利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性没食子酸的方法
【专利摘要】利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性没食子酸的方法，以没食子酸为原料，通过液态发酵技术制备焦性没食子酸。包括培养基配制、菌种培养、发酵制酶、发酵脱羧、产物分离等步骤。在发酵温度37℃、底物浓度10 mM，发酵液起始pH 6.5，发酵24 h后植物乳杆菌发酵没食子酸产焦性没食子酸收率大于80%。本发明所述微生物发酵法制备焦性没食子酸与传统法高温脱羧工艺相比，反应条件温和、污染少、得率高、对设备要求不高。
【专利说明】
利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性没食子酸的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性 没食子酸的方法。
【背景技术】
[0002] 焦性没食子酸(pyrogallol)，又称连苯三酚或焦倍酚，是一种重要的具有多种用 途的化学试剂和化工原料，广泛用于医药合成、纺织印染、食品、化妆品、农药及电子产品等 领域。此外，它还可作为显影剂、热敏剂、高分子材料的助剂以及化学分析试剂等。在工业 上，生产焦性没食子酸的主要原料是没食子酸。在我国制备焦性没食子酸传统工艺是对没 食子酸加热高温脱羧;该工艺需要在高温下进行人工翻炒，不仅劳动强度大，产品得率较 低。
[0003] 利用生物体系(各种细胞和酶)作催化剂实现有机物的生物转化和生物合成，是当 今合成化学的研究热点。微生物转化是某种微生物将一种物质(底物)转化成为另一种物质 (产物)的过程，由其所产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的化学 反应。相比化学法，生物催化剂进行反应，具有反应条件温和、副反应少、成本低、后处理简 单、污染少和专一性高以及环境友好等优点，成为合成光学纯的医药、农药中间体和其它一 些复杂功能化合物的环境友好绿色化学过程。对环境及社会发展，对绿色化工产业的建立 都有极其重要的应用意义和前景。因此，开发研究高效且环境友好的绿色生物催化制取焦 性没食子酸的过程，具有重要的理论和应用价值。
[0004] 在微生物体内，没食子酸在没食子酸脱羧酶(gallate decarboxylase，GAD，EC 4.1.1.59)的作用下，生成焦性没食子酸。目前国内利用GAD法制备焦性没食子酸处于起步 阶段。将高效脱羧的菌株与培养工艺进行匹配，提高产品收率是本发明的目的。
【发明内容】
[0006] 解决的技术问题:本发明的目的在于提供一种利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备 焦性没食子酸的方法。
[0007] 技术方案:一种利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性没食子酸的方法，包括如 下步骤:菌种培养:配制试管斜面保藏培养基和种子培养基，将降解没食子酸的菌株进行划 线分离，挑选生长旺盛的典型菌落在试管斜面保藏培养基上培养;将培养好的斜面菌种以 无菌操作取两环，转接到装有种子培养基的摇瓶中，摇床培养，培养温度37°C，转速180r/ min，培养时间10~20h;发酵脱羧:配制发酵培养基，将培养好的种子液按照5 %接种量，转 接到发酵培养基中，摇床发酵;发酵条件:转速180r/min，底物浓度5-30mM，发酵温度30-40 °C、发酵液起始pH值5.0-7.0，发酵时间20-28h;产物分离:将含有焦性没食子酸的发酵液于 1 OOOOr/min条件下离心1 Omin，取上清液，加入上清液1 /2体积的乙酸乙酯，充分混匀后萃取 两次，乙酸乙酯相于40°C下经减压蒸发除去溶剂得到焦性没食子酸。
[0008] 上述降解没食子酸的菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
[0009] 上述试管斜面保藏培养基的配制:称取酵母粉10.0g，葡萄糖15.0g、碳酸钙15.0g、 吐温80 l.Og、琼脂20.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°〇 下灭菌20min，冷却后即为试管保藏培养基。
[0010] 上述种子培养基的配制:称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物10.0g、葡萄 糖20.0g、吐温80 l.Og、柠檬酸胺2.0g、醋酸钠5.0g、碳酸钙20.0g、硫酸镁O.lg、硫酸锰 0.05g、磷酸氢二钾2.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°〇 下灭菌15min，冷却后为种子培养基。
[0011] 上述发酵培养基的配制:称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物5.0g、葡萄 糖20.0g、吐温80 l.Og、柠檬酸胺2.0g、醋酸钠5.0g、硫酸镁O.lg、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾 2.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°(：下灭菌1511^11，冷却 后为发酵培养基。
