一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法及应用
【专利摘要】本发明提供一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，该方法以牡丹花瓣为原料，通过加热回流提取牡丹花瓣中含有酪氨酸酶抑制物的有效组分，萃取、大孔树脂柱层析除去脂溶性和水溶性的杂质，浓度为90％的乙醇洗脱液浓缩干燥后得到酪氨酸酶抑制物。使用本发明提供的方法能够得到提取率较高的酪氨酸酶抑制物，提取率可达6％以上。在酪氨酸酶抑制物提取的过程中，所使用的药品均为常见药品，生产成本低；乙醇和层析柱中的大孔树脂均可重复使用，不污染环境，进一步降低生产成本。通过本发明提供的方法所得到的酪氨酸酶抑制物具有比熊果苷更强的活性，能够应用于抑制酪氨酸酶活性的药物或化妆品的制备，也还能够应用于防止褐变的食品添加剂的制备。
【专利说明】
一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物提取技术领域，尤其涉及一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的 方法及应用。
【背景技术】
[0002] 色斑是一种由于皮肤黑色素增加而形成的常见于面部的皮肤疾病，色斑一般呈褐 色或黑色。通常色斑形成的原因为遗传因素、内分泌失调、环境污染及紫外线照射等，形成 原因比较复杂，但最终的原因均是黑色素的沉积。色斑在形成的过程中，酪氨酸酶将酪氨酸 转化为黑色素，随着酪氨酸的不断转化，黑色素的含量逐渐增加并沉积在皮肤表面，最终形 成色斑，因此，酪氨酸酶是色斑形成的主要限速酶。酪氨酸的转化速度与酪氨酸酶的活力有 关，体内的酪氨酸酶活力越高时，酪氨酸的转化速度越快，黑色素越容易形成，因而，酪氨酸 酶活力的大小决定色斑形成的快慢。酪氨酸酶抑制剂能够抑制酪氨酸的转化，因而在化妆 品领域内，寻找酪氨酸酶抑制剂是各大化妆品公司重点关注的领域。
[0003] 随着人们对安全性能要求的提高，具有一定功效的、高安全性的化妆品逐渐受到 人们的青睐，因此，从天然物质中寻找具有美白功效的、高安全性的酪氨酸酶抑制剂更是当 今世界化妆品工业在淡化色斑领域内的潮流。
[0004] 牡丹(Paeonia suffruticosa Andrews)是原产我国的一种名贵花丼，具有较高的 观赏价值和药用价值。在药用价值方面，牡丹具有和血、生血、凉血及清热解毒的功效，能够 用于治疗血中伏火、烦热。同时，现代药理学研究还表明，牡丹中含有紫云英苷、丹皮花苷、 缔纹天竺苷以及多种人体必需的氨基酸、微量元素和维生素。牡丹由其所具有的观赏价值 能够在花期时带来一定的经济效益，但花期过后大量的牡丹枯萎、衰败，仅有牡丹的根部作 为中药材而带来一定的经济效益。当然也有将牡丹花做成食品类的副业，但由于深加工技 术落后，仅有少量的牡丹花被利用，因此，为提高牡丹的利用率，越来越多的人研究牡丹的 成分及应用。研究发现，牡丹具有美白的作用，这说明牡丹中含有抑制色斑形成的物质，但 抑制物的提取方法成本较高，不利于大范围的推广与应用。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，本发明提供的方法生产 成本低，提取效率高，且对环境无严重污染，适用于大范围的推广与应用。
[0006] -种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，所述方法包括：
[0007] 摘取牡丹花瓣，洗净、沥干；
[0008] 将沥干后的所述牡丹花瓣加入到浓度为75%的乙醇溶液中捣烂成浆，得到牡丹花 浆液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为lg:2-4ml;
[0009] 将所述牡丹花浆液加入到浓度为75 %的乙醇溶液中加热回流，得到回流液，其中， 所述牡丹花浆液与所述乙醇的体积比为1:4-6;
[0010] 将所述回流液过滤得到牡丹花提取液；
[0011] 将所述牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，所述乙醇回收 待用；
[0012] 向所述固体物质中加入蒸馏水，50_70°C下加热溶解，得到混合物，其中，所述固体 物质与所述蒸馏水的体积比为1:2-5;
[0013]向所述混合物中加入正己烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述 正己烷的体积比为1:1-1.5;
[0014] 将所述水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；
[0015] 将所述浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40 %的乙醇溶液和浓度为70 %的乙醇溶液进 行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；
