，减少了能耗和人力的使用;使用耐酸液体保安过滤器过滤使产品中活性炭小颗粒数量明显减少，产品质量显著提高。母液循环利用，提高L-酪氨酸的收率并降低了废液的排放。
[0028]3、本发明L-酪氨酸纯度高、收率高，得到的酪氨酸的纯度比传统提取法显著提高，达到98.0%以上，符合各项酪氨酸药品质量标准。
【具体实施方式】
[0029]下面通过具体实施例对本发明进行进一步描述，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限定。
[0030]实施例1
[0031 ]本发明L-酪氨酸的提取方法如下:
[0032]1、含L-酪氨酸的发酵液的制备
[0033](I)使用专利CN03109214.4中记载的光滑球拟酵母菌CGMCCN0.0879为菌种发酵制备丙酮酸，方法是:将光滑球拟酵母菌按照10%的接种量加入丙酮酸发酵培养基中，在30°C、ρΗ5.0、溶氧30-50 %的条件下进行发酵，共发酵48h，发酵结束丙酮酸的浓度约为70g/L;发酵培养基组成为:葡萄糖、ΚΗ2Ρ04、大豆蛋白胨、豆柏水解液、硫酸铵；
[0034](2)当离发酵结束4h时，向发酵液中加入β-酪氨酸酶，然后连续流加苯酚和NH4Cl，并且控制流加速度，使苯酚在体系中的流加速度为17.5g/L.h ,NH4Cl在体系中的流加速度为2.5g/L.h，同时用氨水调节PH值稳定在8.5。发酵结束后，得含L-酪氨酸的发酵液。β-酪氨酸酶的用量为10g/L，相当于每ml发酵液中加入β_酪氨酸酶1lt^UF，苯酚和NH4Cl的总用量为70g/L和10g/L。经液相色谱检测，发酵结束后，发酵液中L-酪氨酸的含量为133g/L。
[0035]2、L_酪氨酸的提取
[0036](I)取35000L上述含有L-酪氨酸的发酵液，加热至80 °C，用酸调节pH至2-4，直至L-酪氨酸完全溶解；
[0037](2)向发酵液中加入10g/L活性炭，在75°C脱色30min;
[0038](3)脱色后，发酵液过陶瓷膜过滤，得到脱色清液，过滤条件是:陶瓷膜的平均孔径为200nm，温度80 °C，压力0.25-0.30Mpa，发酵液流速100L/m2.h，过滤时间为2h ；过滤所得的菌体、蛋白和活性炭浓液经高压压滤机压滤后锅炉焚烧；
[0039](4)脱色清液经过耐酸液体保安过滤器过滤，有效的控制成品中活性炭小颗粒数量，过滤条件为:过滤器的平均孔径为Ι.Ομπι，温度65°C，压力0.1?0.15Mpa，发酵液流速50L/m2.h，过滤时间为2h;
[0040](5)过滤后的清液用氨水调节pH至5.0-7.0，降温至15°C结晶，结晶后经2200rpm离心得到L-酪氨酸，离心母液减压浓缩(温度80-90°C，真空度-0.06?-0.1Mpa)后加入下批次发酵液中脱色，浓缩得到的蒸馏水用于清洗陶瓷膜设备、耐酸液体保安过滤器。
[0041 ] 离心所得的L-酪氨酸经干燥，得L-酪氨酸产品，共4400kg，产品为白色，经HPLC测得其纯度为99.8%, L-酪氨酸的收率为94.3 %。
[0042]取1g产品，用0.1M的盐酸溶解，静止1min后，在光下观测溶液底部黑色活性炭小颗粒的数量小于2个。
[0043]实施例2
[0044]本发明L-酪氨酸的提取方法如下:
[0045](I)取35000L实施例1制备的含有L-酪氨酸的发酵液，加热至70°C，用酸调节pH至2-4，直至L-酪氨酸完全溶解；
[0046](2)向发酵液中加入8g/L活性炭，在70°C脱色60min;
[0047](3)脱色后，发酵液过陶瓷膜过滤，得到脱色清液，过滤条件是:陶瓷膜的平均孔径为220nm，温度60°C，压力0.35Mpa，发酵液流速60L/V.h，过滤时间为2h;过滤所得的菌体、蛋白和活性炭浓液经高压压滤机压滤后锅炉焚烧；
[0048](4)脱色清液经过耐酸液体保安过滤器过滤，有效的控制成品中活性炭小颗粒数量，过滤条件为:过滤器的平均孔径为1.2ym，温度60 °C，压力0.15Mpa，发酵液流速30L/V.h，过滤时间为2h;