[0012] 有益效果:本发明利用植物乳杆菌发酵没食子酸降解生成焦性没食子酸。在发酵 液起始pH值6.5，没食子酸底物浓度10mM，发酵温度37 °C，发酵时间24h条件下，产焦性没食 子酸的得率大于80%。本发明所述微生物发酵法制备焦性没食子酸与传统法高温脱羧工艺 相比，采用微生物(酶)作为催化剂，实验条件温和、污染少、得率高、对设备要求不高。
【附图说明】
[0013] 图1为植物乳杆菌生长曲线及不同发酵孵育时间没食子酸脱羧酶(GAD)活性的变 化图。
【具体实施方式】
[0014] 参考下列实施例将更容易、更全面地理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明， 而不是以任何方式限制本发明。
[0015] 实施例1:发酵制备焦性没食子酸
[0016] (1)培养基的配制：
[0017] a)试管斜面保藏培养基的配制:称取酵母粉10.0g、葡萄糖15.0g、碳酸钙15.0g、吐 温80 l.Og、琼脂20.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°(：下 灭菌20min，冷却后即为试管保藏培养基；
[0018] b)种子培养基的配制:称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物10.0g、葡萄糖 20.08、 吐温80 1.(^、柠檬酸胺2.(^、醋酸钠5.(^、碳酸钙20.(^、硫酸镁0.18、硫酸锰0.058、 磷酸氢二钾2.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0,在121°C下灭菌 15min，冷却后为种子培养基；
[0019] c)发酵培养基的配制:称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸提物5.0g、葡萄糖 20.08、 吐温80 1.(^、柠檬酸胺2.(^、醋酸钠5.(^、硫酸镁0.18、硫酸锰0.058、磷酸氢二钾 2.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°(：下灭菌1511^11，冷却 后为发酵培养基；
[0020] (2)利用降解没食子酸的植物乳杆菌菌株进行划线分离，挑选生长旺盛的典型菌 落经斜面培养基反复划线纯化，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到装有100mL 种子培养基的250mL摇瓶中，摇床培养(温度:37°C ;转速:180r/min)。
[0021] (3)将培养好的种子液按照5%接种量，转接到发酵培养基中，摇床发酵。发酵条 件:没食子酸底物浓度为10mM，发酵液起始pH值6.5，转速180r/min，发酵温度37°C，发酵时 间 24h。
[0022] (4)将含有焦性没食子酸的发酵液于lOOOOr/min条件下离心10min，取上清液，加 入上清液1/2体积的乙酸乙酯，充分混匀后萃取两次，乙酸乙酯相于40°C下经减压蒸发除去 溶剂得到焦性没食子酸，采用高效液相色谱(HPLC)法测定焦性没食子酸的含量，用焦性没 食子酸标准品绘制标准曲线，计算焦性没食子酸的收率，植物乳杆菌发酵没食子酸产焦性 没食子酸收率为81.6%。
[0023]实施例2:没食子酸脱羧酶(GAD)活性的测定
[0024]按照实施例1配制斜面培养基、种子培养基和发酵培养基，对植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)进行培养，采用香兰素 (vanillin)检测方法，对GAD活性进行 分光光度法检测。
[0025]通过检测植物乳杆菌生长曲线（OD600菌体浓度)及不同发酵孵育时间没食子酸脱 羧酶(GAD)活性的变化，见附图1，可以发现，随着发酵孵育时间的增加，植物乳杆菌0D_菌 体浓度和GAD酶活性菌呈现出升高的趋势;但在发酵后的20h，植物乳杆菌0D 6QQ菌体浓度和 GAD酶活性菌呈现略微下降的趋势，可能与培养基中营养的消耗有关。植物乳杆菌生长发酵 孵育时间20h，0D6Q()菌体浓度1.6，GAD活性0.3U每分钟每毫克蛋白。
[0026] 实施例3:发酵制备焦性没食子酸(发酵条件变化）
[0027] 培养基配制和发酵制备焦性没食子酸的步骤同实施例1，改变发酵条件为：转速 180r/min，没食子酸底物浓度为60mM，发酵温度28 °C，发酵液起始pH值7.0，发酵时间20h，植 物乳杆菌发酵没食子酸产焦性没食子酸收率为56.6 %。
[0028] 实施例4:发酵制备焦性没食子酸(培养基变化）
[0029] (1)培养基的配制
[0030] a)试管斜面保藏培养基的配制：同实施例1;
[0031] b)种子培养基的配制：称取蛋白胨5. Og、牛肉膏3. Og、氯化钠15. Og，在1L容量瓶 中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至7.0，在121°C下灭菌15min，冷却后为种子培养基；
[0032] c)发酵培养基的配制：称取蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、酵母浸提物10.0g，氯化钠 15.0g、在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°(：下灭菌1511^11，冷却 后为发酵培养基；
[0033] (2)按照实施例1中（2)~(4)的方法，进行菌种培养、发酵、分离等步骤得到焦性没 食子酸，植物乳杆菌发酵没食子酸产焦性没食子酸收率为50.7 %。