[0016] 所述下柱液洗脱至无色后，用浓度为90 %的乙醇溶液再次对所述浓缩物进行大孔 树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，所述洗脱液合并、备用；
[0017] 将所述洗脱液浓缩、干燥，得到酪氨酸酶抑制物。
[0018] 优选地，所述加热回流的条件为：加热温度为50-70°C，回流次数为2-3次，每次回 流时间为2_4h。
[0019] 优选地，所述大孔树脂为Amberlite XAD7HP树脂。
[0020] 优选地，所述洗脱液浓缩、干燥为所述洗脱液浓缩至无醇味后低温真空干燥。
[0021] 优选地，所述牡丹花瓣为太平红牡丹或丹凤白牡丹的花瓣，当然也可以为其它品 种的牡丹花瓣。
[0022] -种酪氨酸酶抑制物的应用，所述酪氨酸酶抑制物按照从牡丹花中提取酪氨酸酶 抑制物的方法制备，所述酪氨酸酶抑制物用于制备抑制酪氨酸酶活性的药物和化妆品。
[0023] -种酪氨酸酶抑制物的应用，所述酪氨酸酶抑制物按照从牡丹花中提取酪氨酸酶 抑制物的方法制备，所述酪氨酸酶抑制物用于制备防止褐变的食品添加剂。
[0024] 本发明的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
[0025] 本发明提供了一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，该方法包括:摘取牡 丹花瓣，洗净、沥干;将沥干后的所述牡丹花瓣加入到浓度为75 %的乙醇溶液中捣烂成浆， 得到牡丹花浆液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为lg:2-4ml;将所述牡丹 花浆液加入到浓度为75%的乙醇溶液中加热回流，得到回流液，其中，所述牡丹花浆液与所 述乙醇的体积比为1:4-6;将所述回流液过滤得到牡丹花提取液;将所述牡丹花提取液使用 旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，所述乙醇回收待用；向所述固体物质中加入蒸馏 水，50-70Γ下加热溶解，得到混合物，其中，所述固体物质与所述蒸馏水的体积比为1:2-5; 向所述混合物中加入正己烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述正己烷的 体积比为1:1-1.5;将所述水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物;将所述浓缩物分别用蒸 馏水、浓度为40%的乙醇溶液和浓度为70%的乙醇溶液进行大孔树脂柱层析，直至下柱液 洗脱至无色;所述下柱液洗脱至无色后，用浓度为90 %的乙醇溶液再次对所述浓缩物进行 大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，所述洗脱液合并、备用； 将所述洗脱液浓缩、干燥，得到酪氨酸酶抑制物。本发明提供的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑 制物的方法以新鲜牡丹花瓣为原料，通过加热回流提取出牡丹花瓣中含有酪氨酸酶抑制物 的有效组分，经过萃取、大孔树脂柱层析除去脂溶性和水溶性的杂质，浓度为90%的乙醇洗 脱液浓缩干燥后得到酪氨酸酶抑制物。使用本发明提供的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物 的方法能够得到提取率较高的酪氨酸酶抑制物，且提取率可达6%以上。在酪氨酸酶抑制物 提取的过程中，所使用的药品均为常见药品，生产成本低；同时，乙醇和层析柱中的大孔树 脂均可重复使用，不污染环境，进一步降低生产成本，适用于大范围的推广与应用。通过本 发明提供的方法所得到的酪氨酸酶抑制物具有比熊果苷更强的活性，能够应用于抑制酪氨 酸酶活性的药物或化妆品的制备，也还能够应用于防止褐变的食品添加剂的制备。
[0026]应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不 能限制本发明。
【附图说明】
[0027]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施 例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而 言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0029] 图1为本发明实施例提供的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法流程示意图；
[0030] 图2为本发明实施例提供的酪氨酸酶抑制物对小鼠黑色素瘤B16细胞中酪氨酸酶 活性的抑制率图；
[0031] 图3为本发明实施例提供的酪氨酸酶抑制物对小鼠黑色素瘤B16细胞中黑色素生 成的抑制率图。