[0049](5)过滤后的清液用氨水调节pH至5.0-7.0，降温至10°C结晶，结晶后经2000rpm离心得到L-酪氨酸，离心母液减压浓缩(温度80-90°C，真空度-0.06?-0.1Mpa)后加入下批次发酵液中脱色，浓缩得到的蒸馏水用于清洗陶瓷膜设备、耐酸液体保安过滤器。
[0050]离心所得的L-酪氨酸干燥，得L-酪氨酸产品，共4450kg，产品为白色，活性炭小颗粒数量小于2个，经HPLC测得其纯度为98.5%,L-酪氨酸的收率为95.3%。
[0051 ] 实施例3
[0052]本发明L-酪氨酸的提取方法如下:
[0053](I)取35000L实施例1制备的含有L-酪氨酸的发酵液，加热至90°C，用酸调节pH至2-4，直至L-酪氨酸完全溶解；
[0054](2)向发酵液中加入14g/L活性炭，在80°C脱色30min;
[0055](3)脱色后，发酵液过陶瓷膜过滤，得到脱色清液，过滤条件是:陶瓷膜的平均孔径为180nm，温度90 °C，压力0.2Mpa，发酵液流速150L/V.h，过滤时间为2h;过滤所得的菌体、蛋白和活性炭浓液经高压压滤机压滤后锅炉焚烧；
[0056](4)脱色清液经过耐酸液体保安过滤器过滤，有效的控制成品中活性炭小颗粒数量，过滤条件为:过滤器的平均孔径为0.8μπι，温度70°C，压力0.謂?&，发酵液流速6017!112.h，过滤时间为2h;
[0057](5)过滤后的清液用氨水调节pH至5.0-7.0，降温到20°C结晶，结晶后经2500rpm离心得到L-酪氨酸，离心母液减压浓缩(温度80-90°C，真空度-0.06?-0.1Mpa)后加入下批次发酵液中脱色，浓缩得到的蒸馏水用于清洗陶瓷膜设备、耐酸液体保安过滤器。
[0058]离心所得的L-酪氨酸干燥，得L-酪氨酸产品，共4220kg，产品为白色，活性炭小颗粒数量为小于2个。经HPLC测得其纯度为99.7%，L_酪氨酸的收率为89.6%。
[0059]实施例4
[0060]本发明L-酪氨酸的提取方法如下:
[0061]1、含L-酪氨酸的发酵液的制备
[0062](I)使用专利CN03109214.4中记载的光滑球拟酵母菌CGMCCN0.0879为菌种发酵制备丙酮酸，方法是:将光滑球拟酵母菌按照10%的接种量加入丙酮酸发酵培养基中，在30°C、PH 5.0、溶氧30-50 %的条件下进行发酵，共发酵48h ;发酵培养基组成为:葡萄糖、KH2PO4、大豆蛋白胨、豆柏水解液、硫酸铵；
[0063](2)当离发酵结束5h时，向发酵液中加入β-酪氨酸酶，然后连续流加苯酚和NH4Cl，并且控制流加速度，使苯酚在体系中的流加速度为14g/L.h，NH4Cl在体系中的流加速度为2g/L.h，同时用氨水调节PH值稳定在8.5。发酵结束后，得含L-酪氨酸的发酵液。β-酪氨酸酶的用量为10g/L，相当于每ml发酵液中加入β-酪氨酸酶101()CUF，苯酚和NH4Cl的总用量为70g/L和10g/L。经液相色谱检测，发酵结束后，发酵液中L-酪氨酸的含量为130g/L。
[0064]2、L_酪氨酸的提取
[0065]取35000L上述含有L-酪氨酸的发酵液，按照实施例1的方法进行提取，得L-酪氨酸产品4307.4kg，产品为白色，活性炭小颗粒的数量小于2个，经HPLC测得其纯度为99.4%,L-酪氨酸的收率为94.1%。
[0066]实施例5
[0067]本发明L-酪氨酸的提取方法如下:
[0068]1、含L-酪氨酸的发酵液的制备
[0069](1)使用专利0~201510205724.4中记载的大肠埃希氏菌基因工程菌YPOICGMCCN0.10691为菌种发酵制备丙酮酸，方法是:将YPOI接种于丙酮酸发酵培养基中，在37°C下发酵2天，发酵结束丙酮酸的浓度约为68.2g/L;发酵培养基组成为:葡萄糖、NH4H2P04、(NH4)2HP04、MgS04、KCl、FeCl3、CoCl2、CuCl2、ZnCl2、Na2Mo04、H3B03、MnCl2 等；