[0034] 实施例5:发酵制备焦性没食子酸(培养基和发酵温度变化）
[0035] (1)培养基的配制：
[0036] a)试管斜面保藏培养基的配制:称取酵母粉10.0g，葡萄糖15.0g、碳酸钙15.0g、吐 温80 l.Og、琼脂20.0g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°(：下 灭菌20min，冷却后即为试管保藏培养基；
[0037] b)种子培养基的配制：称取蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠15.0g，在1L容量瓶 中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至7.0，在121°C下灭菌15min，冷却后为种子培养基；
[0038] c)发酵培养基的配制:称取酵母浸提物l.Og、磷酸氢二钾2.0g、磷酸二氢钾l.Og、 硫酸镁〇 . 5g，在1L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°C下灭菌 15min，冷却后为发酵培养基；
[0039] (2)利用降解没食子酸的植物乳杆菌菌株进行划线分离，挑选生长旺盛的典型菌 落经斜面培养基反复划线纯化，将培养好的斜面菌种以无菌操作取两环，转接到装有100mL 种子培养基的250mL摇瓶中，摇床培养(温度:37°C ;转速:180r/min)。
[0040] (3)将培养好的种子液按照5%接种量，转接到发酵培养基中，摇床发酵。发酵条 件:转速180r/min，没食子酸底物浓度为10mM，发酵温度30 °C，发酵液起始pH值6.5，发酵时 间 24h;
[00411 (4)将含有焦性没食子酸的发酵液于lOOOOr/min条件下离心10min，取上清液，加 入上清液1/2体积的乙酸乙酯，充分混匀后萃取两次，乙酸乙酯相于40°C下经减压蒸发除去 溶剂得到焦性没食子酸，采用高效液相色谱(HPLC)法测定焦性没食子酸的含量，用焦性没 食子酸标准品绘制标准曲线，计算焦性没食子酸的收率，植物乳杆菌发酵没食子酸产焦性 没食子酸收率为37.7%。
【主权项】
1. 利用植物乳杆菌发酵没食子酸制备焦性没食子酸的方法，其特征在于，包括如下步 骤： (1) 菌种培养:配制试管斜面保藏培养基和种子培养基，将降解没食子酸的菌株进行划 线分离，挑选生长旺盛的典型菌落在试管斜面保藏培养基上培养;将培养好的斜面菌种以 无菌操作取两环，转接到装有种子培养基的摇瓶中，摇床培养，培养温度37°C，转速180 r/ min，培养时间10~20 h; (2) 发酵脱羧:配制发酵培养基，将培养好的种子液按照5%接种量，转接到发酵培养基 中，摇床发酵;发酵条件:转速180 r/min，底物浓度5-30 mM，发酵温度30-40 °C、发酵液起始 pH值6.0-7.0，发酵时间 20-28 h; (3) 产物分离:将含有焦性没食子酸的发酵液于10000 r/min条件下离心10 min，取上 清液，加入上清液1/2体积的乙酸乙酯，充分混匀后萃取两次，乙酸乙酯相于40°C下经减压 蒸发除去溶剂得到焦性没食子酸。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)所述降解没食子酸的菌株为植物乳 Lactobacillus plantarum) 〇3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述试管斜面保藏培养基的配制:称取酵母 粉10.0 g，葡萄糖15.0 g、碳酸钙15.0 g、吐温80 1.0 g、琼脂20.0 g，在1 L容量瓶中，加 蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0,在121°C下灭菌20 min，冷却后即为试管保藏培养 基。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基的配制：称取蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸提物10.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 g、梓檬酸胺2.0 g、醋酸 钠5.0 g、碳酸钙20.0 g、硫酸镁0.1 g、硫酸锰0.05 g、磷酸氢二钾2.0 g，在1 L容量瓶中， 加蒸馏水定容至刻度，pH值调至6.5-7.0，在121°C下灭菌15 min，冷却后为种子培养基。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基的配制：称取蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母浸提物5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐温80 1.0 g、梓檬酸胺2.0 g、醋酸钠 5.0 g、硫酸镁0.1 g、硫酸锰0.05 g、磷酸氢二钾2.0 g，在1 L容量瓶中，加蒸馏水定容至刻 度，pH值调至6.5-7.0,在121°C下灭菌15 min，冷却后为发酵培养基。
【文档编号】C12P7/22GK105969811SQ201610528042
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】汪咏梅, 张亮亮, 徐曼, 徐晟 , 胡新宇
【申请人】中国林业科学研究院林产化学工业研究所