【具体实施方式】
[0032] 这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及 附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例 中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附 权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
[0033]请参考附图1，附图1示出了本发明实施例提供的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物 的方法流程示意图，以下具体实施例的描述均以附图1为基础。
[0034] 实施例1
[0035] SlOl:摘取盛开后期新鲜的牡丹花瓣，洗净、沥干；
[0036] S102:将沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75 %的乙醇溶液中室温下捣烂成浆，得 到牡丹花浆液，其中，牡丹花瓣与乙醇的质量/体积比为lg:2ml;
[0037] S103:将牡丹花浆液加入到浓度为75%的乙醇溶液中加热回流，加热温度为50 °C， 回流次数为2次，每次回流时间为2h，得到回流液，其中，牡丹花浆液与乙醇的体积比为1:4;
[0038] S104:将回流液过滤得到牡丹花提取液；
[0039] S105:将牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发旋干乙醇，得到固体物质和乙醇，乙醇 回收待用；
[0040] S106:向固体物质中加入蒸馏水，50°C下加热溶解，得到混合物，其中，固体物质与 蒸馏水的体积比为1:2;
[0041] S107:向混合物中加入正己烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物与正己烷 的体积比为I: I;
[0042] S108:将水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；
[0043] S109:将浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40%的乙醇溶液和浓度为70 %的乙醇溶液 进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色；
[0044] SI 10:下柱液洗脱至无色后，用浓度为90 %的乙醇溶液再次对浓缩物进行大孔树 脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的所有洗脱液，洗脱液合并、备用；
[0045] Slll:将洗脱液浓缩至无醇味，在真空干燥箱中低温干燥，得到酪氨酸酶抑制物。
[0046] 实施例2
[0047] S201:摘取盛开后期新鲜的太平红牡丹花瓣，洗净、沥干；
[0048] S202:将沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75 %的乙醇溶液中室温下捣烂成浆，得 到牡丹花浆液，其中，牡丹花瓣与乙醇的质量/体积比为Ig:4ml;
[0049] S203:将牡丹花浆液加入到浓度为75%的乙醇溶液中加热回流，加热温度为70°C， 回流次数为3次，每次回流时间为4h，得到回流液，其中，牡丹花浆液与乙醇的体积比为1:6;
[0050] S204:将回流液过滤得到牡丹花提取液；
[00511 S205:将牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发旋干乙醇，得到固体物质和乙醇，乙醇 回收待用；
[0052] S206:向固体物质中加入蒸馏水，70°C下加热溶解，得到混合物，其中，固体物质与 所述蒸馏水的体积比为1:5;
[0053] S207:向混合物中加入正己烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物与正己烷 的体积比为1:1.5;
[0054] S208:将水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；
[0055] S209:将浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40 %的乙醇溶液和浓度为70 %的乙醇溶液 进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，其中，大孔树脂为Amber I ite XAD7HP树脂； [0056] S210:下柱液洗脱至无色后，用浓度为90 %的乙醇溶液再次对浓缩物进行大孔树 脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的所有洗脱液，洗脱液合并、备用；
