本发明属于护肤美白技术领域，涉及一种具有抑制酪氨酸酶活性的组合物以及该组合物的制备方法。
背景技术：
美白祛斑一直是人们关注的重点，研究表明决定皮肤色调的主要因素是皮肤内黑色素细胞的量和黑色素细胞合成黑色素的能力，因此，从机理上来讲，美白祛斑的根本途径是减少黑色素细胞的量或抑制其合成黑色素的能力，但黑色素细胞的代谢若是受到破坏或抑制，会产生一些疾病，例如白化症、黑色素细胞瘤(melanoma，癌症的一种)等，因而使得美白祛斑的研究重点落在了抑制黑色素形成上。
酪氨酸酶(ec1.14.18.1，tyrosinase，tyr)又称多酚氧化酶、儿茶酚氧化酶，是一种含铜的金属酶，广泛的分布于微生物、动植物以及人体中，是目前唯一确定的与黑色素合成有关的酶。酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，其催化机理为：催化l-酪氨酸羟基化转化为l-多巴，同时氧化l-多巴形成多巴醌，多巴醌再经过一系列反应，最终形成黑色素。因此，抑制酪氨酸酶的活性以减少合成黑色素的原料多巴醌，是肌肤美白的重要途径之一。
目前，酪氨酸酶活性抑制剂大致可以分为化学合成类抑制剂和天然提取物抑制剂两类，化学合成类抑制剂主要包括氢醌和壬二酸，长期使用会对人体造成不良影响，例如氢醌长期使用不仅对人体具有较大副作用，而且会造成肌肤中黑色素沉积，导致难以清除，壬二酸会对皮肤、眼睛、粘膜和上呼吸道造成刺激；天然提取物抑制剂主要包括曲酸、熊果苷、甘草黄酮和红花黄酮等，其虽然对人体无害，但是来源有限，价格高昂，例如天然的熊果苷只存在于熊果叶子中，不仅熊果数量少，种植难度大，且其叶子中熊果苷的含量也不高。
为此，中国专利文献cn104622735a公开了一种美白祛斑的牡丹复方精油，其原料包括玫瑰精油、鼠尾草精油、薰衣草精油、天竺葵精油、茉莉油、牡丹鲜花精油、牡丹籽油。上述专利文献中公开的技术方案，采用多种植物精油混合使用以实现对酪氨酸酶活性的抑制，从而得到美白祛斑的功效。其采用植物精油作为原料，避免了化学合成抑制剂对人体的伤害，而且使用的植物精油来源也较为广泛，在一定程度上降低了成本，但是植物精油成分复杂，长期使用容易引起皮肤过敏，加之如今环境污染严重，过敏源增多，出现过敏的患者越来越多，降低了产品的普适性。
技术实现要素：
为解决现有的酪氨酸酶抑制剂副作用明显、普适性差的缺陷，从而提高一种抑制酪氨酸酶活性的天然组合物。
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物，包括如下重量份数的原料：
玫瑰花30-60份、月季花20-40份、牡丹花10-40份。
优选的是，所述的抑制酪氨酸酶活性的组合物中，包括如下重量份数的原料：
玫瑰花45-55份、月季花30-35份、牡丹花15-25份。
优选的是，所述的抑制酪氨酸酶活性的组合物中，所述月季花与所述牡丹花的质量比为2:1。
优选的是，所述的抑制酪氨酸酶活性的组合物中，所述玫瑰花与所述牡丹花的质量比为3:2。
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括如下步骤：
将玫瑰花、月季花和牡丹花在乙醇溶液中浸泡后，超声波辅助乙醇提取，滤过，滤液回收乙醇，制得所述抑制酪氨酸酶活性的组合物。
优选的是，所述的制备方法中，所述超声波辅助乙醇提取的温度为50-60℃，时间为30-60min，超声频率为53khz。
优选的是，所述的制备方法中，所述乙醇溶液的体积浓度为40％-60％。
优选的是，所述的制备方法中，所述乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花总质量的20-25倍。
优选的是，所述的制备方法中，浸泡时间为2-3h，浸泡温度为22-27℃。
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种抑制酪氨酸酶活性的组合物，包括玫瑰花、牡丹花和月季花三种原料，配方简洁。并且所采用的原料玫瑰花、月季花和牡丹花的来源广泛、价格低廉，大大的降低了制造成本，同时上述原料均为天然植物，不仅致敏性低，且对人体无毒害作用，适于长期使用；
上述原料相互配合，具有对酪氨酸酶活性显著的抑制功效，通过实验证明，在以l-tyr(l-酪氨酸)和l-dopa(l-多巴)为底物时，对酪氨酸酶活性的抑制率可以达到92.68％和89.12％，半数抑制浓度可以达到0.175mg/ml和1.229mg/ml，在黑色素细胞内对酪氨酸酶的活性的半数抑制浓度可达0.201mg/ml，从根本上抑制了黑色素的生成其抑制率可达40.21％；除此之外，还具有较强的清除自由基dpph功能，半数清除浓度可达0.043mg/ml，明显优于对比组。
综上本发明公开的抑制酪氨酸酶活性的组合物不仅对肌肤具有显著的美白和淡斑的功效，而且能有效的减少皱纹的产生。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结。
实施例1
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花30g、月季花20g和牡丹花40g，在25℃的环境下，置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，浸泡2h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的20倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为50℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取60min，其中超声波频率为53khz，功率密度为0.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