[0070](2)当离发酵结束4h时，向发酵液中加入β-酪氨酸酶，然后按照17.5g/L.h和2.5g/L.h的速度连续流加苯酚和NH4Cl 4h，通过用氨水调节pH值稳定在8.5。发酵结束后，得含L-酪氨酸的发酵液。β-酪氨酸酶的用量为10g/L，苯酚和NH4Cl的用量为70g/L和10g/L。经液相色谱检测，发酵结束后，发酵液中L-酪氨酸的含量为125g/L。
[0071]2、L_酪氨酸的提取
[0072]取35000L上述含有L-酪氨酸的发酵液，按照实施例1的方法提取L-酪氨酸。离心所得的L-酪氨酸干燥，得L-酪氨酸产品，共4055kg，产品为白色，活性炭小颗粒数量为小于2个。经HPLC测得其纯度为98.6%，L-酪氨酸的收率为91.4%。
[0073]对比例I
[0074]取35000L实施例1制得的含有L-酪氨酸的发酵液，按照实施例1的方法提取L-酪氨酸，不同的是:陶瓷膜过滤后不进行耐酸液体保安过滤器过滤，直接用氨水调节pH至5.0-7.0，降温到15 °C结晶，结晶后经2200rpm离心得到L-酪氨酸。
[OO75 ]离心所得的L-酪氨酸干燥，得L-酪氨酸产品，共44 5 O kg，产品为白色，活性炭小颗粒数量为15个。HPLC测得其含量为98.5%，收率为94.2%。
[0076]对比例2
[0077](I)取35000L实施例1制得的上述含有L-酪氨酸的发酵液，加热至80°C，用酸调节pH至2-4，直至L-酪氨酸完全溶解；
[0078](2)向发酵液中加入10g/L活性炭，在75°C脱色30min;
[0079](3)脱色后，发酵液过耐酸液体保安过滤器过滤得到脱色清液，过滤条件是:过滤器的平均孔径为I.Ομπι，温度65 °C，压力0.I?0.15Mpa，发酵液流速50L/V.h，过滤时间为5h。过滤所得的菌体、蛋白和活性炭浓液经高压压滤机压滤后锅炉焚烧；
[0080](4)脱色清液经过陶瓷膜过滤，过滤条件为:陶瓷膜的平均孔径为200nm，温度80°C，压力0.25-0.30Mpa，发酵液流速100L/m2.h，过滤时间为2h;
[0081 ] (5)过滤后的清液用氨水调节pH至5.0-7.0，降温至15°C结晶，结晶后经2200rpm离心得到L-酪氨酸，离心母液减压浓缩(温度80-90°C，真空度-0.06?-0.1Mpa)后加入下批次发酵液中脱色，浓缩得到的蒸馏水用于清洗陶瓷膜设备、耐酸液体保安过滤器。
[0082]离心所得的L-酪氨酸干燥，得L-酪氨酸产品，共4310kg，产品为白色，活性炭小颗粒数量小于2个。经HPLC测得其纯度为98.9%,收率为91.6%。由此可以看出，更换提取步骤的顺序后，所需时间延长，产品收率和纯度也降低。
[0083]对比例3
[0084]含L-酪氨酸的发酵液的制备:
[0085](I)使用专利CN03109214.4中记载的光滑球拟酵母菌CGMCCN0.0879为菌种发酵制备丙酮酸，方法是:将光滑球拟酵母菌按照10%的接种量加入丙酮酸发酵培养基中，在30°C、pH 5.0、溶氧30-50%的条件下进行发酵，共发酵48h，发酵结束丙酮酸的浓度约为70g/L;发酵培养基组成为:葡萄糖、ΚΗ2Ρ04、大豆蛋白胨、豆柏水解液、硫酸铵；
[0086](2)当离发酵结束4h时，向发酵液中加入β-酪氨酸酶，然后按照35g/L.h和5g/L.h的速度连续流加苯酚和NH4Cl 2h，用氨水调节PH值稳定在8.5。发酵结束后，得含L-酪氨酸的发酵液。β-酪氨酸酶的用量为10g/L，苯酚和NH4Cl的用量为70g/L和10g/L。经液相色谱检测，发酵结束后，发酵液中L-酪氨酸的含量为42g/L。苯酚和NH4Cl的加入过快对丙酮酸生产菌和酪氨酸酶造成毒性作用，极大的降低了酪氨酸合成收率。
[0087]对比例4
[0088]本发明L-酪氨酸的提取方法如下:
[0089]1、含L-酪氨酸的发酵液的制备