[0057] S211:将洗脱液浓缩至无醇味后低温微波干燥，得到酪氨酸酶抑制物。
[0058] 实施例3
[0059] S301:摘取盛开后期新鲜的丹凤白牡丹花瓣，洗净、沥干；
[0060] S302:将沥干后的牡丹花瓣加入到浓度为75 %的乙醇溶液中室温下捣烂成浆，得 到牡丹花浆液，其中，牡丹花瓣与乙醇的质量/体积比为lg:3ml;
[00611 S303:将牡丹花浆液加入到浓度为75%的乙醇溶液中加热回流，加热温度为60°C， 回流次数为3次，每次回流时间为3h，得到回流液，其中，牡丹花浆液与乙醇的体积比为1:5; [0062] S304:将回流液过滤得到牡丹花提取液；
[0063] S305:将牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发旋干乙醇，得到固体物质和乙醇，乙醇 回收待用；
[0064] S306:向固体物质中加入蒸馏水，60°C下加热溶解，得到混合物，其中，固体物质与 蒸馏水的体积比为1:4;
[0065] S307:向混合物中加入正己烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，混合物与正己烷 的体积比为1:1;
[0066] S308:将水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物；
[0067] S309:将浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40 %的乙醇溶液和浓度为70 %的乙醇溶液 进行大孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，其中，大孔树脂为Amber I ite XAD7HP树脂； [0068] S310:下柱液洗脱至无色后，用浓度为90 %的乙醇溶液再次对浓缩物进行大孔树 脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的所有洗脱液，洗脱液合并、备用；
[0069] S311:将洗脱液浓缩至无醇味后低温真空干燥，得到酪氨酸酶抑制物。
[0070]为探究通过本发明实施例提供的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法所提取 的酪氨酸酶抑制物能够抑制酪氨酸酶的活性，本发明实施例提供了酪氨酸酶抑制物与熊果 苷对酪氨酸酶活性抑制的评价方法，具体的评价方法为：
[0071 ] 将酪氨酸酶抑制物溶解在DMS0(Dimethyl sulfoxide，即二甲基亚砜）中，然后加 入摩尔浓度为1/15M、pH值为6.8的PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)配制 成浓度为〇. 5mg/mL的溶液，其中，DMSO与I3BS的体积比为1:9。取40μΙ^?度为0.5mg/mL的上述 溶液加入到96孔板中，并加入20yL摩尔浓度为1/15Μ、ρΗ值为6.8的1^、4(^浓度为2001]/11^ 的酪氨酸酶和IOOyL浓度为5mM的底物L-D0PA(Le V〇d〇pa，L-多巴）形成体外酪氨酸酶活性检 测液。由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液的配制方法、浓度、各组分添加量均与体外酪 氨酸酶活性检测液的相同。
[0072] 将体外酪氨酸酶活性检测液和由熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液在37°C的 条件下孵育20min，孵育结束后在波长为490nm光下分别测定体外酪氨酸酶活性检测液和由 熊果苷配制成的酪氨酸酶活性检测液的吸光度，并计算酪氨酸酶活性的抑制率，计算公式 为：
[0073] I = [1-(C-D)/(A_B)]X100%，其中，I为抑制率;A为没有抑制剂（即无酪氨酸酶抑 制物或无熊果苷)存在时的吸光度值;B为仅有L-DOPA时的吸光度值;C为酪氨酸酶与L-DOPA 在抑制剂(酪氨酸酶抑制物或熊果苷)存在时的吸光度值;D为没有酪氨酸酶存在时的吸光 度值。
[0074]通过上述公式计算得知，0.5mg/mL的酪氨酸酶抑制物对酪氨酸酶的抑制率为44.6 ± 1.6%，0.5mg/mL的熊果苷对酪氨酸酶的抑制率为16.1 ±2.1 %，由此能够说明，在浓度为 0.5mg/mL的条件下，酪氨酸酶抑制物对酪氨酸酶活性的抑制明显大于熊果苷对酪氨酸酶活 性的抑制。
