一种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA活性的方法
【专利摘要】本发明提供了一种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA的方法。本发明根据miRNA成熟体经化学修饰和特殊标记设计的miRNA模拟物agomir和高效阻断剂antagomir，采用细胞转染剂Lipofectamine 2000 reagent将二者导入龙眼胚性愈伤组织细胞，实现在龙眼活体中特异性增强或抑制目标miRNA活性，同时进行miRNA表达体系优化和作用效果持续时间鉴定。该方法具有操作简单快速、干扰效果显著、稳定持久等优点，避免了现有方法依赖转基因技术因而实验周期长、费时费力等缺点，本发明为龙眼愈伤组织miRNA研究提供了一种高效便捷的方法，对miRNA表达调控和功能鉴定具有重要意义。
【专利说明】
一种増强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中m i RNA活性的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA活性的方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNA(miRNA)是一种重要的非编码小分子RNA，通常18-25nt ^iRNA作用方式主要通过在转录水平上介导靶基因甲基化，或在转录后水平上进行靶mRNA剪切或抑制翻译，从而实现机体调控功能。目前，大量研究报道表明，miRNA在植物成花、衰老、抗逆、抗病等生长发育过程中均参与调控作用。miRNA传统研究方法主要通过分离相关miRNA前体构建表达载体进行转化。近年来，通过miRNA成熟体人工合成模拟物和阻断剂进行目标miRNA增强和抑制表达逐渐被应用，而这一技术主要在动物细胞中进行研究，植物中相关报道较少(Zha et al，2011;Xu et al，2013;Wang et al，2012)。
[0003]胚胎发育的好坏是植物能否正常生长的关键，尤其在果树等经济作物生产过程中，胚胎发育能够影响果实的产量和品质。然而，胚胎发育早期研究存在取样困难，材料一致性差，发育同步化水平低等不利因素，对其研究往往存在较大难度。而植物体细胞胚胎发生(体胚发生)通过人为同步化调控发育进程，是研究植物早期胚胎发生理想的替代系统。植物体胚发生起源于胚性愈伤组织，对该阶段胚性培养物miRNA进行研究对于揭示miRNA在植物体胚发生过程中的调控功能具有重要意义。然而由于植物胚性愈伤组织的特殊性，其miRNA转化常常存在诸多难度，例如，龙眼属于顽拗型植物，且其胚性愈伤组织为内起源性，采用传统遗传转化手段无法实现。因此，寻找新的方法解决这一难题成为后续深入研究的关键，然而目前这方面相关研究尚未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明针对龙眼等植物胚性愈伤组织miRNA功能研究的技术空白，提供了一种增强和抑制表达植物胚性愈伤组织细胞中miRNA的方法。
[0005]—种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA活性的方法，通过以下步骤实现:利用龙眼胚性愈伤组织悬浮细胞培养体系大量增殖并筛选松散且生长状态良好愈伤组织，采用小型培养容器分别加入胚性愈伤组织细胞、培养基、细胞转染剂和miRNA模拟体或miRNA高效阻断剂，实现特异增强或抑制目标miRNA在愈伤组织细胞中的表达活性。
[0006]所述的miRNA模拟体为反义链3，端进行胆固醇修饰，5，端进行两个硫代骨架修饰，3 ’端四个硫代骨架修饰全链甲氧基修饰;所述miRNA高效阻断剂为3 ’端进行胆固醇修饰，5 ’端两个硫代骨架修饰，3 ’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。
[0007]所述的龙眼胚性愈伤组织为细胞悬浮培养获得的质地松散、生长状态良好且细胞活力旺盛的细胞系。
[0008]该方法具体按以下步骤实施:
一、根据目标miRNA成熟体序列设计并合成经甲基化修饰、硫代修饰和胆固醇修饰的miRNA模拟体(agomir)和miRNA高效阻断剂(antagomir)；
二、采用液体悬浮培养方式增殖和筛选生长状态良好、细胞活力旺盛的龙眼胚性愈伤组织细胞；
三、在小型细胞培养容器中加入细胞转染剂、miRNA模拟物或miRNA高效阻断剂、龙眼胚性愈伤组织细胞，三者比例为为1.0: 30: 0.15(yM:yL:g)，并添加胚性愈伤组织液体培养基至终体积500 yL;所述的液体培养基为MS培养基+2，4-D 1.0 mg/L。
[0009]四、将培养容器在25 °C、115rpm/min条件下处理时间为24h。
[0010]本发明经过多次试验重复发现，采用本方法可以在不影响龙眼胚性愈伤组织生长的情况下高效进行miRNA增强和抑制表达，实现龙眼胚性愈伤组织及体胚发生过程中的miRNA功能研究。
[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:
1.本发明操作简便，作用效果显著，且试验周期短，避免了传统方法试验繁琐、费时费力的缺点。
[0012]2.本发明采用细胞脂质体型转染试剂Lipofectamin2000介导miRNA成熟体模拟物和miRNA高效阻断剂导入龙眼胚性愈伤组织细胞，而不受品系或物种种类局限，应用范围广，为不同物种胚性愈伤组织或体胚发生过程中miRNA功能研究提供方法。
[0013]3.本发明试验效率高，采用miRNA成熟体模拟物增强时，短时间内增强最高时可达到常规的1000倍以上，处理完1d后增强水平仍能达到常规的10倍以上。
【附图说明】
[0014]图1是以dlo-miR393为例，常规处理下和30yL转染剂介导下，分别添加Ι.ΟμΜ dlo-miR393_agomir和dlo-miR393_antagomir处理24h后，龙眼胚性愈伤组织中miR393增强和抑制表达情况。所用miR393 qPCR引物为 CCAAAGGGATCGCATTGAT。
[0015]图2是以dlo-miR393-agomir浓度、转染剂添加量以及龙眼胚性愈伤组织细胞密度不同水平下，龙眼胚性愈伤组织中miR393的表达水平。
[0016]图3是筛选获得最优表达体系基础上，dlo-miR393-agomir处理后ld、3d、5d、7d和1d内龙眼胚性愈伤组织中miR393的表达水平。
【具体实施方式】
[0017]一下结合具体实施例和附图进一步对本发明进行详细说明，但具体实施例并不在任何意义上构成对本发明保护范围的限制。
[0018]具体实施步骤如下:
miRNA成熟体模拟物与miRNA高效阻断剂设计和合成
从miRbase中查找并获取物种目标miRNA成熟体序列，送上海吉玛制药技术有限公司合成相应寡核苷酸(miRNA-agomir)和反义寡核苷酸(miRNA-antagomir )，并分别进行甲基化修饰、硫代修饰和胆固醇修饰。
[0019]龙眼胚性愈伤组织增殖培养和筛选
将龙眼胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中培养1-2代，筛选质地松散，色泽鲜艳且生长状态良好的悬浮培养细胞系。
[0020]miRNA增强和抑制表达
挑选生长良好的龙眼胚性愈伤组织，置于经高压灭菌的滤纸上去除多余的液体培养基。随后取2个经高压灭菌的1.5mL离心管，分别加入细胞转染剂和愈伤组织液体培养基33μL和92yL，混勾后形成混合液，室温下静置5min。取25yL miRNA-agomir和miRNA-antagomir分别加入2个经高压灭菌的1mL三角瓶中，再分别加入10yL胚性愈伤组织液体培养基，混匀后将上述混合液加入到该三角瓶中，进一步重复混匀静置20min。随后加入0.15g胚性愈伤组织，并再次加入胚性愈伤组织250yL。同时设置不添加miRNA-agomir和miRNA-antagomir的对照组。25°C，115rpm/min,黑暗条件下处理24h。
[0021 ] miRNA表达体系优化
采用L9(34)正交表分别对miRNA表达体系进行优化，miRNA-agomir浓度分别为0.5μΜ、
1.ΟμΜ和1.5μΜ，细胞转染剂体积分别为15yL、30yL和45yL，细胞密度分别为0.05g、0.1Og和0.15g。采用上述方法进行龙眼胚性愈伤组织处理。
[0022]miRNA表达时间验证
采用最优表达体系处理胚性愈伤组织，处理完后转移到培养基中，分别于ld、3d、5d、7d和1d后收集龙眼胚性愈伤组织，采用滤纸吸干多余液体培养基，用液氮速冻并进行超低温保存。
[0023]龙眼胚性愈伤组织总RNA提取
(I)试验所需要的10yL、200yL和ImL枪头以及1.5毫升离心管均为无RNA酶耗材，且使用前均采用高压锅进行121°C、1lKPa处理20min;提RNA所用研钵采用工业酒精灼烧，室温下冷却备用。
[0024](2)超低温冰箱中快速取出处理后的胚性愈伤组织，于研钵中采用液氮研磨成匀浆，转移至1.5mL专用离心管中，加ImL Tripure细胞裂解液，颠倒混匀后静置5min。
[0025](3)加200yL氯仿，剧烈震荡15s后静置lOmin;台式高速冷冻离心机4°C，12000rpm/min离心15min，吸取上清液转移到新离心管中。
[0026](4)加入500yL异丙醇，颠倒混匀后静置1min;台式高速冷冻离心机4°C，12000rpm/min离心15min，随后去除上清液。
[0027](5)加入75%乙醇800yL，台式高速冷冻离心机4°C，8000rpm/min离心2min，去除上清液。
[0028](6)风干沉淀，加入无RNA酶双蒸水50yL溶解沉淀。
[0029](7)采用1.5%琼脂糖进行凝胶电泳检测愈伤组织RNA的纯度，并通过超微量紫外光分光光度计测定RNA的浓度。
[0030]7.cDNA逆转录
米用miRcute miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit进行miRNA定量cDNA逆转录，具体操作步骤如下:
miRNA 3’末端加PolyA，体系如下:
总RNA 500ng；
E.coil poly(A) Polymerase 0.2 yL；
1Xpoly(A) Polymerase Buffer 1.0 yL；