实施例2
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花60g、月季花40g和牡丹花10g，在22℃的环境下，置于体积浓度为60％的乙醇溶液中，浸泡2h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的20倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取60min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
实施例3
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花45g、月季花35g和牡丹花25g，在27℃的环境下，置于体积浓度为50％的乙醇溶液中，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的25倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为50℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取60min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.0w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
实施例4
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花55g、月季花32g和牡丹花16g，在25℃的环境下，置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的25倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为50℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取60min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.0w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
实施例5
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花45g、月季花30g和牡丹花15g，在25℃的环境下，置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取30min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
实施例6
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花50g、月季花33g和牡丹花20g，在25℃的环境下，置于体积浓度为50％的乙醇溶液中，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为50℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取45min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.0w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
对比例1
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花70g、月季花50g和牡丹花45g，在25℃的环境下，置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花和牡丹花质量总和的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花以及牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取30min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
对比例2
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将玫瑰花90g置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，在25℃的环境下，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花质量的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花，采用超声波辅助乙醇提取30min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
对比例3
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将月季花90g置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，在25℃的环境下，浸泡3h，乙醇溶液的用量为月季花质量的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和月季花，采用超声波辅助乙醇提取30min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
对比例4
一种抑制酪氨酸酶活性的组合物的制备方法，包括：
(1)将牡丹花90g置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，在25℃的环境下，浸泡3h，乙醇溶液的用量为牡丹花质量的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和牡丹花，采用超声波辅助乙醇提取30min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，即为抑制酪氨酸酶活性的组合物，同时回收乙醇溶液。
对比例5
将玫瑰精油5.0g、鼠尾草精油3.6g、薰衣草精油6.5g、天竺葵精油7.0g、茉莉精油8.0g和牡丹鲜花精油5.0g，放入搅拌容器中，常温低速搅拌，搅拌转速为30-50r/min，使各原料充分混合均匀，再加入牡丹籽油364g、天门冬提取物2g，常温低速搅拌，搅拌转速为30-50r/min，充分稀释融合，制得复合精油。
对比例6
(1)将玫瑰花45g、月季花叶30g、牡丹花15g、金银花3g和白菊花5g，在25℃的环境下，置于体积浓度为40％的乙醇溶液中，浸泡3h，乙醇溶液的用量为玫瑰花、月季花叶、牡丹花、金银花和白菊花质量总和的22倍；
(2)使用水浴超声仪，控制水浴温度为60℃，将步骤(1)中浸泡后的浸泡液(乙醇溶液)和玫瑰花、月季花叶、牡丹花、金银花和白菊花，采用超声波辅助乙醇提取30min，其中超声波频率为53khz，功率密度为1.5w/cm2；
(3)过滤，滤除固体，减压蒸馏去除乙醇溶液，得到精制液，采用蒸馏水将精制液稀释到3g/l，具有美白功效的植物组合物，同时回收乙醇溶液。
效果验证
将实施例1-6以及对比例1-6制备的组合物编号为1-12。
(1)dpph自由基清除试验
二苯基苦基苯肼自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，dpph·)是一种稳定的有机自由基，它的稳定性主要来自共振稳定作用及3个苯环的空间障碍，而使夹在其中氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。通过检测物质对dpph·自由基的清除能力可以表示其抗氧化性的强弱。
精密称取dpph20mg，用95％乙醇溶解并定容至1000ml，得到浓度为20mg/l的dpph标准溶液，用编号为1-10和12的组合物分别配制浓度为1mg/ml的测试溶液；
用移液器向10个反应器中分别移取90μl的dpph标准溶液，依次向每个反应容器中加入10μl测试溶液，放置30min后，采用md酶标仪，在517nm下测定吸光度，以vc为阳性对照。
根据检测结果计算清除dpph的ic50值，结果见表1。
表1清除dpphic50值
从表1中实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物的清除dpph的ic50值明显低于对比例1-4和6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物的清除dpph的ic50值，证明本实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物清除dpph自由基的能力优于对比例1-4和6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物。
(2)酪氨酸酶活性抑制试验
2.1以l-tyr和l-dopa为底物的酪氨酸酶抑制率(i)检测
酪氨酸转化为黑色素的过程中，酪氨酸酶的催化作用主要发生在酪氨酸转化为l-多巴，以及l-多巴转化为多巴醌的过程中，多巴醌是一种有色物质，在475nm有吸收，可利用分光光度计测定含量。
用编号为1-10的组合物分别配制浓度为3mg/ml的测试溶液；
分别以l-tyr和l-dopa为底物，编号为1-10的组合物根据表2配制测试溶液组，利用分光光度计检测吸光度值，在波长为475nm下检测吸光度，根据检测到的吸光度值，按照公式(1)计算编号为1-10的组合物对酪氨酸酶活性的抑制率(i)，试验结果见表3。
表2待测样品组成(ml)
酪氨酸酶抑制率(i)的计算公式如下：
其中，
aa：为a组的混合液的吸光度值；
ab：为b组的混合液的吸光度值；
ac：为c组的混合液的吸光度值；
ad：为d组的混合液的吸光度值。
2.2以l-tyr和l-dopa为底物的对酪氨酸酶抑制的ic50检测：
将编号为1-10的组合物中的每个组合物均配制一系列梯度浓度的标准测试溶液，每个编号对应的一组标准测试溶液按照2.1中的方法分别以l-tyr和l-dopa为底物，标准溶液中每个浓度的抑制率，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，得出浓度与抑制率的量效关系，由此可得到组合物对酪氨酸酶活性抑制的ic50值，检测结果见表4。
表3酪氨酸酶活性抑制率(i)
从表3中可以看出无论是以l-tyr为底物还是以l-dopa为底物，实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物对酪氨酸酶活性抑制率，均明显高于对比例1-4制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物，证明实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物对酪氨酸酶活性的抑制能力明显优于对比例1-4制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物。