[0075]本发明实施例提供了酪氨酸酶抑制物对小鼠黑色素瘤B16细胞活力影响的实验， 具体实验内容为:通过使用〇. 25 %的胰蛋白酶将小鼠黑色素瘤B16细胞进行消化传代，将消 化传代后的小鼠黑色素瘤B16细胞放置在温度为37 °C、CO2含量为5%、湿度饱和的孵箱中进 行常规的传代贴壁培养。小鼠黑色素瘤B16细胞长满孵箱后，选取对数生长期的细胞，用 DMEM(dulbecco's modified eagle medium，即杜尔伯科培养基)完全培养基调节细胞浓度 并接种于六孔板内。过夜，细胞贴于六孔板内壁后，分别在每个孔内加入不同浓度的酪氨酸 酶抑制物，使酪氨酸酶抑制物的终浓度分别为0yg/mL、6.25yg/mL、12.5yg/mL、25yg/mL、50y g/mL。将加完药品的六孔板放入温度为37 °C、CO2含量为5 %的恒温箱中继续培养。恒温培养 72h后，在倒置显微镜下依次观察并记录每个孔中细胞的形态和数量。观察完毕后，在六孔 板的每个孔中分别加入400yL的]\^5(3-(4,5-(116七1^1七1^&2〇1-211)-5-(3-carboxymethoxyphenyl )-2-(4_sulfophenyI)-2H_etrazolium，即四氮挫蓝盐化合物）溶 液，继续恒温培养2h，培养结束后吸取上清液，用酶联免疫检测仪在波长为490nm处分别测 定OD值(optical density，光密度值），该测验值可间接反映小鼠黑色素瘤B16细胞的细胞 活力。酪氨酸酶抑制物对小鼠黑色素瘤B16细胞活力影响的数据请参考表1。
[0076]表1:酪氨酸酶抑制物对小鼠黑色素瘤B16细胞活力的影响数据
[0078] 从表1中能够看出，随着酪氨酸酶抑制物浓度的增大，小鼠黑色素瘤B16细胞活力 逐渐降低，由此能够说明本发明实施例提取出的酪氨酸酶抑制物能够抑制小鼠黑色素瘤 B16细胞的活力，从而减缓黑色素的产生。
[0079] 为进一步探究酪氨酸酶抑制物是否对动物体内的酪氨酸酶起到活性抑制的作用， 本发明实施例还提供了酪氨酸酶抑制物对小鼠黑色素瘤B16细胞内酪氨酸酶活性、黑色素 含量影响的测试，测试内容具体如下。
[0080] 1、对小鼠黑色素瘤B16细胞内酪氨酸酶活性影响的测试
[0081]根据小鼠黑色素瘤B16细胞活力的检测结果，选择对小鼠黑色素瘤B16细胞基本无 影响的酪氨酸酶抑制物浓度，所选酪氨酸酶抑制物浓度为3.125yg/mL、6.25yg/mL和12.5μ g/mL。根据小鼠黑色素瘤Β16细胞活力影响的实验方法培养小鼠黑色素瘤Β16细胞，细胞培 养后分别加入不同浓度的酪氨酸酶抑制物，72h后使用胰蛋白酶将小鼠黑色素瘤B16细胞进 行消化传代。使用PBS洗涤细胞2次，然后加入50yL质量分数为1%的1^切1^-100(2-(2-[4_ (I，1，3，3-Tetramethylbutyl )phenoxy]ethoxy)ethanol，即聚乙二醇辛基苯基酿）溶液，并 迅速置于-80 °C的环境中冻存30min。冻存结束后，将细胞置于室温条件下进行融化直至细 胞完全破裂，细胞破裂后在温度为37°C的条件下预温5min。预温结束后加入IOyL质量分数 为1 %的L-DOPA溶液，37°C下反应2h后用酶联免疫检测仪在波长为490nm处分别测定OD值， 该测验值能够间接反映小鼠黑色素瘤B16细胞中酪氨酸酶的活性。
[0082] 在本次实验中，以熊果苷、抗坏血酸及空白对照作为对照组，除空白对照外，熊果 苷、抗坏血酸的浓度均为12.5yg/mL，对照组的实验过程制备同上，实验结果请参考附图2。
[0083] 从附图2中能够看出，空白对照组对酪氨酸酶活性的抑制率基本为0,熊果苷、抗坏 血酸及酪氨酸酶抑制物均能够对酪氨酸酶的活性起到抑制作用。对于不同浓度的酪氨酸酶 抑制物，浓度越高，对酪氨酸酶活性的抑制率越高。由此说明，本发明实施例提供的方法所 提取的酪氨酸酶抑制物能够显著抑制酪氨酸酶的活性，且对酪氨酸酶活性的抑制速率与酪 氨酸酶抑制物的浓度有关。
[0084] 2、对小鼠黑色素瘤B16细胞内黑色素含量影响的测试
[0085]根据小鼠黑色素瘤B16细胞活力的检测结果，选择对小鼠黑色素瘤B16细胞基本无 影响的酪氨酸酶抑制物浓度，所选酪氨酸酶抑制物浓度为3.125yg/mL、6.25yg/mL和12.5μ g/mL。根据小鼠黑色素瘤Β16细胞活力影响的实验方法培养小鼠黑色素瘤Β16细胞，细胞培 养后分别加入不同浓度的酪氨酸酶抑制物，72h后使用胰蛋白酶将小鼠黑色素瘤B16细胞进 行消化传代，细胞计数后离心收集细胞。在收集到的细胞内加入200此浓度为ImM的NaOH溶 液，并放入90°C的水浴中恒温培养2h，培养结束后吸取上清液，用酶联免疫检测仪在波长为 490nm处分别测定OD值，该测验值能够间接反映小鼠黑色素瘤B16细胞中黑色素的含量。
[0086] 在本次实验中，以熊果苷、抗坏血酸及空白对照作为对照组，除空白对照外，熊果 苷、抗坏血酸的浓度均为12.5yg/mL，对照组的实验过程制备同上，实验结果请参考附图3。
[0087] 从附图3中能够看出，空白对照组对黑色素生成的抑制率基本为0,熊果苷、抗坏血 酸及酪氨酸酶抑制物均能够对黑色素的生成起到抑制作用。对于不同浓度的酪氨酸酶抑制 物，浓度越高，对黑色素生成的抑制率越高。由此说明，本发明实施例提供的方法所提取的 酪氨酸酶抑制物能够显著抑制黑色素生成，且对黑色素生成的抑制速率与酪氨酸酶抑制物 的浓度有关。