5 X rATP Solut1n 2 yL； RNase-Free ddH20补足至终体积10 uL。随后低速离心混匀，置于37 °C水浴锅中温浴60mino
[0031]Poly(A)修饰的miRNA逆转录反应，体系如下:
Poly(A)反应液 I μ?^
1XRT Primer IuL；
1XRT Buffer IuL；
Super Pure dNTPs 0.5uL；
RNasin 0.5uL；
Quant RTase 0.25uL；
RNase-Free ddH20补足至终体积10 uL。随后低速离心混匀，置于37 °C水浴锅中温浴60mino
[0032]miRNA表达水平qPCR检测
根据miRNA成熟体序列设计miRNA qPCR引物，送北京六合华大基因科技股份有限公司合，miR393 qPCR引物为 CCAAAGGGATCGCATTGAT。随后采用LightCycler480 和miRcutemiRNA qPCR Detec1n Kit(SYBR Green)试剂盒进行qPCR分析，反应体系和反应程序如下:qPCR反应体系:
2XmiRcute miRNA PremixCwith SYBR&ROX) 1yL；
Forward Primer 0.8yL；
Reverse Primer 0.4yL；
模板IyL;
RNase-Free ddifeO 7.8yL。
[0033]PCR反应程序:
95 °C, 30s；
95°C，5s，TM，15s，72°C，1s，重复该步骤40个循环；
95°C，5s，60°C，60s，97°C;
50。。，30s ο
[0034]每个样品进行3次重复，并采用excel进行miRNA相对表达量分析。
[0035]采用上述步骤进行龙眼dlo-miR393进行龙眼胚性愈伤组织中增强和抑制表达，其寡核苷酸序列分别为miRNA-agomir: UUCCAAAGGGAUCGCAUUGAU和miRNA-antagomir:AUCAAUGCGAUCCCUUUGGAA;结果处理24h后，增强表达处理组比对照组dlo-miR393表达量提高138倍，而抑制表达处理组dlo-miR393表达量约为对照组1/20(图1);优化处理后，增强处理组最高时该miRNA表达量为对照组的551倍(图2)，且处理后3d时表达量提高至1117倍，持续1d时表达量仍为对照组12倍(图3);该方法增强效率及抑制效率非常理想。
[0036]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.一种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA活性的方法，其特征在于:通过以下步骤实现:利用龙眼胚性愈伤组织悬浮细胞培养体系大量增殖并筛选松散且生长状态良好愈伤组织，采用小型培养容器分别加入胚性愈伤组织细胞、培养基、细胞转染剂和miRNA模拟物或miRNA高效阻断剂，实现特异增强或抑制目标miRNA在愈伤组织细胞中的表达活性。2.根据权利要求1所述一种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA活性的方法，其特征在于:所述的miRNA模拟物为反义链3，端进行胆固醇修饰，5，端进行两个硫代骨架修饰，3’端四个硫代骨架修饰全链甲氧基修饰;所述miRNA高效阻断剂为3’端进行胆固醇修饰，5 ’端两个硫代骨架修饰，3 ’端四个硫代骨架修饰，全链甲氧基修饰。3.根据权利要求2所述一种增强和抑制表达龙眼胚性愈伤组织中miRNA活性的方法，其特征在于:所述的 miRNA 模拟物为 miRNA-agomir:UUCCAAAGGGAUCGCAUUGAU;所述 miRNA 高效阻断剂为 miRNA-antagomir:AUCAAUGCGAUCCCUUUGGAA。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的龙眼胚性愈伤组织为细胞悬浮培养获得的质地松散、生长状态良好且细胞活力旺盛的细胞系。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所添加细胞转染剂:miRNA模拟物或miRNA高效阻断剂:龙眼胚性愈伤组织细胞比例为1.ΟμΜ: 30yL: 0.15 g。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:采用小型愈伤组织细胞培养容器，在添加细胞转染剂、miRNA模拟物或miRNA高效阻断剂、龙眼胚性愈伤组织细胞的基础上加入液体培养基至终体积500yL，之后将其于25°C、115rpm/min条件下处理时间为24h。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述的液体培养基为MS+2，4-D1.0 mg/L。
【文档编号】C12N15/88GK105969806SQ201610342716
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】林玉玲, 赖瑞联, 赖钟雄, 程春振, 刘生财, 陈裕坤, 张梓浩
【申请人】福建农林大学