表4抑制酪氨酸酶活性的ic50值
从表4中可以看出无论是以l-tyr为底物还是以l-dopa为底物，实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物抑制酪氨酸酶活性的ic50值，均明显小于对比例1-4制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物，证明实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物抑制酪氨酸酶活性的能力明显优于对比例1-4制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物。
(3)细胞内酪氨酸酶活性的测定
1.培养黑色素细胞生长到对数生长期，采用pbs(磷酸盐缓冲液)洗涤两次，用质量浓度为0.25％胰酶消化，用血球计数板计数，调整到每毫升中具有2×104个黑色素细胞，以每孔取100μl的量接入到96孔板中；
2.用dmso(二甲基亚砜)作为溶剂，将编号为1-12的组合物中的分别均配制一系列梯度浓度的标准测试溶液，每个编号对应的一组标准测试溶液；
96孔板在37℃培养箱中培养24h后分别添加标准测试溶液，每个浓度设置3个孔，对照组为不加标准测试溶液的，在co2含量为5％孵箱中，37℃孵育72h；
3.孵箱培育过程中，中间换一次药物培养基(96孔板)，72h后弃去上清，用pbs荡洗2次，每孔加含0.1％tritonx-100的pbs缓冲溶液100μl，振荡10min，0℃下培育30min后，升温至37℃，加入质量浓度为0.1％l-dopa溶液10μl，孵育30min后，在475nm波长处测吸光度；
根据检测的吸光度，利用公式(2)计算出编号为1-12的组合物在黑色素细胞内抑制酪氨酸酶活性的抑制率；以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制曲线，根据曲线计算出组合物在黑色素细胞内抑制酪氨酸酶活性的ic50值，结果见表5。
酪氨酸酶活性抑制率(％)＝(1-a加药组/a对照组)×100％….(2)
a加药组为添加有标准测试溶液的吸光度；
a对照组为未加标准测试溶液的吸光度。
表5组合物在黑色素细胞内抑制酪氨酸酶活性的ic50值
从表5中可以看出实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物抑制酪氨酸酶活性的ic50值，均明显小于对比例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物，证明实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物在黑色素细胞内抑制酪氨酸酶活性的能力明显优于对比例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物。
对比例6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物在黑色素细胞内抑制酪氨酸酶活性的能力比单独的玫瑰花和牡丹花的抑制酪氨酸酶活性的能力差，可能是原料复配产生拮抗作用所致。
(5)组合物对黑色素细胞内黑色素抑制测定
1.选用处于对数生长期的黑色素肿瘤b16细胞，调整细胞悬液浓度，按2×104个细胞/ml的浓度接种于96孔培养板中，其中，96孔培养板中的每个孔的体积为100μl，未添加细胞的孔采用无菌pbs填充；
2.用dmso作为溶剂，将编号为1-10的组合物中的分别均配浓度为150μg/ml标准测试溶液；
96孔板在37℃培养箱中培养24h，使细胞单层铺满96孔培养板孔底，分别添加标准测试溶液，每个标准溶液设置3个孔，对照组为不加标准测试溶液的，在co2含量为5％孵箱中，37℃孵育72h；
3.孵箱培育过程中，中间换一次药物培养基(96孔板)，72h后弃去上清，用pbs荡洗2次，用质量浓度为0.25％胰酶消化，收获细胞，放入离心管中；
4.收获得到的细胞经过1000r/min的离心，弃去上清，加入1mlpbs溶液离心洗涤一次，弃上清；
5.加入100μlpbs溶液，振荡，混匀后加入80℃预热的200μl的含10％dmso的naoh(1mol/l)，80℃下加热3h，每半个小时振荡一次，取100μl转入新的96孔板中，在405nm波长下检测光吸收度。
根据检测到的吸光度，采用公式(3)计算组合物在黑色素细胞内对黑色素生成抑制率，结果见表6。
黑色素合成抑制率＝[1-(药物孔吸光度值÷药物孔细胞密度)÷(对照孔吸光度值÷对照孔细胞密度)]×100％…..(3)
药物孔吸光度值为添加有标准测试溶液的吸光度；
药物孔细胞密度为添加有标准测试溶液的b16细胞的浓度；
对照孔吸光度值为未添加有标准测试溶液的对照组的吸光度；
对照孔细胞密度为未添加有标准测试溶液的对照组的b16细胞的浓度。
表6组合物在黑色素细胞内对黑色素形成的抑制率
从表6可知，在浓度为250μg/ml时，实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物对黑素细胞内黑色素生成抑制率明显高于对比例1-4制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物；证明实施例1-6制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物对黑素细胞内黑色素生成抑制能力明显优于对比例1-4制备的抑制酪氨酸酶活性的组合物。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。