[0088] 通过上述实验说明，由本发明实施例提供的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方 法所提取的酪氨酸酶抑制物能够明显抑制小鼠黑色素瘤B16细胞的活力、小鼠黑色素瘤B16 细胞内酪氨酸酶的活性及黑色素的生成。利用上述特性，酪氨酸酶抑制物能够用于制备抑 制酪氨酸酶活性的药物和化妆品，用以达到去除色斑、美白的功效。同时，对于由于产生黑 色素而发生褐变的食品，本发明实施例提供的酪氨酸酶抑制物能够用于制备食品添加剂， 以便于防止食品发生褐变。
[0089] 本领域技术人员在考虑说明书及实践这里发明的公开后，将容易想到本发明的其 它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或 者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识 或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的 权利要求指出。
[0090] 应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并 且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
【主权项】
1. 一种从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，其特征在于，所述方法包括： 摘取牡丹花瓣，洗净、沥干； 将沥干后的所述牡丹花瓣加入到浓度为75%的乙醇溶液中捣烂成浆，得到牡丹花浆 液，其中，所述牡丹花瓣与所述乙醇的质量/体积比为lg: 2-4ml; 将所述牡丹花浆液加入到浓度为75%的乙醇溶液中加热回流，得到回流液，其中，所述 牡丹花浆液与所述乙醇的体积比为1:4-6; 将所述回流液过滤得到牡丹花提取液； 将所述牡丹花提取液使用旋转蒸发仪蒸发，得到固体物质和乙醇，所述乙醇回收待用； 向所述固体物质中加入蒸馏水，50-70°C下加热溶解，得到混合物，其中，所述固体物质 与所述蒸馏水的体积比为1:2-5; 向所述混合物中加入正己烷进行萃取，收集水相萃取物，其中，所述混合物与所述正己 烷的体积比为1:1-1.5; 将所述水相萃取物进行减压浓缩，得到浓缩物； 将所述浓缩物分别用蒸馏水、浓度为40 %的乙醇溶液和浓度为70 %的乙醇溶液进行大 孔树脂柱层析，直至下柱液洗脱至无色； 所述下柱液洗脱至无色后，用浓度为90 %的乙醇溶液再次对所述浓缩物进行大孔树脂 柱层析，直至下柱液洗脱至无色，收集此步骤中的洗脱液，备用； 所述洗脱液合并、浓缩、干燥，得到酪氨酸酶抑制物。2. 根据权利要求1所述的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，其特征在于，所述加 热回流的条件为:加热温度为50-70°C，回流次数为2-3次，每次回流时间为2-4h。3. 根据权利要求1所述的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，其特征在于，所述大 孔树脂为細664^6\407即树脂。4. 根据权利要求1所述的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，其特征在于，所述洗 脱液浓缩、干燥为所述洗脱液浓缩至无醇味后低温真空干燥。5. 根据权利要求1所述的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法，其特征在于，所述牡 丹花瓣为太平红牡丹或丹凤白牡丹的花瓣。6. -种酪氨酸酶抑制物的应用，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制物按照权利要求1-5中 任意一项所述的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法制备，所述酪氨酸酶抑制物用于制 备抑制酪氨酸酶活性的药物或化妆品。7. -种酪氨酸酶抑制物的应用，其特征在于，所述酪氨酸酶抑制物按照权利要求1-5中 任意一项所述的从牡丹花中提取酪氨酸酶抑制物的方法制备，所述酪氨酸酶抑制物用于制 备防止褐变的食品添加剂。
【文档编号】A23L33/105GK106074747SQ201610621154
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月2日 公开号201610621154.1, CN 106074747 A, CN 106074747A, CN 201610621154, CN-A-106074747, CN106074747 A, CN106074747A, CN201610621154, CN201610621154.1
【发明人】高雪, 郑煦旭, 郭莉霞, 殷钟意
【申请人】重庆工商大学