[0090](I)使用专利CN03109214.4中记载的光滑球拟酵母菌CGMCCN0.0879为菌种发酵制备丙酮酸，方法是:将光滑球拟酵母菌按照10%的接种量加入丙酮酸发酵培养基中，在30°C、pH 5.0、溶氧30-50%的条件下进行发酵，共发酵48h，发酵结束丙酮酸的浓度约为70g/L;发酵培养基组成为:葡萄糖、ΚΗ2Ρ04、大豆蛋白胨、豆柏水解液、硫酸铵；
[0091 ] ( 2)当离发酵结束I Oh时，向发酵液中加入β_酪氨酸酶，然后连续流加苯酚和NH4C1，并且控制流加速度，苯酚在体系中的流加速度为17.5g/L.h，NH4Cl在体系中的流加速度为2.5g/L.h，同时用氨水调节PH值稳定在8.5。发酵结束后，得含L-酪氨酸的发酵液。
酪氨酸酶的用量为10g/L，相当于每ml发酵液中加入β-酪氨酸酶101()⑶F，苯酚和NH4Cl的总用量为70g/L和10g/L。经液相色谱检测，发酵结束后，发酵液中L-酪氨酸的含量为105g/L0
【主权项】
1.一种酶法生产L-酪氨酸的方法，其特征是包括以下步骤: (1)采用发酵法生产丙酮酸，在丙酮酸发酵后期加入β_酪氨酸酶、苯酚和NH4Cl,将生成的丙酮酸转化为L-酪氨酸，得含L-酪氨酸的发酵液； (2)取含L-酪氨酸的发酵液，加热至70°C_90°C，加酸至L-酪氨酸晶体完全溶解； (3)加入活性炭进行脱色，脱色后先用陶瓷膜过滤，除去菌体、蛋白和活性炭，所得清液再经耐酸液体保安过滤器进行第二次过滤； (4)第二次过滤后的清液调节pH至5.0-7.0，降温结晶、离心，得L-酪氨酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤(I)中，苯酚和NH4Cl同时以流加的方式加入。3.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤(I)中，苯酚和NH4Cl以流加的方式加入，控制流加速度，在反应体系中苯酚的流加速度小于等于17.5g/L.h，NH4Cl小于等于2.5g/L.ho4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征是:步骤(I)中，苯酚和NH4Cl流加结束后，再经0-1.5h整个发酵过程结束。5.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤(3)中，陶瓷膜的平均孔径为180-220nm,耐酸液体保安过滤器的平均孔径为0.8-1.2μηι。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征是:步骤(3)中，陶瓷膜的过滤条件为:温度60?90°C，压力0.2?0.35Mpa，发酵液流速60 L/m2.h?150L/V.h;耐酸液体保安过滤器的过滤条件为:温度60?70°C，压力0.1?0.15Mpa，发酵液流速30 L/m2.h?60L/m2.h。7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征是:耐酸液体保安过滤器为乙烯树脂耐酸过滤器。8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是:步骤(3)中，活性炭用量为8-14g/L，脱色温度为70-80 °C，脱色时间为30-60min。9.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤(4)中，降温至10-20°C进行结晶。10.根据权利要求1所述的方法，其特征是:步骤(3)中，陶瓷膜过滤所得的菌体、蛋白和活性炭浓液经高压压滤机压滤后焚烧;步骤(4)中，离心分离后的母液减压浓缩后加入下批次发酵液中脱色，浓缩所得蒸馏水用于清洗陶瓷膜、耐酸液体保安过滤器。
【文档编号】C12P13/22GK105969819SQ201610511684
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】王东阳, 蔡传康, 刘朋朋, 张华 , 陈正
【申请人】山东阳成生物科技有限公司